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    唾液中富組氨酸多肽的免標(biāo)記快速檢測

    2016-07-12 12:57:24肖賽金董曉峰趙曉靜
    光譜學(xué)與光譜分析 2016年9期
    關(guān)鍵詞:組氨酸疊氮香豆素

    肖賽金, 左 軍, 董曉峰, 趙曉靜, 張 立

    1.東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室,江西 南昌 330013 2.東華理工大學(xué),機(jī)械與電子工程學(xué)院,江西 南昌 330013 3.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330033

    唾液中富組氨酸多肽的免標(biāo)記快速檢測

    肖賽金1, 左 軍1, 董曉峰2, 趙曉靜1, 張 立3*

    1.東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室,江西 南昌 330013 2.東華理工大學(xué),機(jī)械與電子工程學(xué)院,江西 南昌 330013 3.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330033

    唾液中含有多種生物活性成分,包含部分可用于疾病診斷的生物標(biāo)志物。相比于血液和尿液,唾液的收集過程更為簡便且其收集過程具有完全無創(chuàng)的優(yōu)點。唾液代替血液、尿液在無創(chuàng)疾病診斷中的作用已日益顯現(xiàn)。富組氨酸多肽是由唾液腺分泌的一類富含組氨酸的小分子陽離子多肽,與口腔健康密切相關(guān)。近年研究更表明,唾液富組氨酸多肽的濃度與HIV-1、艾滋病等疾病相關(guān)。因此,富組氨酸多肽的檢測對于口腔健康監(jiān)控、疾病診斷等具有重大的意義。根據(jù)疊氮基與富組氨酸結(jié)構(gòu)域發(fā)生較強(qiáng)的氫鍵作用后給電子能力減弱的原理,建立了富組氨酸多肽的免標(biāo)記、快速檢測方法。實驗結(jié)果表明,富組氨酸多肽——Histatin 5與3-疊氮基香豆素相互作用后,熒光強(qiáng)度顯著增加,當(dāng)Histatin 5濃度為0.23~31.05 μmol·L-1時,熒光增加值與濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)r=0.994,檢出限為72 nmol·L-1(3σ/k)。唾液中常見的游離氨基酸和蛋白質(zhì)不干擾Histatins 5的測定。本方法已成功地測定了唾液中的富組氨酸多肽,加標(biāo)回收率在96.7%~111.6%之間,表明本方法具有很好的準(zhǔn)確性。與現(xiàn)有的唾液分析方法相比,本方法具有簡單快速、成本低的優(yōu)點,并有望為基于唾液的無創(chuàng)、非侵入性診斷提供新方法。

