基于銀溶膠表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)菠菜毒死蜱農(nóng)藥的快速檢測(cè)

翟 晨，徐田鋒，彭彥昆，李永玉

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心，北京 100083

基于銀溶膠表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)菠菜毒死蜱農(nóng)藥的快速檢測(cè)

翟 晨，徐田鋒，彭彥昆，李永玉*

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心，北京 100083

利用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)，建立了一種用于菠菜中毒死蜱農(nóng)藥殘留的非破壞、快速檢測(cè)方法。以堿性環(huán)境下鹽酸羥胺還原法制備的銀溶膠作為表面增強(qiáng)劑滴涂于菠菜樣品表面后，采用實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼系統(tǒng)直接采集樣品的拉曼信息，該方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，可以實(shí)現(xiàn)菠菜中毒死蜱含量的實(shí)時(shí)在線定量分析。采集24片不同毒死蜱含量的菠菜樣品拉曼光譜，每個(gè)樣品采集20個(gè)點(diǎn)。拉曼信號(hào)采集后，用氣相色譜法對(duì)24個(gè)菠菜樣品中毒死蜱含量進(jìn)行檢測(cè)。為了消除光譜噪音以及熒光背景對(duì)分析建模的影響，分別采用Savitzky-Golay平滑和有效峰線性擬合法對(duì)原始拉曼光譜進(jìn)行預(yù)處理。該表面增強(qiáng)拉曼方法具有較好的重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)中對(duì)50個(gè)相同毒死蜱含量，但不同狀態(tài)的菠菜進(jìn)行光譜采集，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為13.4%，說(shuō)明該方法具有一定的普適性。光譜預(yù)處理后，選取615.5～626.4 cm-1波段為感興趣區(qū)域，建立0.05～37.4 mg·kg-1濃度范圍內(nèi)毒死蜱含量的多元線性預(yù)測(cè)模型，結(jié)果表明感興趣區(qū)域的拉曼信號(hào)和毒死蜱濃度呈良好的線性關(guān)系，其校正集和驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)RC和RP分別為0.961和0.954。該方法的最低檢出含量為0.05 mg·kg-1，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的農(nóng)藥殘留最大限量。該方法簡(jiǎn)單快速，無(wú)需樣品前處理，可以實(shí)現(xiàn)果蔬的農(nóng)藥殘留快速、定量檢測(cè)。

表面增強(qiáng)拉曼光譜；菠菜；毒死蜱；銀溶膠

引 言

毒死蜱(C9H11Cl3NO3PS)是一種高效、應(yīng)用廣泛的有機(jī)磷農(nóng)藥，可抑制害蟲(chóng)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，對(duì)廣泛植食性昆蟲(chóng)均有毒殺效果，有效適用于谷物、蔬菜、水果以及糖料作物[1]。氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等[2]常用理化檢測(cè)手段具有較低的檢測(cè)限，但是存在前處理過(guò)程復(fù)雜、消耗時(shí)間長(zhǎng)、儀器昂貴、需要專(zhuān)業(yè)人員操作等缺點(diǎn)，不適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)時(shí)檢測(cè)，生物傳感器法[3]、試紙條法等快速檢測(cè)方法速度快，但是特異性差，結(jié)果受環(huán)境影響較大。

拉曼光譜技術(shù)具有無(wú)損、快速、實(shí)時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)其散射光譜進(jìn)行分析，得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面的信息，從而對(duì)待測(cè)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[4-5]。但是，傳統(tǒng)的拉曼散射信號(hào)較弱，導(dǎo)致采用該方法缺乏靈敏度[6]，表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)結(jié)合拉曼光譜與納米技術(shù)可以使拉曼信號(hào)增強(qiáng)達(dá)15個(gè)數(shù)量級(jí)[7-8]。該技術(shù)采用表面粗糙的納米金屬材料(如金、銀、銅等)[9]，當(dāng)分子吸附在這些納米材料表面時(shí)，拉曼信號(hào)得到增強(qiáng)。相比于其他納米金屬材料，銀溶膠的表面增強(qiáng)效應(yīng)最強(qiáng)[10]，本文采用鹽酸羥胺還原法制備銀溶膠，該方法穩(wěn)定、快速，所制備的銀溶膠可直接用于拉曼檢測(cè)[11]。

