仔豬回腸絨毛M細胞的形態(tài)、分布及其與豬流行性腹瀉病毒感染的關系

李任峰，田香勤，喬松林，郭軍慶，周恩民，張改平

(1.河南科技學院動物科學學院，新鄉(xiāng) 453003；2.農(nóng)業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；4.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100；5.新鄉(xiāng)醫(yī)學院河南省高等學校組織再生重點開放實驗室，新鄉(xiāng) 453003)

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仔豬回腸絨毛M細胞的形態(tài)、分布及其與豬流行性腹瀉病毒感染的關系

李任峰1，2，4，田香勤5，喬松林2*，郭軍慶2，周恩民4，張改平3*

(1.河南科技學院動物科學學院，新鄉(xiāng) 453003；2.農(nóng)業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；4.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100；5.新鄉(xiāng)醫(yī)學院河南省高等學校組織再生重點開放實驗室，新鄉(xiāng) 453003)

摘要：為了探索新生仔豬回腸絨毛上皮是否存在M細胞以及自然感染條件下豬流行性腹瀉病毒(PEDV)與回腸絨毛M細胞之間的關系。采用免疫熒光、免疫組化及形態(tài)學方法研究了正常情況下仔豬回腸絨毛M細胞的分布特點和形態(tài)學特征，以及自然感染條件下PEDV與仔豬回腸絨毛M細胞之間的關系。免疫熒光結果證實正常仔豬回腸絨毛上皮存在M細胞，沿隱窩至絨毛頂端上皮方向，M細胞的數(shù)量逐漸減少。電鏡下，正常仔豬的回腸絨毛M細胞具有典型的M細胞特征。自然感染PEDV的仔豬回腸絨毛M細胞病變明顯，在其頂膜、細胞質(zhì)、細胞核及其上皮下層均觀察到成簇的PEDV顆粒，而相鄰的其他上皮細胞病變不明顯，且細胞內(nèi)沒有觀察到病毒粒子。以上研究結果表明，新生仔豬回腸絨毛上皮存在M細胞，在絨毛的不同位置其分布比例存在差異。仔豬回腸絨毛M細胞可能是PEDV入侵腸道的重要通道。

關鍵詞：腸絨毛M細胞；新生仔豬；豬流行性腹瀉病毒

M細胞(microfold cell)又稱為微皺褶細胞，最早發(fā)現(xiàn)于人的集合淋巴結(Payer’S patehes，PP)上的濾泡相關上皮(follicle associated epithelium，F(xiàn)AE)，在孤立淋巴結、闌尾和胃腸道外的黏膜相關淋巴組織也存在M細胞[1]。小腸絨毛上皮中M細胞的報道僅見于小鼠[2]，豬(特別是新生仔豬)小腸絨毛上皮是否存在M細胞以及形態(tài)特征尚未見報道。

典型的M細胞刷狀緣發(fā)育不良，以微皺褶代替微絨毛，基底面內(nèi)陷形成腔室，頂部細胞質(zhì)終末網(wǎng)不發(fā)達，細胞游離面的堿性磷酸酶活性較低[3]。M細胞主要以受體介導胞吞方式攝取抗原，并特異性地將抗原轉(zhuǎn)運至位于其下的抗原遞呈細胞(APC)進行識別、處理并激活淋巴細胞，繼而啟動腸道黏膜免疫應答。然而，M細胞獨特的形態(tài)學結構也為許多腸道病原體的入侵提供了門戶[4]。