    富組氨酸多肽; 唾液;Histatin 5; 3-疊氮基香豆素

    引 言

    隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展及人們對無創(chuàng)、非侵入性診斷的需求,科學(xué)家越來越關(guān)注體液包括汗液、唾液、尿液等在疾病診斷中的應(yīng)用價值。作為一種易收集的體液,唾液在無創(chuàng)、非侵入性疾病診斷中的作用已日益顯現(xiàn)[1-2]。例如,Ramseier等[3]在唾液中發(fā)現(xiàn)了牙周病的疾病標(biāo)志物MMP-8和MMP-9骨保護(hù)素,Blicharz[4]及其同事在哮喘發(fā)作時發(fā)現(xiàn)唾液腺中的炎癥性細(xì)胞因子增殖,Liu等[5]利用唾液診斷HIV-1,Zhang等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)唾液轉(zhuǎn)錄組標(biāo)志物KRAS,BMD3L2,ACRV1等與胰腺癌密切相關(guān)等等。唾液富組氨酸多肽(Histatins)是由唾液腺分泌的一類富含組氨酸的小分子陽離子多肽的總稱,包括Histatins 1-12[8]。HRPs與口腔健康密切相關(guān),對口腔真菌及齲病、牙周炎、粘膜病等相關(guān)細(xì)菌均具有抗菌活性[9-11]。Histatins 5是Histatins 1和3等的降解產(chǎn)物,在唾液中穩(wěn)定存在。已有的研究表明,唾液富組氨酸多肽具有抗白色念珠菌、變形鏈球菌等真菌的活性,且其濃度與HIV-1、艾滋病等疾病具有相關(guān)性[12-14]。因此,唾液中富組氨酸多肽的檢測,尤其是Histatins 5的檢測對于口腔健康監(jiān)控、疾病診斷等具有重要的意義。本研究以Histatins 5為富組氨酸多肽的代表,建立了一種快速、簡單、經(jīng)濟(jì)的唾液中富組氨酸多肽的熒光檢測方法。因含有富電子基團(tuán),3-疊氮基香豆素的熒光被猝滅[15-16]。當(dāng)其與Histatins 5相互作用時,疊氮基可與Histatins 5的組氨酸結(jié)構(gòu)域相互作用,降低疊氮基的供電子能力,從而3-疊氮基香豆素的熒光逐漸恢復(fù)?;诖耍⒘艘环N新型的免標(biāo)記的Histatin 5的檢測方法,當(dāng)Histatin5 濃度為0.23~31.05 μmol·L-1時,3-疊氮基香豆素的熒光增加值與Histatin 5的濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.994,檢測限為72 nmol·L-1(3σ/k)。唾液中常見的游離氨基酸和蛋白質(zhì)不干擾Histatins 5的測定,本方法已成功地測定了唾液中的富組氨酸多肽,回收率在96.7%~111.6%之間,表明本方法具有很好的準(zhǔn)確性,并有望為唾液的無創(chuàng)、非侵入性診斷提供新思路和新方法。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    海洋光學(xué)USB4000FL(海洋光學(xué)有限公司),SP-1900紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司),H165OR 臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),雷磁pH計(上海精研有限公司)。

    3-疊氮基香豆素(上海波以爾化工有限公司),Histatin 5(上海吉爾生化有限公司),醋酸銨(廣東汕頭西隴化工廠),醋酸和甲醇(ROE Scientific Inc.USA)實驗所用試劑均為分析純,實驗用水均為二次蒸餾水。

    1.2 方法

    1.2.1 Histatin 5與3-疊氮基香豆素的相互作用

    將3-疊氮基香豆素(25 μmol·L-1)與不同濃度的Histatin 5加入到0.1 mol·L-1的醋酸-醋酸銨(pH 6.0)緩沖溶液中,混勻后在25 ℃下反應(yīng)10 min,測定熒光。

    1.2.2 甲醇對Histatin 5與3-疊氮基香豆素相互作用的影響

    將62.5 μmol·L-1的Histatin 5加入到不同比例的甲醇溶液(0%~50%),4 ℃下反應(yīng)1 h后,加入0.1 mol·L-1的醋酸-醋酸銨緩沖溶液和25 μmol·L-1的3-疊氮基香豆素,混勻后在25 ℃下反應(yīng)10 min,測定熒光。

    1.2.3 唾液中富組氨酸多肽的檢測

    唾液的收集參考文獻(xiàn)[18]并有所修改,志愿者被要求咀嚼小片檸檬以刺激唾液的產(chǎn)生。分泌出的唾液用玻璃管收集,在水中煮沸30 min后,于4 ℃、14 000 g離心10 min,收集的唾液上清液于4 ℃保存待用。為了測定唾液中的富組氨酸多肽,將100 μL唾液上清液和100 μL 25 μmol·L-1的3-疊氮基香豆素加入到300 μL 0.1 mol·L-1的醋酸-醋酸銨緩沖溶液(pH 6.0)中, 漩渦混勻后于25 ℃下反應(yīng)10 min,測定熒光。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 3-疊氮基香豆素與Histatin 5的相互作用研究

