柴芍平癇湯對癲癇幼齡大鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量的影響

魏沖，　張葆青

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實驗論著

柴芍平癇湯對癲癇幼齡大鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量的影響

魏沖，張葆青

250014 濟南，山東中醫(yī)藥大學(魏沖)；250011濟南，山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科(張葆青)

【摘要】目的研究柴芍平癇湯對癲癇幼齡大鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量的影響，探索其作用機制。方法70只SD大鼠隨機分為7組，分別為中藥低、中、高劑量組、西藥組、中西藥治療組、模型組、正常對照組，每組10只。對SD大鼠腹腔注射戊四氮建立癲癇模型，觀察行為學，以柴芍平癇湯對其進行干預治療24 d后ELISA法檢測腦組織γ-氨基丁酸(GABA)的含量。結(jié)果中西藥治療組用藥后24 d驚厥等級與用藥前1 d驚厥等級比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組無差異；中藥低、中、高劑量組，西藥組，中西藥治療組均比模型組腦組織內(nèi)γ-氨基丁酸含量高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各治療組及模型組γ-氨基丁酸含量與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論通過實驗得出柴芍平癇湯對癲癇大鼠驚厥等級、腦組織內(nèi)γ-氨基丁酸含量的降低均有治療作用。

【關鍵詞】癲癇；戊四氮；γ-氨基丁酸；卡馬西平;兒童

癲癇是多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征。本病發(fā)作對人體的危害是多方面的，其中最重要的是大腦損傷，具有長期性、反復發(fā)作性、難治性特點[1]。建立動物模型模擬癲癇的發(fā)作并通過藥物治療以觀察其療效機制已成為篩選抗癲藥物，尋找抗癲新法的重要手段。本實驗選用腹腔注射戊四氮的方法制備癲癇大鼠點燃模型，造模過程中發(fā)現(xiàn)，隨著時間的增加，大鼠驚厥的等級逐漸增加，呈現(xiàn)不同的發(fā)作形式，從面部抽搐、凝視逐漸發(fā)展到全身肌陣攣，僵直-陣攣驚厥等，由于戊四氮無神經(jīng)毒性作用，且其血藥濃度在造模過程中不會隨著注射時間的增加而變多，并選用28 d幼齡大鼠，相當于個體成長過程中的兒童期，因此本課題所制備點燃模型可近似模擬包括原發(fā)性癲癇在內(nèi)的多種兒科癲癇發(fā)作形式。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級新生28 d健康SD大鼠70只，雄性，體質(zhì)量(81.5±8.2)g，大鼠及墊料、鼠糧均由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2013-0001。SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為7組，分別為中藥低、中、高劑量組、西藥組、中西藥治療組、模型組、正常對照組，每組10只。

1.2藥品、試劑及器械柴芍平癇湯(柴胡、桂枝、半夏、川芎、黃芩、生甘草各6 g，白芍12 g，葛根15 g，采用免煎顆粒自行配制，濃度20 g/L，藥品均購于江陰天江藥業(yè)有限公司；卡馬西平(齊魯制藥有限公司，批號：4060042LA)；戊四氮(購于美國Sigma公司)；生理鹽水(山東圣魯制藥有限公司，批號：1405263)；大鼠γ-氨基丁酸ELISA檢測試劑盒(研域生物科技有限公司，批號：KB2981)；DAB顯色試劑盒(北京中杉)；酶標儀(美國Bio-Rad公司)；臺式低速離心機(eppendorf公司)；-20 ℃低溫冰箱(青島海爾)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏科技有限公司)。

1.3制備模型戊四氮配制：每日注射前半小時配制，以蒸餾水配成20 mg/kg溶液。正常對照組腹腔注射生理鹽水32 mg/kg，其余各組腹腔注射戊四氮32 mg/kg，每日1次，連續(xù)注射28 d，注射時間8:30～10:00，并于注射后觀察大鼠行為學1 h。每隔1 d測量大鼠體質(zhì)量，并相應調(diào)整戊四氮注射劑量。28 d后停止處理1周，然后以相同劑量的戊四氮處理1周。

1.4驚厥程度七點評分法0級：無驚厥；1級：點頭或頭部抽搐；2級：全身肌陣攣；3級：頭部抽搐加前肢陣攣；4級：陣攣驚厥加后腿站立；5級：跌倒；6級：全身強直-陣攣性驚厥[2]。

