聚吡咯修飾的金納米棒對腫瘤的光學相干層析成像的影響

於劍鋒，郭周義，金 梅，王新鵬，鐘會清，劉智明

華南師范大學生物光子學研究院，激光生命科學教育部重點實驗室和

中醫(yī)藥與光子技術國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室，廣東 廣州 510631

聚吡咯修飾的金納米棒對腫瘤的光學相干層析成像的影響

於劍鋒，郭周義，金 梅，王新鵬，鐘會清，劉智明*

華南師范大學生物光子學研究院，激光生命科學教育部重點實驗室和

中醫(yī)藥與光子技術國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室，廣東 廣州 510631

聚吡咯(PPy)制備簡單、生物相容性好，且在近紅外(NIR)光譜范圍內(nèi)有很強的吸收，可作為一種良好的光熱治療試劑； 同時，其NIR光吸收性質也可用于增強光學相干層析成像(OCT)的對比效果。因此，采用PPy對傳統(tǒng)的OCT對比試劑——金納米棒(GNR)進行表面修飾，有望獲得對比效果更好且生物毒性較小的新型OCT對比試劑。選用吡咯為起始原料，在GNR表面進行一步簡單的氧化聚合反應即可制備得到PPy修飾的金納米棒(GNR-PPy)。利用紫外-可見吸收光譜，拉曼光譜和透射電子顯微鏡對制備的樣品進行了分析和表征。構建小鼠荷瘤模型，以研究GNR-PPy對腫瘤OCT圖像對比度的增強效果。采用中心波長為840 nm的OCT系統(tǒng)對注射了納米粒子的腫瘤區(qū)域進行OCT成像。結果表明，腫瘤組織注射了GNR-PPy后，OCT信號衰減非常明顯； 與注射了GNR的OCT圖像相比，840 nm光在GNR-PPy的OCT圖像中的穿透深度明顯更低。從OCT圖像中抽提出一維的衰減曲線對OCT圖像進行定量分析，發(fā)現(xiàn)注射有GNR-PPy腫瘤組織的OCT信號衰減系數(shù)明顯高于注射了GNR的組織。表明，相對于GNR，GNR-PPy具有更好的OCT信號對比效果，這在增強腫瘤成像效果方面具有潛在應用價值。

光學相干層析成像； 聚吡咯； 金納米棒； 對比試劑

引 言

光學相干層析成像(OCT)是一種迅速發(fā)展的光學成像技術，它可以提供實時的，高分辨率的，無創(chuàng)的生物組織的橫斷截面成像[1]。它的原理類似于B超成像，但它是用光成像而不是聲成像。OCT圖像的產(chǎn)生是基于光的干涉，主要是測量來自不同深度的生物組織的背向散射光強度。根據(jù)成像理論的不同，OCT主要分為兩類： 時域OCT和頻域OCT。與時域OCT相比，頻域OCT不需要進行深度掃描(A掃描)，僅需要執(zhí)行橫向掃描，而深度方向的全部信息，則通過采集樣品臂和參考臂的相干光譜并作傅里葉變換就能得到，這樣極大減少了圖像采集的時間。OCT已被廣泛用于眼科、消化科、皮膚科、心血管科等早期上皮性腫瘤的檢測[2-3]。

盡管OCT在生物組織成像方面有很多的優(yōu)勢，但是較差的圖像對比度經(jīng)常會影響OCT的檢測靈敏度。因此，在過去的幾年，為了提高癌癥檢測的靈敏度和特異性，研究出了許多不同的OCT對比劑。例如，金納米粒子，氧化鐵納米粒子這類散射對比劑是通過增強背向散射信號來增強OCT圖像對比度[4]。而金納米棒(GNR)，吲哚菁綠，金納米籠在近紅外光譜范圍內(nèi)有很強的吸收[5-6]，并且光譜范圍可以覆蓋到OCT光源的激發(fā)波長，因此可以增強非正常組織的光譜特征。