近年來，豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)病在我國的許多豬場暴發(fā)，對我國的養(yǎng)豬行業(yè)造成了嚴重影響。該病對成年豬危害較輕，但7日齡以內(nèi)的新生仔豬死亡率可達100%[5]。考慮到PEDV對新生仔豬的高致病性以及M細胞在病毒感染和黏膜免疫中的重要作用，本研究首先通過免疫熒光染色和形態(tài)學方法證實了新生仔豬回腸絨毛存在M細胞，報道其超微結構特征及其在絨毛不同位置的分布特點，并初步探索自然感染條件下PEDV與仔豬回腸絨毛M細胞的關系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1組織樣品試驗所用正?；啬c組織樣品來自2日齡健康仔豬(長白、大白和杜洛克三元雜交豬)，樣品分為兩份：一份切成5 mm3的組織塊后迅速放置于液氮內(nèi)冷凍30 min，OCT包埋劑包埋，Leica冰凍切片機切片，片厚6 μm，-20 ℃丙酮中固定10 min，供免疫熒光染色用；另一份用4%戊二醛溶液固定4～12 h，之后進一步修塊，切成1 mm×1 mm×2 mm的小塊用于電鏡樣品制作。自然感染PEDV的仔豬回腸組織分別采用與以上相同的方法進行冰凍切片及電鏡樣品的制備，用于免疫組化染色及透射電鏡觀察。

1.1.2主要儀器和試劑透射電子顯微鏡(Hitachi，H-7500型)，掃描電子顯微鏡(FEI Quanta 200FEG)，超薄切片機(Leica，UC6型)；激光共聚焦顯微鏡(日本FV-1000 Olympus)；戊二醛，鋨酸，丙酮，乙醇，Epon-812包埋劑，Mouse anti-cytokeratin18 (CK18)monoclonal antibody(clone CY90，Sigma，C8541)。

1.2免疫熒光及免疫組化染色

免疫熒光染色：取切片放于室溫，復溫水化后，5%羊血清室溫封閉30 min，加入小鼠抗CK18單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，加入FITC 標記山羊抗小鼠IgG(1∶50，北京中杉金橋生物技術有限公司，ZF-0312)，37 ℃孵育40 min。操作過程避光。除血清封閉后直接加入一抗外，其余過程中均用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次10 min。DAPI(碧云天生物公司，C1006)染細胞核，甘油封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

免疫組化染色：冷凍切片樣品于室溫復溫水化，其他步驟參照小鼠二步法免疫組織化學檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，PV-6002)說明書進行。一抗(小鼠抗PEDV S蛋白單克隆抗體，Cat no：9191，MEDIAN Diagnostics Inc，Korea)按1∶100稀釋，4 ℃冰箱過夜。鏡下控制DAB顯色5～15 min，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察和采集圖片。

1.3透射電鏡及掃描電鏡樣品制備

透射電鏡樣品制作：將固定的組織樣品用PBS洗滌4次，每次1 h；鋨酸后固定1 h，PBS洗滌4次，每次15 min；然后依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%的丙酮梯度脫水，每次約10 min；樹脂812浸透24 h，定向包埋聚合96 h，制作50 nm超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察、攝片。

掃描電鏡樣品制作：用0.1 mol·L-1，pH 7.0的PBS振蕩漂洗樣品三次，每次1 h；1%的鋨酸溶液固定樣品1 h，用0.1 mol·L-1，pH 7.0的PBS漂洗樣品3次，每次15 min；乙醇溶液對樣品進行梯度脫水處理，每種濃度處理20 min；100%的乙醇處理兩次，每次20 min；乙醇與醋酸異戊酯的混合液(V/V=1/1)處理樣品30 min，純醋酸異戊酯處理樣品1～2 h，臨界點干燥、鍍膜、觀察。

2結果

2.1正常仔豬回腸絨毛M細胞的分布特征

免疫熒光染色結果顯示，在仔豬回腸的絨毛上皮觀察到CK18+細胞的存在，這些CK18+細胞以密集型和分散型兩種形式鑲嵌于回腸絨毛上皮之間。沿隱窩至絨毛頂端方向，CK18+細胞的數(shù)量逐漸減少。另外，在回腸的隱窩及腺上皮處也觀察到CK18+細胞的存在(圖1A)。