目前，采用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)檢測(cè)農(nóng)藥的研究有很多，但是，以農(nóng)藥溶液的檢測(cè)為主，對(duì)于果蔬樣品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，大多數(shù)需要樣品前處理。Fan等[12]采用SERS方法檢測(cè)蘋(píng)果中的亞胺硫磷含量，需要對(duì)樣品打碎以及濃縮處理。Wijaya等[13]在檢測(cè)蘋(píng)果表面的啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥時(shí)，需要拭擦樣品表面，然后通過(guò)漩渦震蕩等手段，將農(nóng)藥溶解于溶液中，再進(jìn)行SERS檢測(cè)。Xie等[14]利用SERS方法檢測(cè)小白菜、韭菜等多種蔬菜中甲胺磷農(nóng)藥含量，也需要將蔬菜打碎后提取農(nóng)藥。目前，少有對(duì)果蔬樣品不進(jìn)行前處理，將納米粒子直接滴涂于樣品表面，進(jìn)行SERS原位定量分析的研究報(bào)道。

本研究采用鹽酸羥胺還原法制備的銀溶膠作為表面增強(qiáng)劑，以菠菜作為載體，不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，直接將銀溶膠滴涂于菠菜表面進(jìn)行SERS檢測(cè)。采用Savitzky-Golay平滑和有效峰線性擬合法對(duì)原始拉曼光譜進(jìn)行預(yù)處理以減小噪聲和熒光背景對(duì)檢測(cè)精度的影響，采用多元線性回歸法建立菠菜毒死蜱含量的預(yù)測(cè)模型，通過(guò)該研究為實(shí)現(xiàn)菠菜中毒死蜱快速、定量檢測(cè)提供一種新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

毒死蜱純品(99.8%，Augsburg，Germany)用以獲取毒死蜱特征峰，市售毒死蜱乳油農(nóng)藥(有效成分48%，河北省石家莊市伊諾生化有限公司)用以施加于菠菜表面進(jìn)行定量分析。硝酸銀生產(chǎn)于廣東光華科技股份有限公司，鹽酸羥胺生產(chǎn)于天津市津科精細(xì)化工研究所，硝酸、氫氧化鈉、丙酮均生產(chǎn)于北京化工廠，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

采用實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)采集樣品的光譜信息[15]，該系統(tǒng)包括激光器(I0785MM0350MF-NL)、拉曼光譜儀(Raman Explorer 785)、CCD相機(jī)(Newton DU920N-BR-DD)、光纖、探針、平移臺(tái)和計(jì)算機(jī)等硬件，電機(jī)控制平移臺(tái)實(shí)現(xiàn)三維運(yùn)動(dòng)。該儀器有效光譜范圍是0～2 352.0 cm-1，激發(fā)光波長(zhǎng)為785 nm。

電子天平(ME204，METTLER TOLEDO)；磁力攪拌器(88-1，常州國(guó)華電器有限公司)；離心機(jī)(TDZ5-WS，湖南赫西儀器裝備有限公司)；漩渦混合器(QL-901，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 樣品制備

制備不同濃度的毒死蜱溶液各500 mL，以75%的丙酮溶液(丙酮和去離子水體積比為3∶1)作溶劑。取洗凈的菠菜葉片24片，在不同濃度的毒死蜱溶液中分別浸泡7 s后自然晾干作為待測(cè)樣品。

1.4 銀溶膠的合成

根據(jù)Nicolae Leopold等的方法[11]，首先制備濃度為1.1×10-3mol·L-1的硝酸銀溶液，然后將鹽酸羥胺和氫氧化鈉溶解于10 mL的去離子水中，制備成濃度分別為1.5×10-2和3.0×10-2mol·L-1的混合溶液，將新鮮制備的混合液迅速倒入90 mL快速攪拌的硝酸銀溶液中，溶液顏色迅速由透明變?yōu)榛液稚掷m(xù)攪拌30 min即得到納米銀膠，將得到的銀溶膠離心，去除上清液，濃縮后的銀溶膠置于4 ℃黑暗環(huán)境中待用。

