不同生長時期梅花鹿鹿茸差異蛋白質(zhì)組學分析

張然然，劉華淼，邵元臣，周盼伊，蘇　瑩，王　磊，邢秀梅

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，長春 130112)

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不同生長時期梅花鹿鹿茸差異蛋白質(zhì)組學分析

張然然，劉華淼，邵元臣，周盼伊，蘇瑩，王磊，邢秀梅*

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，長春 130112)

摘要：旨在從分子水平認識鹿茸生長機制，本研究以10、40、60與130d的梅花鹿鹿茸為試驗材料，運用雙向凝膠電泳(2-DE)、質(zhì)譜鑒定技術與生物信息學方法對梅花鹿鹿茸生長過程中差異表達蛋白質(zhì)進行研究。結(jié)果顯示，有46種蛋白質(zhì)差異性表達，且主要參與細胞骨架、轉(zhuǎn)運過程、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、骨發(fā)育、蛋白質(zhì)合成、核酸代謝、免疫、能量代謝、細胞增殖、抗氧化、蛋白質(zhì)折疊等生物學過程。結(jié)合鹿茸的快速生長與快速骨化的獨特生長過程，對差異表達蛋白質(zhì)中的骨發(fā)育相關蛋白、抗氧化蛋白、細胞凋亡相關蛋白做進一步分析，發(fā)現(xiàn)P4HB、SPARC、過氧化物還原酶2、過氧化物還原酶4、半乳糖凝集素1、視黃酸結(jié)合蛋白1等6種蛋白質(zhì)在鹿茸快速生長與快速骨化過程中起著重要的作用，為鹿茸生長與骨化機制的進一步研究奠定基礎。

關鍵詞：梅花鹿；鹿茸；不同生長時期；雙向凝膠電泳；蛋白質(zhì)組學

鹿茸是唯一完全再生的哺乳動物器官，并具有獨特的生長過程。每年春天鹿角自動脫落，并從角柄上長出新鹿茸，隨后快速生長并形成分支，秋天鹿茸的生長速度變慢，軟骨組織逐漸骨化形成硬骨，次年春天再次脫落，開始新一輪的循環(huán)。鹿茸的生長可分為兩個階段：生長期與骨化期。在生長期，鹿茸生長速度驚人，最高可達2.75cm·d-1(加拿大馬鹿)[1]，同時還伴隨著皮膚、神經(jīng)與血管的快速生長；在骨化期，鹿茸的骨化速度急劇加快，并完成皮膚、血管、神經(jīng)的退化過程。鹿茸快速生長與快速骨化的機制一直是生物學家研究的重點，但迄今仍未取得突破性進展。隨著蛋白質(zhì)組學技術逐漸發(fā)展成熟，可從整體水平上揭示蛋白質(zhì)表達特征，實現(xiàn)對生物體功能的解析?，F(xiàn)今蛋白質(zhì)組學技術也逐漸應用于鹿茸生長機制的探究，如韓國學者H.J.Park等首次采用雙向凝膠電泳結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜技術建立鹿茸蛋白質(zhì)表達譜，并成功鑒定出130種蛋白質(zhì)[2]，使人們對鹿茸蛋白質(zhì)表達特征有初步了解。

本研究以不同生長時期梅花鹿鹿茸為試驗材料，應用雙向凝膠電泳與MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定技術揭示鹿茸生長過程中蛋白質(zhì)表達特征，從分子水平進一步認識鹿茸的生長與骨化過程。

1材料與方法

1.1化學試劑

尿素、硫脲、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、兩性電解質(zhì)(Bio-Lyte，pH3～10)、Clean-upKit蛋白純化試劑盒、固定化的pH梯度膠條(pH4～7，非線性)、礦物油、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)、Tris堿、過硫酸銨(AP)、甘氨酸均為Bio-Rad公司產(chǎn)品(Hercules，CA，USA)；牛血清白蛋白(BSA)為Sigma公司產(chǎn)品(St.Louis，MO，USA)；胰酶為Roche公司產(chǎn)品(Mannheim，Germany)；甲醇、碳酸氫銨、三氟乙酸、乙腈、甲酸、甘油甲醛購自長春試劑公司。