1.5點燃標準凡獲連續(xù)5次2級或2級以上驚厥記錄的大鼠，被認為已完全點燃。完全點燃后停止腹腔注射戊四氮，用于后續(xù)實驗。

1.6給藥方法劑量按大鼠與成人的體表面積比進行折算：成人用藥量×6.3=大鼠用藥量。根據(jù)此公式計算出大鼠用藥量，并對點燃的大鼠進行灌胃治療。中藥高、中、低劑量組分別給予柴芍平癇湯12、8、4 g/kg，中西藥結(jié)合組給予柴芍平癇湯8 g/kg+卡馬西平120 mg/kg，西藥組給予卡馬西平120 mg/kg，模型組及正常對照組予生理鹽水每次2 mL，各組均灌胃24 d，每日2次。

除正常對照組外各組分別于灌胃前1 d，灌胃后24 d給藥1 h后給予腹腔注射戊四氮32 mg/kg，記錄戊四氮癲癇點燃大鼠驚厥發(fā)作的情況，包括根據(jù)評分法記錄其發(fā)作等級；正常對照組腹腔注射生理鹽水32 mg/kg，并記錄日常行為。

1.7腦組織內(nèi)γ-氨基丁酸含量檢測將大鼠脫頸椎處死，從枕骨大孔處將皮膚剪開，暴露至鼻間縫，用直剪一側(cè)的尖端于鼻間縫上方做一圓孔，把直剪合攏，尖端放入孔中，鈍性分離撐開顱骨，完全暴露腦組織后，用剪刀于腦組織根部剪斷，用鑷子取出腦組織，迅速放入預冷的生理鹽水中，冰浴中制成20%的組織勻漿，3 000 r/min，離心10 min(離心半徑為3 cm)，取上清，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8腦組織內(nèi)γ-氨基丁酸含量的檢測方法(1)標準品的稀釋：按照0、1.25、2.5、5、10、20、40 μL的順序加入96孔板中，然后用磷酸鹽緩沖液將其補齊至50 μL。(2)加樣：設置空白孔、標準孔、待測樣品孔3個孔，空白對照孔不加酶標試劑及樣品，其余各步操作無異。在酶標包被板上標準品準確加樣至50 μL，待測樣品孔中加入40 μL樣品稀釋液，再加10 μL待測樣品，將其稀釋5倍。將樣品加于酶標板孔底部，加樣時盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。(3)溫育：用封板膜將其封板，并置37 ℃環(huán)境下溫育處理30 min。(4)配液：用蒸餾水30倍將濃縮洗滌液稀釋，以備后續(xù)實驗。(5)洗滌：去掉封板膜，過程中仔細小心，并棄去液體，甩干，并在每孔中加入洗滌液，使之加滿，無處理30 s后棄去，將此過程重復5次，5次結(jié)束后將其拍干。(6)加酶：除空白孔外，其余各孔均加入酶標試劑50 μL。(7)溫育：操作方法同第3步。(8)洗滌：操作方法同第5步。(9)顯色：先加入顯色劑A 50 μL至每個孔中，之后加入顯色劑B 50 μL，將其輕震混勻，顯色15 min，顯色環(huán)境為37 ℃并避光。(10)終止：在每孔加終止液50 μL，以終止反應。(11)測定：加終止液后15 min以內(nèi)，以空白孔調(diào)零，使用450 nm波長依次測定各孔的吸光度(OD值)。(12)計算：以OD值為縱坐標，標準物的濃度為橫坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，測出樣品的實際濃度。

2結(jié)果

2.1造模結(jié)果腹腔注射戊四氮第1天，部分大鼠出現(xiàn)凝視，面部肌肉抽動及點頭運動；注射3 d后，有18只大鼠出現(xiàn)3級及3級以上發(fā)作，2只大鼠出現(xiàn)6級發(fā)作；注射1周后5只大鼠造模成功；注射4周后52只大鼠造模成功；造模過程中7只大鼠死于驚厥嚴重發(fā)作，2只大鼠死于感染，2只大鼠死于大鼠間爭斗；7只大鼠始終造模未成功；造?？偝晒β?4.29%(52/70)。

2.2用藥前及用藥不同時間后大鼠驚厥等級比較見表1。

表1　用藥前后不同時間驚厥等級比較±s，級)

注：與用藥前1 d比較，at=2.39，P<0.05。

表1結(jié)果表明，各治療組大鼠驚厥發(fā)作等級隨藥物的使用均有不同程度的下降，中西藥治療組用藥后24 d驚厥等級與用藥前1 d驚厥等級比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組用藥后24 d與用藥前1 d比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示中西藥治療組較其他治療組對驚厥發(fā)作等級的治療作用明顯。2.3各組大鼠腦組織γ-氨基丁酸含量測定結(jié)果見表2。