1.5 光譜采集

保持激光功率為450 mW，相機(jī)曝光時(shí)間為2.5 s，光譜儀與相機(jī)狹縫為100 μm，光譜采集軟件選擇CCD自帶的Andor SOLIS光譜采集軟件。將樣品放置于升降臺(tái)上，調(diào)節(jié)樣品與檢測(cè)探頭距離為7.5 mm。在菠菜待測(cè)位置上先滴加2.5 μL 75%的丙酮溶液，使吸附在菠菜表面的毒死蜱農(nóng)藥溶解，然后迅速滴加4 μL銀溶膠溶液，2 s后采集拉曼光譜。每個(gè)樣品采集20個(gè)點(diǎn)，20個(gè)點(diǎn)均勻分布于菠菜表面，拉曼光譜采集完成后，將采集光譜后的菠菜迅速放入密封袋中保存，參照標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 0148—2011，采用氣相色譜法對(duì)菠菜中毒死蜱含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 光譜處理及數(shù)據(jù)分析

拉曼信號(hào)獲得過(guò)程中，因受外界環(huán)境變化、激光功率波動(dòng)、檢測(cè)器噪聲以及樣品本身所產(chǎn)生的熒光背景等多方面因素的影響，所獲得的光譜數(shù)據(jù)除了被檢測(cè)物質(zhì)的信息外還包含了其他無(wú)關(guān)的信息和干擾噪聲。因此，分析建模前需要對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理以降低噪聲和扣除熒光背景。

本研究的光譜預(yù)處理方法為首先采用Savitzky-Golay(S-G)5點(diǎn)平滑法降低噪聲，然后采用有效峰線性擬合法扣除熒光背景。S-G 5點(diǎn)平滑法基于多項(xiàng)式擬合，可有效去除光譜噪聲，且較好地保留光譜原有信息。有效峰線性擬合法，通過(guò)判斷波峰兩側(cè)有無(wú)波谷從而確定直線擬合的起始位置，進(jìn)而通過(guò)直線擬合方程產(chǎn)生并替換原始光譜中波峰位的數(shù)據(jù)，該方法可有效消除拉曼信號(hào)熒光背景，使光譜數(shù)據(jù)優(yōu)化。原始光譜及預(yù)處理后的光譜如圖1所示，可見(jiàn)熒光背景得到了有效的去除，而原始光譜中的拉曼峰，如621.0，683.4 cm-1，甚至較為微弱拉曼峰，比如1 158.8 cm-1(拉曼峰強(qiáng)度小于150 count)也得到了有效的保留。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒死蜱特征峰的確定

圖2 無(wú)農(nóng)藥菠菜拉曼光譜a, 毒死蜱純品拉曼光譜b和含有毒列蜱的菠菜SERS光譜c

Fig.2 Raman spectrum of spinach without chlorpyrifosa, Raman spectrum of chlorpyrifos powderband SERS spectrum of spinach with chlorpyrifos at Silver colloidsc

2.2 模型重復(fù)性驗(yàn)證

建立可靠穩(wěn)定的模型，其系統(tǒng)以及方法的穩(wěn)定性非常重要。本研究制備50組相同毒死蜱含量的菠菜樣品，對(duì)其不同部位(如葉肉部位、葉脈部位、葉片正面、葉片反面)，且在不同新鮮狀態(tài)下分別進(jìn)行了SERS信號(hào)采集。所得到的原始光譜曲線如圖3(a)所示，可見(jiàn)不同采集部位、不同新鮮狀態(tài)的菠菜葉片光譜曲線的熒光背景有較大的差別。對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理后，選取621.0 cm-1處特征峰強(qiáng)度進(jìn)行比較，50個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的特征峰強(qiáng)度如圖3(b)所示，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為13.4%，說(shuō)明該方法具有較好的穩(wěn)定性[18]，雖然樣品的差異導(dǎo)致光譜的熒光背景差異，但是對(duì)待測(cè)物毒死蜱的特征峰強(qiáng)度影響并不大。因此該方法具有一定的普適性，對(duì)新鮮度不同的樣品及樣品的不同部位均有實(shí)用性。