A.回腸中絨毛M細胞的CK18免疫熒光結果(白色箭頭代表散在的M細胞，白色三角符號代表成簇的M細胞)；B.透射電鏡下回腸絨毛M細胞超微結構(其中G表示杯狀細胞，E為鄰近的上皮細胞)；C、D 和E.不同倍數(shù)掃描電鏡下回腸絨毛M細胞形態(tài)A.CK18 IFA of villous M cells in the ileum of piglets(white arrowheads and triangular symbols indicate diffuse and dense distribution of villous M cells，respectively)；B.The ultra-structural view of villous M cells in the ileum by transmission electron micrograph (G is a goblet cell and E indicate epithelial cells)；C，D and E.The morphology of ileal villous M cells in different magnifications by scanning electron micrograph.The scale bar for A is 100 μm and B is 5 μm；for C，D and E is 20 μm，10 μm and 5 μm，respectively圖1　仔豬回腸絨毛M細胞的分布及形態(tài)Fig.1　The distribution and morphology of villous M cells in the ileum

2.2正常仔豬回腸絨毛M細胞的超微結構特征

透射電鏡下，回腸絨毛M細胞在形態(tài)上呈現(xiàn)典型的袋狀，細胞質(zhì)電子密度較鄰近上皮細胞低，使其具有較大的細胞質(zhì)亮度。M細胞的頂端質(zhì)膜微絨毛較少，細胞表面不含分泌成分，頂部細胞質(zhì)中缺乏由微絲組成的終末網(wǎng)結構，細胞間通過連接復合體形成緊密連接。另外，M細胞細胞質(zhì)內(nèi)含有許多小的囊泡，但溶酶體較少。細胞核呈卵圓形，多位于細胞基底面(圖1B)。

與鄰近的其他絨毛上皮細胞相比，掃描電鏡下，正常仔豬回腸絨毛M細胞表面質(zhì)膜顏色較暗，多呈不規(guī)則的多角形，內(nèi)嵌于周圍上皮細胞之間，細胞表面微絨毛數(shù)量較少且較為短粗，這些較鈍的微絨毛在細胞表面形成微弱的脊狀突起及微皺褶結構(圖1C、D、E)。

2.3PEDV自然感染后的病毒分布及其引起的回腸絨毛M細胞形態(tài)學變化

對疑似PEDV感染的2日齡仔豬進行病原學檢測，RT-PCR結果顯示該仔豬為PEDV陽性，且傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬A群輪狀病毒(GARV)檢測結果均為陰性(圖2A)。取其回腸組織進行免疫組化染色及超薄切片。免疫組化結果顯示，PEDV顆粒主要以成簇的形式分布于仔豬回腸某些絨毛上皮細胞的細胞質(zhì)中，這些被病毒感染的絨毛上皮細胞具有與M細胞相似的分布特征，在這些上皮細胞的頂端質(zhì)膜、細胞核及其上皮下層也觀察到PEDV的存在(圖2B)。透射電鏡觀察結果顯示，PEDV自然感染后的回腸上皮微絨毛部分脫落，M細胞發(fā)生腫脹甚至壞死，細胞器遭到嚴重破壞，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等無完整的形態(tài)，細胞核腫大并出現(xiàn)移位(圖2C)。M細胞的細胞質(zhì)中含有明顯聚集成團的病毒顆粒，其大小在100 nm左右，與PEDV顆粒大小相符，而在與M細胞鄰近的其他上皮細胞形態(tài)結構較為完整，細胞質(zhì)中未觀察到病毒粒子的存在(圖2D、E)。另外，在絨毛M細胞的下方(靠近基底部)觀察到淋巴細胞及單核細胞浸潤(圖2F)。

