宿主細(xì)胞F-actin聚集在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵過(guò)程中的作用研究

吳彩艷，王　禎，李　娟，林栩慧，廖申權(quán)，戚南山，呂敏娜，孫銘飛*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

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宿主細(xì)胞F-actin聚集在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵過(guò)程中的作用研究

吳彩艷1，2#，王禎1，2#，李娟1，林栩慧1，廖申權(quán)1，戚南山1，呂敏娜1，孫銘飛1*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

摘要：病原入侵宿主細(xì)胞，由宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(F-actin)聚集引起的細(xì)胞骨架重排起著極其重要的作用，本文主要就宿主細(xì)胞整合素介導(dǎo)的宿主細(xì)胞F-actin聚集重排在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵過(guò)程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)的闡述，對(duì)解析頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)的入侵機(jī)制及以此研制新型寄生蟲(chóng)病藥物和疫苗具有非常重要的意義。

關(guān)鍵詞：頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)；宿主細(xì)胞；F-actin聚集；入侵

頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)是一類(lèi)專(zhuān)一性的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，種類(lèi)繁多，分布廣泛，主要包括弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)、隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumspp. )、瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumspp.)、巴貝斯蟲(chóng)(Babesiaspp.)及艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriaspp.) 等，是人和動(dòng)物的重要病原，常引起人和動(dòng)物死亡[1-3]。這類(lèi)原蟲(chóng)具有相似的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)——由極環(huán)、棒狀體、微絲體、類(lèi)錐體和膜下微管等組成的頂復(fù)合器(apical complex)。頂復(fù)合器不僅是該類(lèi)寄生蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)上的標(biāo)志，而且使頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)具有保守的入侵宿主細(xì)胞機(jī)制[4-5]。因此入侵機(jī)制的研究對(duì)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)具有普遍意義，諸多研究發(fā)現(xiàn)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)在入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中，首先由蟲(chóng)體的多種入侵相關(guān)蛋白質(zhì)分子(如微線、棒狀體及致密顆粒分泌相關(guān)蛋白質(zhì))黏附宿主細(xì)胞，而后激活宿主細(xì)胞F-actin聚集引起細(xì)胞骨架重排，從而實(shí)現(xiàn)蟲(chóng)體侵入宿主細(xì)胞[6]。

1頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵與宿主細(xì)胞F-actin聚集的關(guān)系

1.1肌動(dòng)蛋白在宿主細(xì)胞骨架組成中的重要作用

肌動(dòng)蛋白是一類(lèi)高度保守的蛋白質(zhì)，存在于所有真核細(xì)胞中，參與細(xì)胞分裂、運(yùn)動(dòng)、遷移、變形、收縮、生長(zhǎng)等多種重要生理活動(dòng)。在細(xì)胞中有兩種基本形式，以單體(globular actin monomer，G-actin) 和寡聚體及聚合體(filament actin，F(xiàn)-actin) 形式存在，執(zhí)行不同的生理功能，聚合與非聚合形式的肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中處于一種動(dòng)態(tài)平衡[7]。其中F-actin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性，以及在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞分化等方面起重要作用[8-9]。構(gòu)成細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)通過(guò)與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，控制 F-actin的裝配與拆卸，調(diào)節(jié)F-actin的長(zhǎng)度、極性、穩(wěn)定性和三維結(jié)構(gòu)，并將 F-actin與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的其他成分相連接，行使細(xì)胞的多種生物學(xué)功能[10]。其中屬于此類(lèi)蛋白質(zhì)的肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin filament-depolymerizing protein)在近年的研究中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，并認(rèn)為在細(xì)胞骨架重構(gòu)和收縮的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。

1.2頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵與宿主細(xì)胞 F-actin聚集密切相關(guān)

幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)病原微生物入侵均是由宿主細(xì)胞F-actin聚集引起細(xì)胞骨架重排實(shí)現(xiàn)的[12]。頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程包括黏附和侵入兩個(gè)階段，研究認(rèn)為，宿主細(xì)胞F-actin聚集重排發(fā)生在蟲(chóng)體侵入階段[13]。T.gondii進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞不僅是一個(gè)積極主動(dòng)的入侵過(guò)程，而且伴隨著宿主細(xì)胞骨架重排；入侵行為的發(fā)生依賴(lài)蟲(chóng)體自身的動(dòng)力與F-actin聚集引起的宿主細(xì)胞骨架重排二者共同作用，并推測(cè)這一現(xiàn)象可以延伸至整個(gè)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)[14]。為進(jìn)一步驗(yàn)證這種推測(cè)，利用毒傘素(phalloidin)染色證實(shí)C.parvnm在感染宿主細(xì)胞過(guò)程中，F(xiàn)-actin聚集于宿主細(xì)胞與蟲(chóng)體的交界處，隨著蟲(chóng)體的發(fā)育，F(xiàn)-actin聚集的長(zhǎng)度增加，并且F-actin只存在于黏附部位，而非整個(gè)蟲(chóng)體；在黏附部位由蟲(chóng)體頂端分泌多種蛋白質(zhì)(如微線蛋白、蛋白激酶、熱激蛋白等)黏附于宿主細(xì)胞，同時(shí)宿主細(xì)胞上的受體被激活，進(jìn)而通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)通路激發(fā)F-actin聚集，進(jìn)而引起細(xì)胞骨架發(fā)生重排，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)蟲(chóng)體的入侵[15]。當(dāng)C.parvnm感染HCT-8細(xì)胞30 s即可檢測(cè)到酪氨酸磷酸化，酪氨酸磷酸化被認(rèn)為與F-actin聚集相關(guān)，入侵30 min后，在蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞黏附部位即可檢測(cè)到F-actin聚集，且聚集的F-actin來(lái)源于宿主細(xì)胞，由宿主細(xì)胞F-actin聚集引起的細(xì)胞骨架重排一直持續(xù)到納蟲(chóng)空泡形成[16]。同樣P.falciparum在入侵HCT-8細(xì)胞過(guò)程中，F(xiàn)-actin聚集依賴(lài)的動(dòng)力也來(lái)源于宿主細(xì)胞骨架蛋白的磷酸化[17]。

利用抑制F-actin聚集的抑制劑——細(xì)胞松弛素D(cytochalasin D)孵育HCT-8細(xì)胞后，感染C.parvnm，結(jié)果入侵率明顯下降，當(dāng)抑制劑去除后，抑制作用還可以持續(xù)24 h，說(shuō)明宿主細(xì)胞F-actin聚集在C.parvnm感染的早期發(fā)揮作用[18]。將E.tenella子孢子感染以Cytochalasin D處理的MDBK細(xì)胞，子孢子的入侵率也顯著下降，免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示MDBK與Cytochalasin D共孵育后F-actin聚集明顯減少，由于Cytochalasin D破壞了細(xì)胞微絲的形成從而阻礙了F-actin的聚集，進(jìn)而抑制E.tenella入侵宿主細(xì)胞[19]。在T.gondii感染宿主細(xì)胞過(guò)程中，也有類(lèi)似結(jié)果[20]。

因此在蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞F-actin聚集是必需的[20-21]。

1.3頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵過(guò)程中宿主細(xì)胞 F-actin聚集重排通路的形成

對(duì)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)(如T.gondii、C.parvnm、P.falciparum等)入侵機(jī)制的研究顯示，蟲(chóng)體在入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中，宿主細(xì)胞F-actin聚集重排起著非常重要的作用[22]。

宿主細(xì)胞 F-actin 聚集重排引起細(xì)胞骨架發(fā)生改變，是所有細(xì)胞內(nèi)感染病原微生物的關(guān)鍵[23]。宿主細(xì)胞 F-actin 的聚集重排是通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的[24-25]，外源微生物分泌的相關(guān)蛋白質(zhì)、胞外信號(hào)激活蛋白(如腫瘤轉(zhuǎn)移信號(hào)蛋白等)與宿主細(xì)胞膜上的相關(guān)受體蛋白質(zhì)[如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、整合素(integrin)、G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)等]互作[26-27]，然后啟動(dòng)一系列不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如 FAK-c-Src-Cortacin、PI3K-Cdc42-WASP-Arp2/3、Ras-ERK-Calpain-TK、PI3K-Akt、RhoA-PKC-MAP、Rac-PAK-LIMK 和 PIP5K-PIP2-Profilin 等，最終在 ADF /cofilin 家族蛋白、皮層肌動(dòng)蛋白(cortactin)和鈣離子等參與下使宿主細(xì)胞的 F-actin 發(fā)生了聚集重排[28-29]。而宿主細(xì)胞 F-actin 聚集重排引起的細(xì)胞骨架改變，正向調(diào)節(jié)病原微生物的入侵[30]。

