煙堿型乙酰膽堿受體基因多態(tài)性與NSCLC的相關(guān)性研究

陸晶晶， 黃建浩， 尹 琦， 朱 輝

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200120)

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·基礎(chǔ)研究·

煙堿型乙酰膽堿受體基因多態(tài)性與NSCLC的相關(guān)性研究

陸晶晶， 黃建浩， 尹 琦， 朱 輝

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200120)

目的 探討煙堿型乙酰膽堿受體a5(nicotine acetylcholine receptor subunits alpha5, CHRNA5)基因-1640 C/T (rs3829787)單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)易感性的關(guān)系。方法 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Sanger測(cè)序方法，檢測(cè)102例非小細(xì)胞肺癌患者和131例健康對(duì)照者CHRNA5基因-1640C/T位點(diǎn)基因型分布情況，觀察該位點(diǎn)基因多態(tài)性是否與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病及病理類型相關(guān)。結(jié)果 兩組人群均存在CHRNA5基因-1640C/T多態(tài)性；兩組人群基因型、等位基因頻率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肺癌組CT+TT基因型、T等位基因頻率均高于對(duì)照組(P<0.05)；基因型頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，CT、TT基因型各自患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)分別是CC基因型的1.77倍(95%CI： 0.93～3.36)和4.70倍(95%CI： 1.23～17.99)；-1640T在肺腺癌中分布頻率較非腺癌中高(P<0.05)。結(jié)論 CHRNA5基因-1640C/T多態(tài)性可能與非小細(xì)胞肺癌易感性相關(guān)，該位點(diǎn)攜帶T等位基因的吸煙人群可能更容易發(fā)生肺癌，尤其是肺腺癌。

非小細(xì)胞肺腫瘤； 煙堿型乙酰膽堿受體a5基因； 單核苷酸多態(tài)性； 等位基因

肺癌是當(dāng)前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴(yán)重威脅人民健康和生命的疾病。90%的肺癌與吸煙暴露有關(guān)[1]。研究表明[2]，人類第15號(hào)染色體長(zhǎng)臂15q24-25區(qū)域上編碼的煙堿型乙酰膽堿受體候選基因，即尼古丁受體家族(CHRNA3、CHRNA5、CHRNB4)，表達(dá)于支氣管上皮，由尼古丁激活，參與調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)，其基因多態(tài)性與吸煙相關(guān)的肺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)非小細(xì)胞肺癌CHRNA5基因多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道還并不完善。本研究通過分析CHRNA5-1640C/T的基因多態(tài)性特點(diǎn)，研究其與吸煙非小細(xì)胞肺癌人群的發(fā)病及疾病病理類型的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

非小細(xì)胞肺癌組(以下簡(jiǎn)稱肺癌組)選自同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院2013年10月至2014年10月期間呼吸內(nèi)科住院和門診患者共計(jì)102名，均為男性，年齡58～79歲。所有病例均符合相關(guān)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)病理結(jié)果分為肺腺癌組和非腺癌組，均為初治患者，分期為Ⅰb～Ⅲb期不等，無哮喘、肺間質(zhì)纖維化、支氣管擴(kuò)張等肺部疾病，無合并其他惡性腫瘤病史。

對(duì)照組選自本院呼吸科門診及體檢中心等，共計(jì)131名，男性，年齡59～74歲，所有研究對(duì)象均經(jīng)過詳細(xì)的病史詢問和全面的體格檢查，并排除哮喘、肺間質(zhì)纖維化、支氣管擴(kuò)張等肺病疾病，無肺部及其他部位惡性腫瘤史。

兩組對(duì)象均沒有血緣關(guān)系的中國(guó)漢族人群，要求為持續(xù)吸煙且目前尚未戒煙患者(吸煙指數(shù)>200支年)。兩組對(duì)象年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。所有受試者均簽署知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 清晨空腹采集受試者(肺癌組和對(duì)照組)外周靜脈血3ml，以20μl 0.5mol/L EDTA管抗凝，-70℃保存待檢測(cè)，避免反復(fù)凍融。

1.2.2 全血白細(xì)胞基因組DNA的提取 用TIANamp Genomic DNA kit(DP 304，天根生化公司)，按照說明書離心柱法抽提全血白細(xì)胞基因組DNA，注意操作，避免樣本間交叉污染。