    因含有富電子的α-N原子,3-疊氮基香豆素的熒光被猝滅。當(dāng)疊氮基的給電子能力減弱時,3-疊氮基香豆素的熒光將得到恢復(fù)[16]。已有研究表明,3-疊氮基香豆素可通過氫鍵與漆酶富組氨酸的銅離子結(jié)合域相互作用,減弱疊氮基的給電子能力,從而3-疊氮基香豆素的熒光得到恢復(fù)[18]。從文獻(xiàn)[18]可以看到,富組氨酸結(jié)構(gòu)域是3-疊氮基香豆素?zé)晒饣謴?fù)的關(guān)鍵,據(jù)此推測富組氨酸的多肽和蛋白質(zhì)均可能與3-疊氮基香豆素形成氫鍵,從而使其熒光得到恢復(fù)。為了驗證我們的猜想,選擇唾液中的富組氨酸陽離子多肽——Histatin為模型,研究其與3-疊氮基香豆素的相互作用。Histatin 5是唾液腺分泌的富組氨酸多肽,由24個氨基酸殘基組成,其中組氨酸殘基數(shù)目為7。因富含組氨酸殘基為a螺旋構(gòu)象,Histatin 5可形成富組氨酸的結(jié)構(gòu)域,并與疊氮基發(fā)生較強(qiáng)的氫鍵相互作用,從而使3-疊氮基香豆素的熒光得到恢復(fù)。圖1(a)表示的是3-疊氮基香豆素與Histatin 5相互作用的熒光光譜。單獨的3-疊氮基香豆素和Histatin 5的熒光強(qiáng)度都很弱(曲線a和b)。當(dāng)二者共存時,溶液的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(曲線c),說明Histatin 5與疊氮基發(fā)生了相互作用,從而使其給電子能力減弱,最終導(dǎo)致3-疊氮基香豆素的熒光恢復(fù)。同時考察了二者相互作用的吸收光譜,如圖1(b)所示。3-疊氮基香豆素在345 nm有一個較強(qiáng)的吸收峰,Histatin 5則在286 nm具有較強(qiáng)的吸收,二者相互作用后,在275 nm出現(xiàn)了一個新的吸收峰,表明3-疊氮基香豆素與Histatin 5相互作用生成了新的物質(zhì)。

    圖1 反應(yīng)體系在不同溶液中的熒光發(fā)射光譜(a)和紫外-可見吸收光譜 (b)

    a: Histatin 5;b: 3-疊氮基香豆素;c: 3-疊氮基香豆素與Histatin 5的混合物[3-疊氮基香豆素]=25 μmol·L-1, [Histatin 5]=62.5 μmol·L-1

    Fig.1 Fluorescence spectra (a) and UV-vis spectra (b) of the sensing system in different solutions

    a:Histatin 5;b: 3-azidocoumarin;c: The mixture of 3-azidocoumarin and Histatin 5[3-azidocoumarin]=25 μmol·L-1, [Histatin 5]=62.5 μmol·L-1

    2.2 3-疊氮基香豆素與Histatin 5相互作用的機(jī)理研究

    據(jù)文獻(xiàn)報道,漆酶銅離子結(jié)構(gòu)域中的組氨酸可與疊氮基形成氫鍵相互作用,減弱疊氮的給電子能力,使3-疊氮基香豆素的熒光恢復(fù)[18]。為了說明組氨酸在3-疊氮基香豆素?zé)晒饣謴?fù)中可能發(fā)揮的作用,考察了組氨酸與3-疊氮基香豆素的相互作用。當(dāng)組氨酸與3-疊氮基香豆素相互作用后,3-疊氮基香豆素的熒光略有恢復(fù)[圖2(a)],但熒光恢復(fù)程度顯著低于Histatin 5,表明組氨酸雖可部分減弱疊氮基的給電子能力,但并不是引起3-疊氮基香豆素?zé)晒饣謴?fù)的主要原因。據(jù)此,可推測Histatin 5的富組氨酸結(jié)構(gòu)域可能是導(dǎo)致3-疊氮基香豆素?zé)晒饣謴?fù)的主要原因。為了驗證上述猜想,研究了不同濃度甲醇存在下,Histatin 5與3-疊氮基香豆素的熒光光譜[圖2(b)]。甲醇通過提供自己羥基上的氫形成氫鍵,從而破壞了蛋白質(zhì)中原有的氫鍵,使蛋白質(zhì)變性。從圖2(b)可以看到,當(dāng)沒有甲醇時,Histatin 5與3-疊氮基香豆素相互作用,熒光顯著增強(qiáng)。當(dāng)甲醇濃度逐步增加時,Histatin 5的構(gòu)象逐漸被破壞,與3-疊氮基香豆素的氫鍵結(jié)合能力減弱,從而熒光恢復(fù)程度降低。上述結(jié)果表明,3-疊氮基香豆素的熒光恢復(fù)與Histatin 5的二維結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