圖1　不同生長時期梅花鹿鹿茸組織Fig.1　Velvet antlers of sika deer in different growth stages

1.2試驗樣品

鹿茸均取自中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所中心鹿場5歲梅花鹿，取樣時間分別為10、40、60與130d。

1.3蛋白質(zhì)提取

新鮮鹿茸組織切成1mm×1mm小塊，PBS洗去鹿茸組織表面的血液及雜質(zhì)，液氮研磨機研磨成細粉。取2g細粉加入10mL蛋白質(zhì)裂解液(7mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲、4%CHAPS、65mmol·L-1DTT、0.2%Bio-Lyte、1%PMS)，超聲3min，冰上裂解2h，每隔30min，振蕩器震蕩1min。4 ℃ 20 000g離心15min，收集上清液，使用2D-cleanup蛋白純化試劑盒進一步除去蛋白質(zhì)溶液中的脂類等雜質(zhì)。

1.4蛋白質(zhì)濃度測定

Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度[3]，BSA作標準曲線，測定595nm波長處的吸光度。

1.5雙向電泳

梅花鹿鹿茸雙向凝膠電泳采用pH4～7，17cmIPG非線性膠條，加入300μL蛋白質(zhì)溶液，等電聚焦程序設置：50V水化 14h；100V快速升壓1.5h；200V快速升壓1.5h；500V快速升壓1h；1 000V快速升壓1.5h；10 000V線性升壓6h；10 000V快速升壓，最終累積增壓達到70 000V，完成蛋白質(zhì)等電聚焦。

將等電聚焦完全的膠條從聚焦盤中取出，濕潤濾紙擦去膠條表面的礦物油，置于5mL膠條平衡緩沖液I中(6mol·L-1尿素、1%DTT、2%SDS、30%甘油和0.375mol·L-1Tris-HCl)，搖床上平衡15min，時間不易過長。取出膠條，擦去表面殘余液體，然后置于5mL膠條平衡緩沖液II(6mol·L-1尿素、2.5%碘乙酰胺、2%SDS、30%甘油和0.375mol·L-1Tris-HClpH8.8)，搖床上避光平衡15min。完成后，將膠條轉(zhuǎn)移至聚丙烯酰胺分離膠上(1.0mm厚，12%T)，0.5%低熔點瓊脂糖封膠液封膠，使用PROTEANxiCellII(Bio-RadHercules，CA，USA)系統(tǒng)，15mA·gel-1電泳1h，30mA·gel-1電泳至溴酚藍到達膠下緣0.5cm。采用考馬斯亮藍G250染色法對 2-DE膠進行染色。

1.6凝膠掃描及質(zhì)譜鑒定

凝膠用掃描儀進行掃描，分辨率為300dpi。每一時期分別進行3次生物學重復。凝膠圖像用伯樂公司PDQuestTM8.0(Bio-RadHercules，CA，USA)圖像分析軟件進行圖像剪裁、蛋白質(zhì)點檢測、凝膠匹配分析等步驟。將相對體積比在2倍以上的蛋白質(zhì)點視為表達差異蛋白質(zhì)。手動切取凝膠上的差異蛋白質(zhì)點，并送至國家蛋白質(zhì)組中心進行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析。使用Mascot軟件對質(zhì)譜序列進行檢索。檢索條件：數(shù)據(jù)庫為NCBInr；允許有1個不完全裂解位點；固定修飾為[Carboxymethyl(C)]或者[Carbamidomethyl(C)]；可變修飾為[Oxidation(M)]；離子選擇MH+和單同位素；肽段質(zhì)量數(shù)最大容許誤差范圍是±0.2D。匹配肽段數(shù)≥2；氨基酸序列覆蓋率>5%；分值≥80分(P<0.05)，被認為是鑒定成功的蛋白質(zhì)。