1.2.3 抽提的DNA純度分析 使用分光光度計(jì)檢測(cè)所有樣本的D值，達(dá)標(biāo)后將樣本稀釋到工作濃度后-20℃保存待用。

1.2.4 DNA片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增 擴(kuò)增CHRNA5-1640 C/T位點(diǎn)的PCR引物序列利用primer3軟件設(shè)計(jì)，由上海生工合成，上游5′-TTTAGGGGAACTTTGTAGGTGGT-3′，下游5′-TTTACTCTGAAGAATTTATGGGACTT-3′，擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度為529bp。上下游引物各1μl，按照GoTaq G2 Colorless Master Mix(Promega)使用說明書配置50μl體系。PCR使用Veriti 96-Well Thermal Cyclery(ABI)，反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性5min后，以 95℃變性 30s，62℃退火至 55℃ 30s，72℃延伸40s為一個(gè)循環(huán)，共15個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物4℃保存。結(jié)果見圖1。

圖1 CHRNA5-1640C/T PCR結(jié)果Fig.1 The PCR results of CHRNA5-1640C/T gene

1.2.5 Sanger雙脫氧法測(cè)列分析 采用3500XL(ABI)測(cè)序儀。根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組分型，可分為CC、CT、TT三種類型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CHRNA5基因-1640C/T多態(tài)性在肺癌組和對(duì)照組的分布特點(diǎn)

兩組研究對(duì)象均可檢測(cè)到預(yù)計(jì)的529bp的基因片段，且均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，具有較好的群體代表性。本研究發(fā)現(xiàn)CHRNA5-1640C/T在兩組間均存在CC、CT、TT三種基因類型，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，肺癌組基因型、等位基因頻率分布各自與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，CT、TT基因型、T等位基因頻率均高于對(duì)照組，而CC基因型頻率、C等位基因頻率均低于對(duì)照組，見表1、2。

表1 肺腫瘤組與對(duì)照組CHRNA5基因-1640C/T位點(diǎn)基因型頻率分布比較

表2 肺腫瘤組與對(duì)照組CHRNA5基因-1640C/T位點(diǎn)等位基因頻率分布比較

將CC型與含有T等位基因的CT+TT型基因型頻率進(jìn)行分析比較后發(fā)現(xiàn)，在肺癌組和對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，OR值為0.47(0.26～0.86)，見表3。

表3 肺腫瘤組與對(duì)照組CHRNA5基因-1640C/T位點(diǎn)合并基因型頻率分布比較

2.2 CHRNA5基因-1640C/T多態(tài)性與肺腫瘤病理類型的關(guān)系

根據(jù)肺腫瘤組對(duì)象病理類型的不同，將患者進(jìn)一步分為腺癌和非腺癌組。兩組相比發(fā)現(xiàn)，腺癌組CT、TT基因型、T等位基因頻率均高于非腺癌組，而CC基因型頻率、C等位基因頻率均低于非腺癌組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 肺腫瘤病理類型與CHRNA5基因-1640C/T多態(tài)性的關(guān)系

3 討 論

肺部腫瘤目前認(rèn)為是由遺傳和環(huán)境因素共同作用造成的多基因疾病，有關(guān)全基因組關(guān)聯(lián)研究進(jìn)展迅速[3]，尼古丁被認(rèn)為是在肺部腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的因素之一。

尼古丁依賴和成癮性與人類15號(hào)染色體上的尼古丁受體家族(CHRNA3、CHRNA5、CHRNB4)有密切關(guān)系[4-6]。尼古丁受體家族是體內(nèi)編碼產(chǎn)生的一類可以與尼古丁結(jié)合而發(fā)揮其功能的蛋白家族，位于人類15號(hào)染色體長(zhǎng)臂，與吸煙行為密切相關(guān)。肺泡上皮細(xì)胞、肺的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞株中也有尼古丁受體蛋白的表達(dá)。目前研究表明，該蛋白可與煙草中特有的致癌物結(jié)合，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，增加患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來，多個(gè)研究報(bào)道尼古丁受體CHRNA3/5的SNP變化與肺癌的發(fā)病相關(guān)[7]。

CHRNA3基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)遺傳突變位點(diǎn)rs6495309(T>C)，是已被報(bào)道的中國(guó)人群特有的、分布頻率較高的與肺癌相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，與吸煙人群相關(guān)，攜帶C等位基因的吸煙者發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。鄭霞等[8]報(bào)道在CHRNA5 rs503464多態(tài)性中，TA攜帶者患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)較TT/AA明顯降低(OR=0.642，P<0.001)。結(jié)合病理類型風(fēng)險(xiǎn)，TA攜帶者患肺腺癌和肺鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯低于純合基因型TT/AA攜帶者(OR值分別為 0.597 和0.542，P=0.002)。分層分析后顯示,這種保護(hù)作用在年齡大于60歲及無腫瘤家族史的人群中更顯著(P<0. 001)。Wojas等[9]通過研究97名肺癌患者、99名COPD患者及98名健康對(duì)照者的rs16969968位點(diǎn)多態(tài)性、尼古丁依賴測(cè)定等，各組間AA、AG、GG基因型頻率無明顯差異，但GG基因型可減低尼古丁成癮性，A等位基因在高度尼古丁依賴者中頻率更高。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)從基因相關(guān)性的角度來說，吸煙、COPD以及吸煙合并COPD影響肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)分別是18.3%、30.2%、20.6%。同樣，通過對(duì)靶基因的治療，也可以減少相關(guān)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[11]。