聚吡咯(polypyrrole, PPy)，一種有機導電聚合物，首次發(fā)現(xiàn)在20世紀60年代的早期。因為PPy在近紅外光譜范圍內(nèi)有很強的吸收性能，在近紅外光照射下，它具有很強的光熱轉換效率； 同時，在體研究證實PPy具有很好的生物相容性。所以，PPy是一種非常有前景的光熱治療劑[7]。它也可以作為一種很好的OCT吸收對比劑[8]。相對于其他類型的對比試劑，PPy的成本非常低、生物相容性好，另外制備起來也很容易。因此，我們推測，PPy以及GNR在近紅外光譜范圍內(nèi)都有很強的吸收，二者的復合物有一種協(xié)同效應，可以比GNR產(chǎn)生更好的OCT成像對比效果； 同時，PPy的修飾亦可屏蔽GNR的生物毒性。為了驗證這一假設，制備了PPy修飾的GNR，GNR-PPy，并分別在小鼠腫瘤內(nèi)進行OCT成像，并對其進行定量分析。

1 實驗部分

1.1 GNR的制備

采用由El-Sayed小組研發(fā)的在水溶液中的無種生長法[9]，并且作了微小的改動。25 mL的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB, 0.2 mol·L-1)加入到氯金酸(HAuCl4, 25 mL, 1 mmol·L-1)水溶液中，在室溫下輕微攪拌。首先，加入硝酸銀(AgNO3, 0.9 mL, 4 mmol·L-1)和鹽酸(HCl, 50 μL，37%)。其次，350 μL的抗壞血酸(78.8 mmol·L-1)加入到混合溶液中，此時，溶液迅速由深黃色變?yōu)闊o色。然后迅速把75 μL的冰浴的硼氫化鈉(NaBH4, 0.01 mol·L-1)加入到溶液中。最后把溶液轉到28 ℃的恒溫水浴缸中過夜生長。最后的產(chǎn)物離心三次(10 000 r·min-1, 30 min)，重懸在25 mL的去離子水中。

1.2 GNR-PPy的制備

將10 mL GNR溶液，4 mL, 40 mmol·L-1的十二烷基硫酸鈉(SDS)，40 μL吡咯溶液(1%), 混合并用手輕搖，混合液靜置3小時。接著加入氯化鐵溶液(100 μL, 0.1 mol·L-1)，攪拌10 s，將溶液放置在搖床上，輕搖24 h。最后的產(chǎn)物離心三次(10 000 ·min-1, 30 min), 重懸在5 mL去離子水中，放在4 ℃的環(huán)境中儲存。

1.3 表征

制備的樣品的光學性質用紫外吸收光譜儀(UV-3200S分光光度計，Mapada儀器，中國上海)進行測定。拉曼光譜由激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(InVia, 英國雷尼紹公司)進行采集。激發(fā)波長為785 nm，采用20倍的物鏡聚焦激光束。在采集制備的樣品的拉曼光譜前，對硅的拉曼譜峰(520 cm-1)的強度進行歸一校準。采集拉曼光譜均在同一條件下進行。測得的拉曼光譜利用Vancouver Raman Algorithm軟件[10]去基底、平滑，再用origin軟件進行作圖。樣品的外形和尺寸用透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100HR，日本電子公司)在200 kV下進行表征。

1.4 小鼠乳腺腫瘤OCT成像檢測

雌性Balb/c小鼠(7～8周)購自中國南方醫(yī)科大學實驗動物中心，所有實驗操作均遵從華南師范大學動物倫理委員會的規(guī)定。腫瘤種植前24 h先對小鼠進行背部脫毛處理。4T1乳腺癌細胞使用加有雙抗及10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱中(5% CO2，37 ℃)。獲得足夠數(shù)量的細胞后，用胰酶對細胞進行消化、離心，重懸于PBS中。取100 μL細胞重懸液皮下注射到小鼠背部區(qū)域。當腫瘤尺寸長到接近300 mm3，對小鼠腫瘤進行OCT成像實驗。OCT系統(tǒng)的光源中心波長為840 nm，光譜寬度為50 nm，它是基于光纖的邁克爾遜干涉儀包括光源，參考臂，樣品臂，控制軟件等模塊。軸向分辨率，空氣中10 μm，組織中5.8 μm。生物組織的折射率設為1.4[11]，通過測定兩塊玻片的OCT圖像，根據(jù)折射率，光學厚度和實際厚度的關系，確定在組織的OCT圖像中，平均每微米占有0.36個像素點。