表2　各組大鼠腦組織中γ-氨基丁酸含量

注：與模型組比較，aP<0.01；與正常對照組比較，bP<0.01。

表2結(jié)果表明，中藥低、中、高劑量組，西藥組，中西藥治療組均比模型組腦組織內(nèi)γ-氨基丁酸含量高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各治療組及模型組γ-氨基丁酸含量與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3討論

實驗性動物癲癇模型的建立已成為癲癇研究中重要的組成部分，通過動物實驗可探討癲癇的發(fā)病機制，研發(fā)和篩選新型的抗癲藥物等。本課題選用腹腔注射戊四氮的方法制備癲癇大鼠點燃模型，癲癇模型腦內(nèi)并無癲癇病灶[2]。模型制備成功后，于用藥前1 d腹腔注射相同濃度的戊四氮，觀察大鼠驚厥等級及發(fā)作持續(xù)時間以作為對照，于用藥后24 d予相同處理，并記錄與用藥前1 d進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，中西藥治療組用藥24 d后驚厥等級與用藥前比較有顯著差異，優(yōu)于中藥高、中、低劑量組及西藥組，而正常對照組驚厥等級有一定程度的增加，說明模型制備成功后隨著時間的增加，驚厥等級呈現(xiàn)上升的趨勢，結(jié)合其他各組驚厥等級的降低，從另一方面說明各治療組對驚厥發(fā)作等級確有療效。兩藥合用具有協(xié)同作用，對癲癇發(fā)作等級的抑制作用更強。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抑制性氨基酸的功能降低,興奮性氨基酸的功能增高在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。γ-氨基丁酸為腦中重要的抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，其含量很高，僅次于谷氨酸[3]。有研究證實，神經(jīng)系統(tǒng)中約有20%～40%的突觸為γ-氨基丁酸突觸，而γ-氨基丁酸含量的異常改變常導致癲癇的發(fā)生。腦內(nèi)γ-氨基丁酸濃度低于40%時則引發(fā)癲癇[4]。

腦內(nèi)谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶處理后生產(chǎn)γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸在γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下去除其氨基，缺少氨基的γ-氨基丁酸生成琥珀酸半醛，再經(jīng)其脫氫酶的氧化作用，將其生成琥珀酸，經(jīng)過三羥酸循環(huán)，或由琥珀酸半醛還原酶將其還原成γ-氨基丁酸，被去除的氨基則經(jīng)α-酮戊二酸處理重新生產(chǎn)谷氨酸，而琥珀酸半醛脫氫酶活性極強，在上述的反應中氧化反應為主,因此生成γ-氨基丁酸反應較重新生成谷氨酸反應占優(yōu)勢。

腦內(nèi)的谷氨酸作為γ-氨基丁酸合成的前身物質(zhì)，僅有小部分為中間產(chǎn)物，正常狀態(tài)下γ-氨基丁酸隨著谷氨酸的升高而升高，而γ-氨基丁酸的升高反過來抑制谷氨酸的升高，從而使二者達到一個相對的平衡。癲癇的發(fā)作是一個復雜的過程，其中某些因素導致腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量降低，破壞與谷氨酸之間的平衡，致其抑制性功能下降，則導致癲癇的發(fā)生。張云強等[5]、龔譽華等[6]都通過實驗驗證了癲癇模型γ-氨基丁酸含量明顯降低，這與本實驗結(jié)果一致。

造模成功后，通過柴芍平癇湯及卡馬西平對癲癇大鼠進行灌胃治療后，各治療組γ-氨基丁酸含量與模型組相比明顯上升，其中中西藥治療組作用最為優(yōu)異，高于西藥組及中藥高、中、低劑量組，并且都與模型組有顯著差異，說明柴芍平癇湯對γ-氨基丁酸確有明顯的升高作用。推測柴芍平癇湯對癲癇的治療作用很可能與升高腦組織內(nèi)的γ-氨基丁酸含量有關系。