圖3 相同毒死蜱含量的50個(gè)樣品的原始拉曼光譜(a),621.0 cm-1處的峰強(qiáng)度柱狀圖(b)

Fig.3 Pure Raman spectra with same concentration of chlorpyrifos of 50 samples (a), the discrete states of Raman intensity at 621.0 cm-1of 50 samples (b)

2.3 菠菜中毒死蜱含量預(yù)測(cè)模型的建立

每個(gè)樣品分別采集20個(gè)點(diǎn)的拉曼光譜，并對(duì)其20條光譜進(jìn)行平均作為該樣品的拉曼信息。24個(gè)樣品所對(duì)應(yīng)的平均拉曼光譜，通過(guò)S-G 5點(diǎn)平滑和有效峰線性擬合法降低噪聲和扣除熒光背景，得到的光譜均在621.0和683.4 cm-1處有明顯的毒死蜱拉曼特征峰，其強(qiáng)度隨著毒死蜱含量的降低而呈下降趨勢(shì)。因此，對(duì)621.0和683.4 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度與毒死蜱含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

為了減小毒死蜱含量跨度進(jìn)而提高預(yù)測(cè)模型的穩(wěn)健性，剔除了毒死蜱含量較高的313.4，133.9和83.49 mg·kg-13個(gè)菠菜樣品。分別建立621.0和683.4 cm-1處峰強(qiáng)度與毒死蜱含量(0.05～37.4 mg·kg-1)之間的線性關(guān)系，但兩個(gè)位置的峰強(qiáng)度與毒死蜱含量之間的相關(guān)性均不好，621.0 cm-1處的相關(guān)系數(shù)相對(duì)較好，也只有0.722。進(jìn)一步選擇621.0和683.4 cm-1處的峰強(qiáng)作為感興趣數(shù)據(jù)建立與實(shí)際毒死蜱含量之間的二元線性回歸模型，但所建立的線性回歸方程相關(guān)性沒(méi)有得到很大提高，相關(guān)系數(shù)為0.731。這可能因?yàn)椴捎孟葘?duì)光譜進(jìn)行平均，后對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理的方法，沒(méi)有較好的保留所采集的每條光譜中待測(cè)物的有效信息，直接影響了毒死蜱農(nóng)藥的預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確度。

圖4 不同毒死蜱含量的菠菜平均SERS光譜信號(hào)

因此本研究先對(duì)每個(gè)樣品的20條光譜曲線分別進(jìn)行熒光背景扣除，再對(duì)扣除熒光背景后的20條光譜曲線進(jìn)行平均，這樣可以較好的保留20條光譜曲線中毒死蜱的拉曼信息，增加了模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。24個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的原始光譜經(jīng)光譜預(yù)處理，再進(jìn)行平均后的光譜曲線如圖4所示，所有樣品的光譜曲線在621.0和683.4 cm-1等處均有明顯的毒死蜱特征峰。特別是毒死蜱含量為0.05 mg·kg-1時(shí)，其拉曼光譜仍可清晰辨別出毒死蜱特征信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)0～2 352.0 cm-1范圍內(nèi)所有點(diǎn)的拉曼峰強(qiáng)度與農(nóng)藥含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，相關(guān)性最高的前20個(gè)拉曼位移以及對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)如表1所示。結(jié)果顯示，在615.5～626.4 cm-1范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均高于0.85，其中621.0 cm-1處相關(guān)系數(shù)最高為0.885。因此為了提高模型準(zhǔn)確度，選取615.5～626.4 cm-1波段作為感興趣區(qū)域，建立毒死蜱的多元線性回歸預(yù)測(cè)模型。