將小鼠分為3組，在腫瘤部位分別注射100 μL的磷酸緩沖液(作為對照組)，100 μL的GNR溶液，100 μL的GNR-PPy溶液。OCT圖像在注射6小時后開始采集，每個腫瘤采集4個點。在檢測之前，先剪開腫瘤表面的皮膚，以便OCT掃描。OCT圖像用matlab程序進行處理。不考慮多次散射，光穿透組織基本符合朗伯比爾定律。OCT信號擬合衰減式(1)為

(1)

其中y表示OCT信號強度，x代表光的穿透深度，μ表示衰減系數(shù)。

2 結果與討論

2.1 GNR以及GNR-PPy的表征

圖1為GNR和GNR-PPy的TEM圖，其中圖1(a)為GNR，圖中顯示制備的納米粒子呈現(xiàn)棒狀，只有少許的球狀顆粒，并且大小比較均一，長度在50 nm左右，分布也比較均勻。從圖1(b)可以看出，在GNR表面覆蓋了一層PPy膜，表明GNR-PPy成功制備。

圖1 GNR(a)和GNR-PPy(b)的TEM電鏡圖

圖2中曲線a是GNR的UV-Vis吸收譜，可見GNR的特征性橫向及縱向SPR峰分別處于520和819 nm。譜線b為GNR-PPy的吸收譜，與GNR的吸收譜峰類似，但在NIR區(qū)域的峰值有所減弱且變寬，同時有細微的紅移。

圖2 GNR a和GNR-PPy b的紫外可見吸收光譜

圖3 GNR a和GNR-PPy b的拉曼光譜

2.2 小鼠腫瘤OCT成像

注射PBS，GNR溶液，GNR-PPy溶液6 h后小鼠腫瘤的OCT成像結果可見圖4。為了更好的對比，這些OCT圖像經(jīng)過了剪切處理，選取腫瘤表面比較平坦的部分。從圖中可以看出，OCT信號對腫瘤的光強明顯不同。相比較于圖4(a)，圖4(b)和圖4(c)的光穿透深度都明顯減小，表明GNR和GNR-PPy都對腫瘤的光吸收產(chǎn)生了影響。并且圖4c比圖4(b)的光穿透深度減小的更多，這說明GNR-PPy使腫瘤產(chǎn)生了更強的吸收特性。這主要是因為兩種納米粒子在近紅外光譜范圍內(nèi)有很強的吸收這一光學性質。圖5a，b，c分別為相對應的一維的OCT信號強度-深度曲線。從圖中可以看出，OCT信號衰減最快的為圖5c，次之是圖5b。衰減最慢的是圖5c。這和圖4中OCT圖像的結果相互印證。

圖4 小鼠腫瘤注射PBS (a)，GNR(b)和

圖5 一維的OCT信號-深度圖對應于小鼠腫瘤注射磷酸緩沖液a, GNRb和GNR-PPyc后的OCT圖像

Fig.5 One dimension OCT signals as the function of depth corresponding to the OCT images of tumors in mice with with PBSa, with GNRsb, and GNR-PPyc

圖6 (a) OCT信號隨深度增加而衰減的曲線; (b)小鼠腫瘤注射GNR(第一組)和注射GNR-PPy(第二組)的衰減系數(shù)圖

1： 小鼠腫瘤注射GNR的OCT信號圖； 2： 小鼠腫瘤注射GNR-PPy的OCT信號圖； 3： 曲線1對應的擬合曲線；(4): 曲線2對應的擬合曲線

Fig.6 Attenuation curves of OCT signal with increase in depth (a)； (b) The attenuation coefficients of tumor in mice with GNR (first group) and GNR-PPy (second group) respectively

1: Tumors in mice with GNRs； 2: Tumors in mice with GNR-PPy； 3: Fitting curve for curve 1； 4: Fitting curve for curve 2