A.RT-PCR檢測結果；B.免疫組化顯示分布于回腸某些絨毛上皮細胞頂膜(紅色箭頭)、細胞質(zhì)(黃色箭頭)，細胞核(綠色箭頭)及其上皮下層(白色箭頭)的PEDV顆粒；C.M細胞細胞核腫大并出現(xiàn)移位；D.M細胞的細胞器遭到破壞嚴重；E.較高放大倍數(shù)電鏡觀察結果(白色箭頭所示為存在于M細胞細胞質(zhì)中的PEDV)；F.絨毛M細胞下方存在淋巴細胞及單核細胞浸潤A.The detection for PEDV by reverse transcription polymerase chain reaction.Lane M.2-kb DNA ladder；lane 1.PEDV positive，a 894 bp DNA fragment was amplified；lane 2，3.TGEV and GARV negative；lane 4.Double distilled water negative control；B.PEDV were shown presented on the apical membrane(red arrowhead)，in the cytoplasm(yellow arrowhead)，around the nucleus(green arrowhead) and subepithelial by immunohistochemical staining of PEDV S protein；C.The nucleus of villous M cells become swollen and displaced；D.The organelles of M cell were destroyed severely；E.PEDV particles were observed in the cytoplasm of M cell by higher magnification(white arrowheads indicate PEDV in the cytoplasm of M cell)；F.Some monocytes and lymphocytes were infiltrated under the villous M cells.The scale bar for B，C，D，E，and F is 100 μm，2 μm，1.0 μm，0.5 μm and 4 μm，respectively圖2　PEDV自然感染后的病毒分布及其引起的回腸絨毛M細胞形態(tài)學變化Fig.2　The distribution of PEDV and morphological changes of piglet ileum villous M Cells with PEDV natural infection

3討論

黏膜免疫系統(tǒng)是動物有機體抵抗病原微生物入侵的第一道免疫屏障，自20世紀60年代黏膜免疫的概念首次被提出以來，就一直受到國內(nèi)外學者的關注。除極少數(shù)病原體通過節(jié)肢動物或其他動物的叮咬、注射、輸血等途徑入侵機體以外，絕大多數(shù)病原體都是通過黏膜入侵的[6]。M細胞是黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，研究M細胞在病原體跨越黏膜屏障中所發(fā)揮的作用，不但有助于進一步認識病原體的入侵機制，也為研究以M細胞為靶向的黏膜疫苗提供理論依據(jù)。

目前，大多數(shù)研究集中在關于淋巴結(圓頂區(qū))中M細胞的形態(tài)及功能[7-8]。而對絨毛上皮中M細胞的研究相對缺乏。A.Gebert等認為，豬的M細胞主要存在于濾泡相關上皮的圓頂區(qū)(dome)，在與淋巴濾泡和圓頂區(qū)緊鄰的腸絨毛上皮中偶爾發(fā)現(xiàn)M細胞的存在，而在遠離圓頂區(qū)的豬腸絨毛上皮中不存在M細胞[9]。然而，本研究采用免疫熒光和形態(tài)學方法證實，新生仔豬小腸遠離圓頂區(qū)的回腸絨毛上皮存在M細胞，且這些M細胞在絨毛的不同部位存在數(shù)量差異，這與之前的報道并不完全一致。

M細胞的形態(tài)在不同種類動物間既有共同之處，同時也存在差異，甚至同一動物不同部位也有差異[10]。人類腸道M細胞表面缺乏微絨毛，鼠M細胞表面的微絨毛短而不規(guī)則，而兔M細胞表面的微絨毛較其鄰近腸上皮細胞上的微絨毛長。豬回腸內(nèi)M細胞在隱窩上皮內(nèi)大多數(shù)呈現(xiàn)柱狀，并且從隱窩上皮到圓頂上皮內(nèi)，M細胞的形態(tài)呈現(xiàn)出由柱狀到“口袋狀”逐漸轉(zhuǎn)變[11]。另外，小鼠和人腸道PP結中的成熟M細胞呈圓頂狀，細胞基底部向頂部(腸腔面)深陷，形成一個較大的中央腔，腔內(nèi)含有豐富的淋巴細胞[12]。本研究利用透射電鏡觀察到新生仔豬回腸絨毛M細胞呈典型的袋狀，但其基底面并沒有形成典型的“拱狀”結構，這可能與切片的方向、動物種屬差異以及M細胞所處的不同部位和發(fā)育程度有關。另外，本研究同時對回腸的前段、中段和后段進行取材，但并沒有觀察到三部分之間存在明顯的形態(tài)學差異。