2結(jié)果

2.1不同生長時期梅花鹿鹿茸蛋白質(zhì)表達圖譜分析

為了解梅花鹿鹿茸在不同生長時期蛋白質(zhì)表達特征，選取10d(鹿茸生長初期)、40d(二杠茸生長末期)、60d(三杈茸生長末期)、130d(茸皮脫落)的梅花鹿鹿茸組織為試驗材料，運用比較蛋白質(zhì)組學方法，獲得不同生長時期梅花鹿鹿茸雙向凝膠電泳圖譜，每個時期樣品分別進行3次雙向凝膠電泳試驗。通過PDQuestTM軟件對雙向凝膠圖譜進行分析發(fā)現(xiàn)，10、40、60和130d樣品分別檢測到(511±7.62)、(559±7.84)、(494±6.23)、(261±5.46)個蛋白質(zhì)點，其中63個蛋白點的表達豐度存在顯著差異。

2.2差異表達蛋白質(zhì)的鑒定與分類

差異蛋白點經(jīng)挖點、膠內(nèi)酶解，以及生物公司質(zhì)譜鑒定分析，并采用Mascot軟件檢索，63個差異蛋白點中的46個成功鑒定，蛋白質(zhì)鑒定成功率約為73%。并對成功鑒定的46個差異蛋白質(zhì)進行生物學功能分類，結(jié)果詳見表1。它們分別參與細胞骨架、轉(zhuǎn)運過程、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、骨發(fā)育、蛋白質(zhì)合成、核酸代謝、免疫、能量代謝、細胞增殖、抗氧化、蛋白質(zhì)折疊等生物學過程。其中細胞骨架蛋白質(zhì)最多(13個)，占差異蛋白質(zhì)總數(shù)的29%，其次是轉(zhuǎn)運過程、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、骨發(fā)育相關蛋白，分別有4個，占總差異蛋白質(zhì)的9%，各類別蛋白質(zhì)在成功鑒定的差異蛋白質(zhì)總數(shù)中所占比例見圖3。

數(shù)字標出的點為鑒定蛋白質(zhì)點 The marked spots were identified圖2　梅花鹿鹿茸蛋白質(zhì)2-DE圖譜Fig.2　2-DE proteome profile of velvet antler of sika deer with different stages

表1　不同生長時期梅花鹿鹿茸差異表達蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果與功能分類

表1(續(xù))

表1(續(xù))

圖3　不同生長時期梅花鹿鹿茸差異表達蛋白質(zhì)功能分類Fig.3　Functional categories of the differentially expressed proteins of sika deer in different growth stages

2.3差異蛋白質(zhì)層次聚類

使用Cluster3.0軟件對46種差異蛋白質(zhì)進行聚類分析，結(jié)果顯示，10、40、60與130d鹿茸組織中分別有6、22、12與6個蛋白質(zhì)表達上調(diào)。其中，10d鹿茸組織表達上調(diào)的6個蛋白質(zhì)中包括蛋白質(zhì)合成相關蛋白1個(點9)，核酸代謝蛋白1個(點29)，能量代謝蛋白1個(點30)，細胞骨架蛋白1個(點43)，細胞增殖蛋白1個(點50)，信號轉(zhuǎn)導蛋白1個(點19)；40d表達上調(diào)的22個蛋白質(zhì)中包括細胞骨架蛋白6個(點12、點47、點6、點1、點13、點15)，細胞凋亡蛋白4個(點17、點48、點52、點5)，骨發(fā)育蛋白3個(點3、點40、點46)，信號轉(zhuǎn)導蛋白3個(點22、點41、點51)，轉(zhuǎn)運蛋白2個(點20、點8)，蛋白質(zhì)合成相關蛋白1個(點14)，能量代謝蛋白1個(點38)，細胞增值蛋白1個(點2)及未知功能蛋白1個(點16)；60d表達上調(diào)的12個蛋白質(zhì)中包括細胞骨架蛋白3個(點32、點7、點28)，轉(zhuǎn)運蛋白2個(點25、點23)，抗氧化蛋白2個(點26、點31)，核酸代謝蛋白1個(點37)，蛋白質(zhì)合成相關蛋白1個(點21)、骨發(fā)育蛋白1個(點34)，免疫蛋白1個(點33)，未知功能蛋白1個(點4)，；130d表達上調(diào)的6個蛋白質(zhì)中包括細胞骨架蛋白4個(點42、點45、點10、點11)，蛋白質(zhì)合成相關1個(點36)，免疫蛋白1個(點44)。