不同細(xì)胞內(nèi)感染的微生物所誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞聚集F-actin的機(jī)制不盡相同，C.parvnm將F-actin作為形成連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的重要組成部分，與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合，因此推斷F-actin在C.parvnm入侵過(guò)程中可能扮演一個(gè)更加積極主動(dòng)的角色[31]。在C.parvnm與HCT-8細(xì)胞黏附部位可以檢測(cè)到促使F-actin聚集的蛋白質(zhì)，如肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(Arp2/3complex)，血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)和綜合征蛋白(N-WASP)[32]。這些黏合蛋白通過(guò)與F-actin相互作用來(lái)調(diào)節(jié)F-actin的聚集，并與其他蛋白質(zhì)連接形成F-actin網(wǎng)絡(luò)，使單體actin分子聚合成螺旋形的F-actin[33]。而T.gondii沒(méi)有像C.parvnm一樣將宿主細(xì)胞F-actin形成連接復(fù)合體，而是將F-actin高度聚集形成了actin噬斑，在每個(gè)分子復(fù)合物中，F(xiàn)-actin作為結(jié)合分子都被結(jié)合到細(xì)胞膜蛋白上，并且在入侵的早期未檢測(cè)到酪氨酸磷酸化[34]。

2Integrin介導(dǎo)的宿主細(xì)胞F-actin聚集重排在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵過(guò)程中的作用

2.1Integrin的組成及生物學(xué)作用

Integrin是一類(lèi)位于細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和功能相似的糖蛋白，是細(xì)胞表面具有黏附和轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的受體，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖、黏附、分化等方面起著重要作用[35-36]。該類(lèi)蛋白質(zhì)是由α、β亞基通過(guò)非共價(jià)鍵組成具有功能的異二聚體，每個(gè)亞基都有一個(gè)較長(zhǎng)的胞外域、一個(gè)跨膜域和一個(gè)較短的胞內(nèi)域(圖1)。其中胞外域與細(xì)胞外基質(zhì)(cell-extra-cellular matrix，ECM)結(jié)合，識(shí)別配體分子中的特定序列，跨膜域可以與許多細(xì)胞因子及其可溶性調(diào)節(jié)因子共同作用而調(diào)節(jié)整合素的功能，胞內(nèi)域可與α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)、紐蛋白(vinculin)、踝蛋白(talin)、張力蛋白(tensin)等細(xì)胞骨架蛋白相連接，通過(guò)這些細(xì)胞骨架蛋白最終連接到actin，引起細(xì)胞形態(tài)的變化，也可直接或間接與連接蛋白結(jié)合而激活胞內(nèi)酶鏈系統(tǒng)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外之間的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[35-36]。

2.2Integrin介導(dǎo)的宿主細(xì)胞F-actin聚集重排信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

在激活宿主細(xì)胞F-actin聚集重排信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的眾多受體中，Integrin被認(rèn)為是最重要的受體，參與細(xì)胞骨架的形成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在外源微生物入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起主導(dǎo)作用[37]。由Integrin介導(dǎo)的人類(lèi)細(xì)胞F-actin聚集信號(hào)通路顯示：宿主細(xì)胞的Integrin主要通過(guò)下游的黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、非受體酪氨酸激酶(c-Src)、磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositide3-kinase，PI3K)、整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)、RAS致癌同源蛋白(ras homologus oncogenes，Rho)、癌癥相關(guān)蛋白(Rac和Cdc42-WASP-Arp2/3)等幾個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活了細(xì)胞表面F-actin的聚集，從而引起細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了外源微生物的入侵[38]。當(dāng)宿主細(xì)胞受到刺激后，Integrin的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有雙向性：(1)激動(dòng)劑作用后，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子與Integrin胞內(nèi)段相互作用，產(chǎn)生內(nèi)向外信號(hào)(inside-out signal)，導(dǎo)致Integrin活化，將Integrin從對(duì)ECM、可溶性蛋白質(zhì)等配體的低親和狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和狀態(tài)，上調(diào)Integrin受體與配體的結(jié)合能力。(2)Integrin活化后，配體與Integrin胞外段結(jié)合，產(chǎn)生外向內(nèi)信號(hào)(outside-in signal)，F(xiàn)-actin聚集引起細(xì)胞骨架發(fā)生重排[39]。

圖1　整合素、編輯蛋白和信號(hào)通路[33]Fig.1　Integrins，adaptor proteins，and signaling pathways

2.3Integrin對(duì)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵的作用

當(dāng)Integrin的活性發(fā)生改變時(shí)，其介導(dǎo)的宿主細(xì)胞F-actin聚集亦發(fā)生相應(yīng)的變化，直接影響基質(zhì)與細(xì)胞骨架的相互作用。亞細(xì)胞定位顯示Integrin 家族成員之一的Integrin α2(ITGA2)基因表達(dá)的蛋白在宿主細(xì)胞與C.parvnm接觸部位維持較高水平。分別利用抗Integrin的兩個(gè)亞基——ITGA2和ITGB1單克隆抗體孵育HCT-8細(xì)胞后，感染C.parvnm后入侵率均發(fā)生下降；ITGA2基因敲除細(xì)胞感染C.parvnm，導(dǎo)致其入侵率下降；將C.parvnm感染ITGA2基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞后，其入侵率上升[40]。由此說(shuō)明HCT-8細(xì)胞的ITGA2和ITGB1基因都參與了F-actin聚集，且對(duì)C.parvnm的入侵屬于正調(diào)控。因此宿主細(xì)胞的基因可能參與了蟲(chóng)體入侵時(shí)的相互作用，可能作為部分調(diào)節(jié)因子在接觸部位使F-actin重組。