為了進一步研究GNR-PPy的OCT對比效果，對腫瘤的OCT信號衰減系數(shù)進行了量化分析。采用方程(1)對小鼠腫瘤的OCT信號進行非線性擬合，擬合的結果見圖6(a)。曲線1和2為注射GNR溶液和GNR-PPy溶液的小鼠腫瘤的OCT信號曲線，3和4分別是它們對應的擬合曲線。曲線3和4表現(xiàn)出明顯的差異。注射GNR溶液和GNR-PPy溶液的腫瘤OCT信號衰減系數(shù)見圖6(b)。從圖中可以看出，注射GNR-PPy溶液的腫瘤OCT信號衰減系數(shù)為5.515±1.080，明顯高于注射GNR溶液的4.039±0.639。由此表明GNR-PPy比GNR增強腫瘤的光吸收特性效果好，具有更好的OCT對比效果。

3 結 論

制備了GNR和GNR-PPy，采用TEM，紫外-可見吸收分光光度計，拉曼光譜儀進行了表征實驗，結果表明制備的納米粒子外形呈現(xiàn)棒狀，分布均勻，大小均一，具有良好的形貌特征。通過在小鼠腫瘤內(nèi)注射這兩種不同的納米粒子，并對它們進行OCT成像檢測。結果表明，注射GNR-PPy的腫瘤OCT圖像的光穿透深度減少更多，OCT信號衰減系數(shù)更大，說明GNR-PPy比GNR更好地增強了腫瘤組織的近紅外光的吸收，從而增強了腫瘤的OCT信號的衰減，提高了OCT系統(tǒng)對腫瘤成像檢測的特異性，在增強腫瘤成像效果方面具有潛在應用價值。

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*Corresponding author

(Received Mar. 13, 2015; accepted Jun. 12, 2015)

Polypyrrole Functionalized Gold Nanorods as Novel Contrast Agents for Optical Coherence Tomography

YU Jian-feng, GUO Zhou-yi, JIN Mei, WANG Xin-peng, ZHONG Hui-qing, LIU Zhi-ming*

MOE Key Laboratory of Laser Life Science & SATCM Third Grade Laboratory of Chinese Medicine and Photonics Technology, College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China

Polypyrrole (PPy) is easy-prepared with good biocompatibility and strong absorption in near-infrared (NIR) region which can serve as both the photothermal therapeutic agent and contrast agent of optical coherence tomography (OCT) imaging. Herein, gold nanorod (GNR) modified with PPy (GNR-PPy) as contrast agent for optical coherence tomography imaging was investigated. GNR-PPy was synthesized via one-pot facile oxidative polymerization by using pyrrole and GNR as starting materials. Nanoparticles were characterized using ultraviolet-visible absorbance spectroscopy, Raman spectroscopy and transmission electron microscopy. A xenograft tumor mouse model was fabricated to study the OCT contrast effect of GNR-PPy on breast tumor. An OCT system equipped with an 840 nm SLED was used for OCT imaging of the tumors injected with gold nanostructures. The experimental results indicated that the penetration depth of the OCT signals from tumors injected with GNR-PPy was lower than that from tumors injected with gold nanorods, which could be ascribed to the stronger light activity of GNR-PPy in NIR region. To quantitatively analyze the contrast effect, the attenuation coefficients were extracted from the OCT images of tumors injected with the nanostructures. In comparison with the attenuation coefficient extracted from the OCT images containing GNR, the attenuation coefficient of tumors injected with GNR-PPy was significant higher. It was concluded that gold nanorods modified with polypyrrole can enhance the light absorption in near-infrared much better, which would provide a possible detection means for enhancing the contrast effect of tumor tissues.

Optical coherence tomography; Polypyrrole; Gold nanorod; Contrast agent

2015-03-13，

2015-06-12

國家自然科學基金項目(61275187, 61335011, 11404116, 31300691), 教育部博士學科點專項科研基金項目(20114407110001, 20134407120003)，廣東省自然科學基金重點項目(2014A030311024), 廣東省教育廳科技創(chuàng)新基金項目(2013KJCX0052)，廣東省自然科學基金博士啟動項目(2014A030310306)和華南師范大學青年教師科研培育基金項目(14KJ10)資助

於劍鋒，1990年生，華南師范大學生物光子學研究院碩士研究生 e-mail： 928101740@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail： liuzm021@126.com

O436.1

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)07-2173-05