柴芍平癇湯是由古方柴胡桂枝湯化裁而來，近現(xiàn)代研究證實其具有良好的抗癲作用[7-8]。本方由柴胡、白芍、桂枝、半夏、川芎、葛根、黃芩、生甘草組方而成，其中柴胡苦、辛、微寒，歸肝膽經(jīng)，具有疏肝解郁，升舉陽氣，解熱等作用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，柴胡于明代開始多被用作癲癇的治療，現(xiàn)代藥理研究指出柴胡具有鎮(zhèn)靜、安定等廣泛的中樞抑制作用。黃芩味苦、寒。可清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎，現(xiàn)代藥理研究認為黃芩具有解熱、鎮(zhèn)靜、抗氧化、調(diào)節(jié)cAMP水平作用，有研究指出黃芩具有抗癲作用[9]，其作用機制為減少神經(jīng)細胞再癲癇發(fā)作后的壞死、凋亡，對神經(jīng)元進行保護?！夺t(yī)學啟源》記載半夏“治寒痰及形寒飲冷……治太陰痰厥頭痛，非此不能除?！弊鳛樵餄窕抵?，還具有降逆止嘔，消痞散結(jié)之功效。柴胡、黃芩配伍寓雙解之義，其一表一里、一升一降,早在《本草綱目》即有記載：“柴胡行手足少陽,以黃芩為佐”，兩者升降相配；合黃芩、半夏辛開苦降，共調(diào)逆亂之氣機。

方中白芍具有滋陰養(yǎng)血除煩，平抑肝陽的功效，歸肝、脾經(jīng)，其所含成分芍藥苷具有較好的解痙作用。桂枝味辛、甘、溫。歸心、肺、膀胱經(jīng)。具有發(fā)汗解肌，溫經(jīng)通脈，助陽化氣作用，其主要成分桂皮醛可鎮(zhèn)靜、抗驚厥；桂枝可直接阻滯Ca2+通道或γ-氨基丁酸受體，抑制癲癇大鼠腦內(nèi)突觸傳遞過程，具有抗癲作用[10]。川芎可上行頭目，入肝、膽、心包經(jīng)，有活血行氣，曲風止痛之功，并可對動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)起鎮(zhèn)靜作用[11]。柴、桂相配可舒肝利氣，柴、芍二藥，散收相合，相互制約，使疏散得度，斂而不滯；三藥相合可土中瀉木，收散有度，不至“伐生發(fā)之氣也”。葛根可解肌退熱，生津止渴，升陽止瀉作用，并具有增加腦血流量的作用，能增加氧供應，并具有β受體阻滯作用，有明顯解痙作用。甘草有解毒、祛痰、止痛、解痙等作用，其性平,味甘,能補脾益氣,緩急解毒,調(diào)和百藥等。此方中除調(diào)和諸藥外，還可與芍藥配伍，取其酸甘化陰之效。桂枝、芍藥、甘草合用更是取桂枝湯調(diào)和營衛(wèi)之意。諸藥合用可調(diào)氣機、平陰陽、和營衛(wèi)，具有鎮(zhèn)靜安神，疏肝解郁,和解止痙之用。

癲癇病因復雜，臨床表現(xiàn)多種多樣，不易根除[12]，臨床中治療癲癇多是以一種或者多種西藥聯(lián)合治療為主，而中醫(yī)治療癲癇的作用往往被忽略，通過本實驗研究得出，中藥對癲癇確有治療作用，中藥與西藥聯(lián)用作用優(yōu)于西藥組及中藥組單用，加之中藥毒副反應小，無戒斷反應等問題，在將來癲癇的治療中，中藥將發(fā)揮更為巨大的作用，占有重要地位。

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(本文編輯：劉穎)

Effect of Chaishao Pingxian(epilepsy-relieving) decoction on brain GABA content of young rats with epilepsy

WEIChong,ZHANGBaoqing.

ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250014，China.

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of Chaishao Pingxian decoction on brain GABA content of young rats with epilepsy and to investigate its mechanism.MethodsThe rats were randomly divided into 7 groups,by number,namely,low-(A),moderate(B) and high-dose(C) group,western medicine group(D),Chinese and western medicine group(E),model group(F) and normal control group(G),with 10 rats in each group.PTZ was injected into SD rats to establish epilepsy model and the behavior was observed.Chaishao Pingxian decoction was given as intervention treatment and after 24 days ELISA was used to determine GABA content in brain tissues.ResultsThere was statistical difference on convulsion grade between 24d after treatment and 1d before treatment in group E,but no difference in the other groups.Compared with group F,GABA content was higher in group A,B,C,D and E,and difference was statistical(P<0.01).When comparing GABA content of group G with that of the other six groups,there was statistical difference(P<0.01).ConclusionChaishao Pingxian decoction has therapeutic effect on the epilepsy grade and the decrease of GABA content in brain tissues in tats with epilepsy.

【Keywords】Epilepsy;PTZ;GABA;CBZ；Rat

作者簡介：魏沖(1989-)，男，山東中醫(yī)藥大學2008級七年制本碩連讀生。研究方向：小兒呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究 通訊作者：張葆青，E-mail：459356800@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.03.004

【中圖分類號】R363

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-3865(2016)03-0261-04

(收稿日期：2015-12-08)