本研究選擇觀察吸煙人群CHRNA5-1640 C/T(rs3829787)單核苷酸多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系。首先，本研究結(jié)果證實(shí)，在-1640 C/T(rs3829787)處存在CC、CT和TT三種基因型，且每種基因型均具有較高的突變率。肺癌組與對(duì)照組相比，CT、TT基因型、T等位基因頻率均高于對(duì)照組，而CC基因型頻率、C等位基因頻率均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述3種基因型的分布在肺癌組中TT型較對(duì)照組明顯升高，且基因型頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，CT、TT基因型各自患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)分別是CC基因型的1.77倍(95%CI： 0.93～3.36)和4.70倍(95%CI： 1.23～17.99)，提示CHRNA5-1640 C/T多態(tài)性與吸煙人群肺癌的發(fā)病具有相關(guān)性，-1640 T等位基因可能是該人群肺癌發(fā)生的遺傳因素和易感因子，即隨著等位基因T的增加，患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)亦隨之增加。從基因水平證實(shí)了尼古丁參與肺癌的發(fā)病機(jī)制，解釋了吸煙人群發(fā)生肺癌的原因。這部分內(nèi)容與目前研究結(jié)果基本一致[12]。

進(jìn)一步的亞組分析中，肺腫瘤組病例按照病理類型的不同分為腺癌組與非腺癌組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺癌組CT、TT基因型、T等位基因頻率均高于非腺癌組，而CC基因型頻率、C等位基因頻率均低于非腺癌組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。-1640 T 等位基因可能與肺癌，特別是肺腺癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。傳統(tǒng)理論提示肺非腺癌與吸煙關(guān)系密切，與本研究結(jié)果有出入，作為基因易感性研究，本研究數(shù)據(jù)較單薄，故還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來證實(shí)，需要進(jìn)一步詳盡的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示出CHRNA5基因-1640處C、T基因在肺癌組和正常對(duì)照組之間存在顯著性差異，-1640T等位基因可能是吸煙人群罹患肺癌，尤其是肺腺癌的遺傳危險(xiǎn)因素和易感因子，對(duì)具有該位點(diǎn)T等位基因的特定人群，適當(dāng)干預(yù)尼古丁攝入所起到的作用，有待于進(jìn)一步的前瞻性研究。

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Association between CHRNA5 gene polymorphism and susceptibility to non-small cell lung cancer

LUJing-jing，HUANGJian-hao，YINQi，ZHUHui

(Dept. of Respiratory Medicine， East Hospital， Tongji University， Shanghai 200120， China)

Objective To investigate the association of nicotine acetylcholine receptor subunits alpha 5 (CHRNA5) gene-1640C/T (rs3829787)polymorphism with susceptibility to non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods CHRNA5 gene-1640C/T polymorphism was genotyped with PCR-Sanger method in 102 NSCLC patients and 131 healthy adults. The association of CHRNA5 gene polymorphism with pathological type of lung cancer was analyzed. Results CHRNA5 gene-1640 CT+ TT genotype and T allele were more frequent in NSCLC patients than that in controls (P<0.01). The relative risk of CT genotype carrier to NSCLC was 1.77 times of CC genotype (95%CI： 0.93-3.36). The relative risk of TT genotype carrier to NSCLC was 4.70 times of CC genotype (95%CI： 1.23-17.99). The distribution of CHRNA5 gene-1640T polymorphism in lung adenocarcinoma was higher than that of non-adenocarcinoma. Conclusion CHRNA5 gene-1640T allele may be a genetic susceptibility factor to NSCLC，especially to lung adenocarcinoma.

non-small cell lung cancer; nicotine acetylcholine receptor subunits alpha 5 gene; single nucleotide polymorphism; allele

10.16118/j.1008-0392.2016.03.007

2015-08-07

同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院起航計(jì)劃青年項(xiàng)目(DFQH-Q18)

陸晶晶(1984—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail: lujjhf@hotmail.com

R 563.9

A

1008-0392(2016)03-0036-04