上調(diào)蛋白質(zhì)和下調(diào)蛋白分別用紅色和綠色條帶，顏色的深淺代表蛋白質(zhì)表達量的差異The up- or down-regulated proteins are indicated in red and blue，respectively.The intensity of the colors increases with increasing expression differences as shown on the top of the indicator圖4　差異蛋白質(zhì)層次聚類分析Fig.4　Hierarchical clustering of significant differential proteins

3討論

鹿茸具有獨特的生長過程，其快速生長與快速骨化的機制一直是生物學家研究的重點。本研究中發(fā)現(xiàn)有46種蛋白質(zhì)在鹿茸生長過程中發(fā)生顯著性差異表達，且主要參與了12個生物學過程，其中骨發(fā)育、抗氧化與細胞凋亡生物過程在鹿茸的快速生長與骨化過程中尤為重要。

鹿茸的快速生長是通過軟骨內(nèi)骨化過程實現(xiàn)的，軟骨細胞增殖、分化為肥大軟骨細胞，然后逐漸被骨組織所代替[4]。本研究中鑒定出4種骨發(fā)育相關蛋白質(zhì)，并在鹿茸生長過程中發(fā)生了顯著性差異表達，分別為Ⅰ型膠原蛋白前體、Ⅱ型膠原蛋白、P4HB、SPARC。其中P4HB與SPARC可促進膠原蛋白的折疊、加工、分泌與成熟，在骨重建及骨量維持中具有重要作用[5-7]。另外，SPARC可趨化并誘導多能間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，是正常成骨細胞形成、成熟和存活所必須的因子[8-10]。鹿茸生長過程中P4HB與SPARC表達水平的變化預示著這兩種蛋白可能與鹿茸骨化過程的發(fā)生與發(fā)展密切相關。

鹿茸旺盛的代謝活動勢必會產(chǎn)生較多的活性氧，如氧離子、過氧化氫、羥基自由基等，這些物質(zhì)的大量積累會導致細胞結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、生物大分子的破壞，嚴重時可導致細胞和組織的死亡[11]。研究顯示，抗氧化蛋白過氧化物酶廣泛存在于鹿茸組織中，包括過氧化物還原酶1、過氧化物還原酶2、過氧化物還原酶3、過氧化物還原酶4、過氧化物還原酶6[12-14]，其中過氧化物還原酶2與過氧化物還原酶4的表達水平在鹿茸生長過程中發(fā)生了顯著性變化。過氧化物還原酶除了抗氧化活性，還參與各種生物功能，例如細胞增殖、分化、凋亡、基因表達、細胞內(nèi)信號傳導等生物過程[15-16]。其中過氧化物還原酶2又稱為自然殺傷細胞增強因子(NK-EF-B)，能夠在細胞病變或者受到嚴重損傷時保護組織免受進一步的損害，而且能增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的抵抗能力[17]。本研究結(jié)果顯示，過氧化物還原酶2與過氧化物還原酶4的表達量隨鹿茸生長速度的增快而逐漸增加，表明在鹿茸快速生長過程中過氧化物還原酶在抵抗氧化損傷中發(fā)揮著極其重要的作用。