剔除3個(gè)農(nóng)藥含量較高的樣品，剩余的樣品按照3∶1的比例分為校正集和驗(yàn)證集，建立了615.5～626.4 cm-1范圍內(nèi)的多元線性回歸模型，所建模型校正集和驗(yàn)證集的散點(diǎn)圖如圖5所示。校正集相關(guān)系數(shù)(RC)為0.961，校正集均方根誤差(RMSEC)為3.368 mg·kg-1，驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)(RP)為0.954，驗(yàn)證集均方根誤差(RMSEP)為3.614 mg·kg-1。

表1 拉曼峰強(qiáng)度與濃藥含量相關(guān)性最高的前20個(gè)拉曼位移以及對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)

圖5 菠菜中毒死蜱含量的校正集和驗(yàn)證集結(jié)果，誤差線為三次檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)差

3 結(jié) 論

本研究基于實(shí)驗(yàn)室自主搭建的拉曼光譜系統(tǒng)結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，對(duì)菠菜毒死蜱農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。采用S-G 5點(diǎn)平滑和有效峰線性擬合的光譜預(yù)處理方法，選取615.5～626.4 cm-1波段，建立了菠菜毒死蜱含量預(yù)測(cè)的多元線性回歸模型，其RC和RP分別為0.961和0.954，最低檢出含量為0.05 mg·kg-1。該方法不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，檢測(cè)速度快，具有較好的穩(wěn)定性與普適性，為果蔬農(nóng)藥殘留的實(shí)時(shí)和在線檢測(cè)提供了一種新方法。

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*Corresponding author

(Received Oct.13, 2015; accepted Jan.30, 2016)

Detection of Chlorpyrifos on Spinach Based on Surface Enhanced Raman Spectroscopy with Silver Colloids

ZHAI Chen, XU Tian-feng, PENG Yan-kun, LI Yong-yu*

National Research and Development Center for Agro-Processing Equipment, College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

In this research, the surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) technique is used to develop a nondestructive and fast detecting method for the detection of residual chlorpyrifos on spinach.Silver colloids used for SERS spectroscopy is prepared by the reduction of silver nitrate with hydroxylamine hydrochloride at alkaline pH.The prepared silver colloids are dropped onto spinach samples, then the SERS spectra are collected non-destructively with a self-developed Raman system.This method can be made without physical contact to samples, and rapidly completed without time-consuming sample pre-treatments, and suited to the development of real-time on-line detection methods for trace pesticide residues.SERS signals are collected from 20 points on each spinach sample with 450 mW laser power and 2.5 s exposure time.Chlorpyrifos concentrations in 24 samples are determined with gas chromatography after SERS spectra taken.Savitzky-Golay (SG) smoothing filter and effective peak linear fitting method are used to remove the random noise and the fluorescence background for improving the accuracy of SERS results.The SERS signals are collected from different parts of 50 spinach samples with the same concentration of chlorpyrifos but at different fresh degrees.The relative standard deviation (RSD) of chlorpyrifos' characteristic peak intensities is 13.4%.Although the differences of samples lead to differences in the curves of Raman spectrum, they have little influence on the characteristic peak intensities, which indicates the stability of the proposed detecting method.After the fluorescent background removed, the 20 curves of each sample are averaged.Correlation analysis is done between chlorpyrifos concentration and signal intensity at every Raman shift.Results show that correlation coefficients are higher than 0.85 in the range of 615.5～626.4 cm-1.Signals in this range are used to establish multiple linear regression (MLR) model for the prediction of residual chlorpyrifos.MLR model was developed for chlorpyrifos concentration versus Raman signal intensity at 615.5～626.4 cm-1for predicting residual chlorpyrifos content in samples, the correlation coefficients of calibration (RC) and validation (RP) are 0.961 and 0.954, which indicate a good linear relationships between them.The minimum detectable threshold for this method is 0.05 mg·kg-1which is close to the value limited by the national standard of China (0.1 mg·kg-1for chlorpyrifos in spinach).The proposed practical method is sample, fast, without sample preparation, thus it shows great potential in safety detection of fruits and vegetables.

Surface enhanced Raman spectroscopy; Spinach; Chlorpyrifos; Silver colloids

2015-10-13，

2016-01-30

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD04B05)資助

翟 晨，1988年生，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院博士研究生 e-mail：270905844@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：yyli@cau.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)09-2835-06