不同種類動物體內(nèi)M細胞具有特異的表面標志[13]。CK18作為豬的M細胞表面標志物已經(jīng)得到證實[9]。本研究利用CK18的單克隆抗體進行免疫熒光試驗，結果表明，仔豬回腸絨毛上皮存在M細胞，沿隱窩至絨毛頂端上皮方向，M細胞數(shù)量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢。另外，作者在回腸的隱窩及腺上皮也觀察到CK18+細胞的存在，這可能跟M細胞的起源及分化有關。有報道認為，M細胞可能起源于淋巴濾泡周圍隱窩中的干細胞，沿隱窩至絨毛頂端上皮方向M細胞可能具有不同的分化和遷移速率[14]。

回腸是腸道病原體感染及炎癥多發(fā)部位，一些病原體主要通過回腸FAE中的M細胞感染人和動物的腸道[15-17]。薄清如等認為，PEDV主要侵襲、感染仔豬小腸絨毛上皮細胞，以回腸中后部病毒含量最高[18]。本研究首先通過病原學檢測確定試驗仔豬為PEDV感染，采用免疫組化證實了PEDV在仔豬回腸某些絨毛上皮細胞的頂膜、細胞質(zhì)、細胞核及其上皮下層的分布，采用透射電鏡進一步驗證了這些被病毒感染的絨毛上皮細胞為M細胞。另外，研究過程中作者也僅在回腸絨毛M細胞中觀察到PEDV粒子的存在，而在十二指腸和空腸絨毛M細胞中均沒有觀察到病毒顆粒(數(shù)據(jù)沒有顯示)，以上結果暗示了仔豬回腸絨毛M細胞可能是PEDV感染的重要通道。由于實驗條件的限制，本研究僅對自然感染條件下的PEDV與回腸絨毛M細胞之間的關系進行了初步探索，下一步將在分離病毒的基礎上構建PEDV人工感染模型，從而對PEDV與腸道M細胞之間的關系開展更加深入的研究。

本研究首次對新生仔豬回腸絨毛M細胞的形態(tài)及分布特征進行了報道，并初步探索自然感染情況下PEDV與回腸絨毛M細胞的關系。這為進一步研究PEDV的致病機制和M細胞的免疫學功能奠定了基礎。

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(編輯白永平)

Morphological and Distribution Characteristics of Villous M Cells in the Ileum of Newborn Piglets and the Association with PEDV Infection

LI Ren-feng1，2，4，TIAN Xiang-qin5，QIAO Song-lin2*，GUO Jun-qing2，ZHOU En-min4，ZHANG Gai-ping3*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China；2.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China; 4.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；5.KeyOpenLaboratoryforTissueRegenerationofHenanUniversities，XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453003，China)

Abstract:The aim of this study was to identify the presence of villous M cells in the ileum of newborn piglets and determine the distribution pattern，morphological characteristics and the association with PEDV infection by immunofluorescence assay(IFA)，immunohistochemistry(IHC) and morphological methods.IFA showed a gradually decreased density of villous M cells from lower crypt epithelium to upper villous epithelium.The villous M cells showed typical morphological characteristics of M cells by electron microscope.After infected with PEDV，villous M cells in the ileum exhibited pathological changes obviously.The virus particles of PEDV were observed on the apical membrane，in the cytoplasm，around the nucleus and subepithelial of villous M cells by immunohistochemical staining of PEDV S protein，which were not observed in its adjacent epithelial cells.This study demonstrated the presence of villous M cells in the ileum of newborn piglets and determine the distribution pattern，morphological characteristics and the association with PEDV infection，suggesting the villous M cells in the ileum may be an important entry for PEDV invasion.

Key words:intestinal villous M cells；newborn piglets；porcine epidemic diarrhea virus

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.022

收稿日期：2015-08-17

基金項目：國家生豬產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-36)；河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊(S2012-06)

作者簡介：李任峰(1978-)，男，河南駐馬店人，博士生，主要從事動物病原學與免疫學研究，E-mail：lirenfeng@sina.com *通信作者：張改平，研究員，E-mail：zhanggaiping2003@163.com；喬松林，研究員，E-mail：cdj565@gmail.com

中圖分類號：S852.16；S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0581-06