鹿茸的快速生長主要取決于其生長中心細胞的分裂繁殖速度，其速度比癌細胞還要快三十幾倍[18]，但在如此快速生長狀態(tài)下，鹿茸并沒有出現(xiàn)癌變的跡象，而是有條不紊的完成自身的快速生長過程，所以鹿茸可能具有一種特殊的調(diào)控機制防止癌變的發(fā)生。本研究中發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素1在鹿茸生長過程中發(fā)生了顯著差異表達，該蛋白是一種細胞凋亡相關蛋白，也是鹿茸干細胞重要的信號分子[14]，可通過與NANOG、MYCN與SMAD4相互作用參與角柄骨膜干細胞的14-3-3信號通路，從而促進角柄骨膜干細胞的分化過程，在鹿茸生長過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。在人體內(nèi)，半乳糖凝集素1的過表達通常會引起癌癥的發(fā)生，而鹿茸中半乳糖凝集素的過表達并沒有引起鹿茸組織的癌變。半乳糖凝集素1的表達通常受多種因子的調(diào)控，包括視黃酸[19]。視黃酸作為一種重要的信號分子，不僅能夠調(diào)控蠑螈斷肢的再生[20]，還能夠調(diào)控成骨細胞與破骨細胞的分化過程[21]，在鹿茸再生中起重要調(diào)控作用。本研究中發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素1與視黃酸結(jié)合蛋白1的表達模式是一致的，因此推測視黃酸可能是調(diào)控半乳糖凝集素1防止鹿茸癌變的重要信號分子之一。

4結(jié)論

本研究通過蛋白質(zhì)組學技術對梅花鹿鹿茸生長過程中蛋白質(zhì)表達特征有了初步了解，又結(jié)合鹿茸的快速生長與快速骨化的獨特生長過程，對差異表達蛋白質(zhì)中的骨發(fā)育相關蛋白、抗氧化蛋白、細胞凋亡相關蛋白作進一步分析，并發(fā)現(xiàn)P4HB、SPARC、過氧化物還原酶2、過氧化物還原酶4、半乳糖凝集素1、視黃酸結(jié)合蛋白1在鹿茸的快速生長與快速骨化過程中起著重要的作用，為鹿茸生長與骨化機制的進一步研究奠定基礎。

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(編輯 程金華)

ComparativeProteomicAnalysisinDifferentGrowthStagesofSikaDeerVelvetAntler

ZHANGRan-ran，LIUHua-miao，SHAOYuan-chen，ZHOUPan-yi，SUYing，WANGLei，XINGXiu-mei*

(State Key Laboratory of Special Economic Animal Molecular Biology，Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130112，China)

Abstract:Tounderstandthevelvetantlerdevelopmentmechanisminthelevelmolecularbiology，proteomedifferencesofthesikadeervelvetantlersaged10，40，60and130dwerecomparedusing2-DE，massspectrometryandbioinformatics.Therefore，46proteinswerealteredtheirexpressionsinthesikadeervelvetantlersaged10，40，60and130d，whichwereinvolvedincytoskeleton，transportation，signaltransduction，apoptoticprocess，bonedevelopment，proteinsynthesis，nucleotidebiosynthesis，immunity，energymetabolism，cellproliferationandantioxidantactivityandproteinfolding.Wefocusedontheproteinsinvolvedinbonedevelopment，antioxidantactivityandapoptoticprocessduetothespecialgrowthprocesswithrapidlygrowthandossification.Therefore，Theresultsshowedthatseveralproteins(P4HB，SPARC，peroxiredoxin2，peroxiredoxin4，galectin1andretinoicacidbindingprotein1)mightplayvitalroleinthevelvetantlergrowthandossificationprocess.Takentogether，theresultprovidedabasisforfurtherresearchonthemolecularmechanismsinvolvedintheacceleratedgrowthandossificationofdeervelvetantler.

Keywords:sikadeer；velvetantler；differentgrowthstages；twodimensionalgelelectrophoresis；proteome

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.010

收稿日期：2015-07-30

基金項目：特種動物遺傳資源創(chuàng)新團隊(CAAS-ASTIP-201X-ISAPS)；特種動物種質(zhì)資源平臺

作者簡介：張然然(1990-)，女，河北衡水人，碩士，主要從事特種經(jīng)濟動物種質(zhì)資源保護與遺傳育種研究，E-mail：heavenranran@163.com *通信作者：邢秀梅，研究員，E-mail：xingxiumei2004@126.com

中圖分類號：S825.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0493-09