    圖2 3-疊氮基香豆素與Histatin 5反應(yīng)的機(jī)理研究

    (a):組氨酸和Histatin 5分別與3-疊氮基香豆素反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜;(b): 甲醇影響

    [3-疊氮基香豆素]=25 μmol·L-1, [Histatin 5]=62.5 μmol·L-1, [組氨酸]=62.5 μmol·L-1

    Fig.2 Mechanism study of the interaction between

    3-azidocoumarin and Histatin 5

    (a): The fluorescence spectra of Histidine and Histatin 5;(b):The influence of methanol

    [3-azidocoumarin]=25 μmol·L-1, [Histatin 5]=62.5 μmol·L-1, [His]=62.5 μmol·L-1

    2.3 靈敏度和選擇性

    當(dāng)不同濃度的Histatin 5與3-疊氮基香豆素相互作用后,溶液的熒光強(qiáng)度隨著Histatin 5濃度的增加而逐步增強(qiáng)[圖3(a)]。當(dāng)Histatin 5濃度為0.23~31.05 μmol·L-1時,3-疊氮基香豆素的熒光強(qiáng)度增加值與其濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,線性方程為:ΔIF=6.49+13.47cHistatin5,線性相關(guān)系數(shù)r為0.994,檢測限為72 nmol·L-1(3σ/k)。進(jìn)一步考察了唾液中常見的氨基酸和蛋白質(zhì)對Histatin 5與3-疊氮基香豆素相互作用的影響,如圖3(b)所示。只有Histatin 5可引起3-疊氮基香豆素?zé)晒獾脑鰪?qiáng),唾液中常見的氨基酸和蛋白質(zhì),如苯丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、溶菌酶等等都不會引起3-疊氮基香豆素?zé)晒獾娘@著增強(qiáng),表明本方法具有檢測唾液中富組氨酸多肽的潛能。

    圖3 (a)不同濃度Histatin 5與3-疊氮基香豆素反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜;(b)檢測系統(tǒng)對Histatin 5檢測的特異性

    (a): [3-疊氮基香豆素]=25 μmol·L-1;Histatin 5的濃度從下到上分別為:0.23, 0.56, 1.15, 2.30, 6.21, 12.42, 18.63, 24.84, 31.05 μmol·L-1; (b): [3-疊氮基香豆素]=25 μmol·L-1, [Histatin 5]=62.5 μmol·L-1, [其他]=62.5 μmol·L-1

    Fig.3 (a) fluorescence emission spectra in the presence of various concentrations of Histatin 5;(b) specificity of the sensing system for Histatin 5 over other potential interferences

    (a): [3-azidocoumarin]=25 μmol·L-1;The concentrations of Histatin 5 from down to top are 0.23, 0.56, 1.15, 2.30, 6.21, 12.42, 18.63, 24.84, 31.05 μmol·L-1; (b): [3-azidocoumarin]=25 μmol·L-1, [Histatin 5]=62.5 μmol·L-1, [Others]=62.5 μmol·L-1

    2.4 唾液中富組氨酸多肽的檢測

    為了驗證本方法是否可應(yīng)用于唾液中富組氨酸多肽的分析,通過加標(biāo)回收法考察了方法的實用性和準(zhǔn)確性。唾液的收集方法參考文獻(xiàn)[1]并有所修改,表1為唾液上清液與3-疊氮基香豆素相互作用的結(jié)果,從表中可以看到,唾液中的富組氨酸濃度為0.54 μmol·L-1,與文獻(xiàn)報道的值較接近[19]。而后,通過加入一定濃度的Histatin 5標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)一步驗證了本方法的準(zhǔn)確性。從結(jié)果可以看出,本方法的加標(biāo)回收率在96.7%~111.6%之間,表明本方法具有很好的準(zhǔn)確性,并有望為基于唾液的無創(chuàng)、非侵入性診斷提供新思路和新方法。