3展望

多年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)的入侵機(jī)制進(jìn)行了深入研究，但多集中于蟲(chóng)體本身的一些分泌蛋白質(zhì)，對(duì)于分泌蛋白質(zhì)如何與宿主細(xì)胞上的受體互作從而發(fā)揮效應(yīng)這一最為關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚缺乏系統(tǒng)研究。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)入侵行為的發(fā)生依賴(lài)蟲(chóng)體自身的能動(dòng)性與宿主細(xì)胞F-actin聚集引起的細(xì)胞骨架重排二者共同作用，即入侵機(jī)制的研究與蟲(chóng)體及宿主細(xì)胞均相關(guān)。以往將研究重點(diǎn)集中在蟲(chóng)體本身的變化上，而對(duì)宿主細(xì)胞本身研究的較少，致使對(duì)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵機(jī)制研究多年而未取得重大突破。近年從宿主細(xì)胞角度研究寄生蟲(chóng)的入侵機(jī)制，取得了重要進(jìn)展。

在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)中，由艾美耳球蟲(chóng)引起的雞球蟲(chóng)病仍普遍發(fā)生，抗藥性嚴(yán)重，疫苗免疫又存在散毒現(xiàn)象，致使養(yǎng)雞業(yè)面臨巨大的風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn)，究其原因是對(duì)雞球蟲(chóng)入侵機(jī)制不明確，致使雞球蟲(chóng)病的防控不得要領(lǐng)，因此對(duì)雞球蟲(chóng)入侵機(jī)制進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究已經(jīng)迫在眉睫。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了許多基于雞球蟲(chóng)的相關(guān)研究工作，但是對(duì)雞球蟲(chóng)入侵機(jī)制的研究主要集中在雞球蟲(chóng)本身，即把重點(diǎn)放在研究雞球蟲(chóng)分泌的各種微線蛋白、頂膜抗原、棒狀體蛋白等在入侵過(guò)程中的作用，期望尋找具有保護(hù)作用的抗原，研制基因工程疫苗，但迄今為止，都沒(méi)有保護(hù)效果良好的基因工程疫苗問(wèn)世。而在雞球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)宿主細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)變化研究較少，所以基礎(chǔ)研究的不足直接導(dǎo)致雞球蟲(chóng)入侵機(jī)制的研究不透徹。

從宿主細(xì)胞角度對(duì)頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)(如艾美耳球蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、巴貝斯蟲(chóng)等)入侵機(jī)制進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探明頂復(fù)門(mén)系統(tǒng)的入侵提供了新的思路。

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(編輯白永平)

A Role for Host Cell F-actin Polymerization during the Protozoan Parasite Infection

WU Cai-yan1，2#，WANG Zhen1，2#，LI Juan1，LIN Xu-hui1，LIAO Shen-quan1，QI Nan-shan1，Lü Min-na1，SUN Ming-fei1*

(1.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofLivestockDiseasePrevention，GuangdongOpenLaboratoryofVeterinaryPublicHealth，InstituteofAnimalHealth，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Abstract:An important role for host cell F-actin polymerization caused the cytoskeleton rearrangement during the pathogen infection.This article mainly illuminate that integrin mediated host cell F-actin polymerization during the protozoan parasite invasion，the results can help to analyze the invasive mechanism and develop new drugs and vaccines of parasitic disease，so this research has very important significance.

Key words:protozoan parasite；host cell；F-actin polymerization；infection

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.002

收稿日期：2015-08-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31402186)；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目(201413)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B031500005；2014A020208052；2014B090901035；2015A020210086；2015B050501007)

作者簡(jiǎn)介：吳彩艷(1978-)，女，蒙古族，內(nèi)蒙古赤峰人，副研究員，博士生，主要從事雞球蟲(chóng)入侵機(jī)制的研究，E-mail：wucaiyan906@163.com；王禎(1989-)，男，河南駐馬店人，碩士生，E-mail：tsofts@163.com。#同等貢獻(xiàn)作者 *通信作者：孫銘飛，博士，副研究員，主要從事寄生蟲(chóng)病研究，E-mail：smf7810@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.72

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0423-06