    表1 唾液中富組氮酸多肽的檢測

    a: The results were obtained from five pararell samples

    3 結(jié) 論

    作為一種易收集的體液,唾液在無創(chuàng)、非侵入性疾病診斷中的作用已日益顯現(xiàn)。唾液富組氨酸多肽是由唾液腺分泌的一類富含組氨酸的小分子陽離子多肽的總稱,與口腔健康密切相關(guān),且其濃度與HIV-1、艾滋病等疾病具有相關(guān)性。因此,唾液中富組氨酸多肽的檢測對于口腔健康監(jiān)控、疾病診斷等具有重要的意義。以Histatins 5為富組氨酸多肽的代表,基于3-疊氮基香豆素與Histatin 5富組氨酸結(jié)構(gòu)域的特異性相互作用,建立了一種新型的免標(biāo)記的Histatin 5的熒光檢測方法。當(dāng)Histatin 5濃度為0.23~31.05 μmol·L-1時,3-疊氮基香豆素的熒光增加值與Histatin 5的濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.994,檢測限為72 nmol·L-1(3σ/k)。唾液中常見的游離氨基酸和蛋白質(zhì)不干擾Histatins 5的測定,本方法已成功地測定了唾液中的富組氨酸多肽,加標(biāo)回收率在96.7%~111.6%之間,表明本方法具有很好的準(zhǔn)確性,并有望為基于唾液的無創(chuàng)、非侵入性診斷提供新思路和新方法。

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    (Received Mar.24, 2015; accepted Jul.22, 2015)

    *Corresponding author

    Label-Free and Rapid Detection of Histidine-Rich Peptides in Saliva

    XIAO Sai-jin1, ZUO Jun1, DONG Xiao-feng2, ZHAO Xiao-jing1, ZHANG Li3*

    1.East China Institute of Technology, Jiangxi Key Laboratory for Mass Spectrometry and Instrumentation, Nanchang 330013, China 2.School of Mechanical and Electronic Engineering, East China Institute of Technology, Nanchang 330013, China 3.School of Chemistry, Nanching University, Nanchang 330033, China

    Siliva as a kind of biomarker containing a variety of bioactive components can be used to help disease diagnosis.Compared with the urine and blood, the collection of saliva is more simple and convenient while the collection process is completely non-invasive.Therefore, saliva detection attracts more and more attention in non-invasive disease diagnosis.Histatins are a family of small, cationic, histidine-rich peptides, which secreted by salivary bringing innate defense of the oral cavity.It has been reported that histatins are related to many other diseases, such as HIV and AIDs.Thus the detection of histatins in saliva is significantly important for oral healthy monitoring and disease diagnosis.In this paper, a new label free method for rapid detection of histidine-rich peptides was developed based on the fact that histidine-rich peptides can interact with 3-azidocoumarin through hydrogen bonds which decreases the electron-donating ability of the azido group and results in fluorescence enhancement of the system.The results showed that the fluorescence intensities were dramatically increased when histatin 5 were incubation with 3-azidocoumarin.There is a good relationship with the linear corof 0.994 between the enhanced fluorescence and histatin 5 concentration ranging from 0.23 to 31.05 μmol·L-1, and the limit of detection is 72 nmol·L-1(3σ/k).Moreover, the detection of histidine-rich peptides in saliva was successfully achieved by the new developed label free method since amino acids and proteins in saliva will not be interfered with the detection with the recoveries between 96.7%~111.6%.Compared with the existing saliva analysis methods, this method has the advantage of simple, fast and low cost.It might be applied in non-invasive disease diagnosis.

    Histidine-rich peptides;Saliva;Histatin 5; 3-Azidocoumarin

    2015-03-24,

    2015-07-22

    國家自然科學(xué)基金項目(21205011, 21465003), 東華理工大學(xué)博士啟動金項目(DHBK1006)和江西省重大科技創(chuàng)新研究項目(20124ACB00700)資助

    肖賽金,女,1983年生,東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室講師 e-mail: xiaosj66@126.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: zhangli8@ncu.edu.cn

    O657.3

    A

    10.3964/j.issn.1000-0593(2016)09-2906-05

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