利福平抑制地塞米松誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的機(jī)制研究

韓 寧， 李增春， 蔡鄭東， 徐 翀

(1. 同濟(jì)大學(xué)東方醫(yī)院急診創(chuàng)傷外科，上海 200120; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院骨科，上海 200172; 3. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院骨科，上海 200080)

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·基礎(chǔ)研究·

利福平抑制地塞米松誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的機(jī)制研究

韓 寧1,2， 李增春1， 蔡鄭東2,3， 徐 翀1

(1. 同濟(jì)大學(xué)東方醫(yī)院急診創(chuàng)傷外科，上海 200120; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院骨科，上海 200172; 3. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院骨科，上海 200080)

目的 明確利福平對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stroma cell, BMSC)成脂分化的作用。方法 體外培養(yǎng)Sprague-Dawley大鼠BMSC并隨機(jī)分為4組： 5μg/ml利福平+10-6mol/L地塞米松(A)，PBS+10-6mol/L地塞米松(B)，5μg/ml利福平(C)和PBS(D)。分別應(yīng)用羅丹明123結(jié)合流式細(xì)胞儀方法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè) 5μg/ml 利福平對(duì)BMSC的P糖蛋白活性和胞內(nèi)地塞米松蓄積濃度影響。各組孵育14d后，分別進(jìn)行油紅O染色和堿性磷酸酶染色，定量檢測(cè)三酰甘油含量、堿性磷酸酶活力、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ) mRNA和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)mRNA表達(dá)。結(jié)果 利福平減少BMSC胞內(nèi)羅丹明123強(qiáng)度和胞內(nèi)地塞米松蓄積量(P<0.01)。B組誘導(dǎo)BMSC成脂分化、PPARγ mRNA表達(dá)增加和三酰甘油含量升高。A組、C組和D組BMSC未發(fā)生成脂分化，PPARγ mRNA表達(dá)增加和三酰甘油含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。A組BMSC堿性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表達(dá)最強(qiáng)(P<0.01)，B組堿性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表達(dá)下降(P<0.01)。結(jié)論 利福平上調(diào)BMSC的P糖蛋白活性，抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成脂分化。

利福平； P糖蛋白； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 糖皮質(zhì)激素； 成脂分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cell， BMSC)是一種多能干細(xì)胞，可被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等[1-3]。其中，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)BMSC成脂分化，抑制成骨分化被認(rèn)為是激素性骨質(zhì)疏松和激素性股骨頭壞死的重要機(jī)制[4-5]。

高濃度糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)BMSC成脂分化，抑制BMSC成骨分化，進(jìn)而導(dǎo)致骨組織內(nèi)骨髓脂肪化加劇，骨小梁纖細(xì)，發(fā)生骨質(zhì)疏松。在股骨頭內(nèi)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)BMSC過(guò)度成脂分化升高股骨頭內(nèi)壓，引發(fā)股骨頭內(nèi)缺血致骨壞死[4-6]。前期研究發(fā)現(xiàn)全身應(yīng)用利福平可上調(diào)股骨頭內(nèi)P糖蛋白表達(dá)，減少股骨頭內(nèi)脂肪化，骨小梁增粗[4]。P糖蛋白是一種膜蛋白，它通過(guò)消耗ATP外泵進(jìn)入胞內(nèi)的糖皮質(zhì)激素，降低胞內(nèi)激素濃度，削弱激素藥理作用[7-8]。由于隨著糖皮質(zhì)激素濃度升高，BMSC成脂分化越顯著，成骨分化逐漸減弱[9]。推測(cè)利福平可能存在增加BMSC細(xì)胞膜上P糖蛋白活性，減少了胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素蓄積，抑制成脂分化的作用。

為證實(shí)上述假設(shè)，本研究應(yīng)用利福平增強(qiáng)BMSC的P糖蛋白活性，明確其對(duì)BMSC成脂分化的干預(yù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague_Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量250～300g，7周齡，由同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 高糖DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，10%胎牛血清(以色列Beit Haemek有限公司)，含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，percoll分離液(Sigma)，利福平(Sigma)，地塞米松(Sigma)，羅丹明123(Sigma)，油紅O(sigma)，細(xì)胞裂解液(sigma)，培養(yǎng)瓶、24孔板(美國(guó)Corning公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Drive)，地塞米松的ELISA試劑盒(美國(guó)Neogen公司)，細(xì)胞裂解液(Sigma)，三酰甘油酶法定量檢測(cè)試劑盒(上海鈺森生物技術(shù)有限公司)，堿性磷酸酶活力分析試劑盒(上海鈺森生物技術(shù)有限公司)，TrizoI 試劑(Sigma)，ChIoroform(Sigma)，SuperScript Ⅱ試劑盒(加拿大I nvitrogen 公司)，紫外光分光光度儀(德國(guó)Eppendoff公司)，U-1500 Spectrophotometer 型分光光度儀(日本HITACHI 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSC分離培養(yǎng) 密度梯度離心聯(lián)合差速貼壁法分離BMSC[10]。取SD大鼠無(wú)菌條件下去除雙側(cè)股骨遠(yuǎn)近側(cè)干骺端，以DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)沖洗。沖洗液充分混勻后轉(zhuǎn)移至10ml percoll分離液(d=1.073g/ml)上層，900g離心20min，離心半徑12cm。PBS洗滌中間富含BMSC的單個(gè)核細(xì)胞層兩次，單細(xì)胞懸液以5×108/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶。置37℃、相對(duì)體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞孵箱培養(yǎng)48～72h后全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每2～3d換液一次。生長(zhǎng)至80%融合后以含0.02%EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

將BMSC以 1×105/ml接種于24孔板，隨機(jī)分為4組。A組和B組分別加入終濃度為5μg/ml的利福平和PBS，繼而再分別加入終濃度為10-6mol/L的地塞米松共同孵育14d。C組和D組僅分別加入終濃度為5μg/ml利福平和PBS孵育14d，作為對(duì)照組。

1.2.2 P糖蛋白活性檢測(cè) 應(yīng)用Feller[11]介紹的方法檢測(cè)利福平和維拉帕米對(duì)BMSC的P糖蛋白活性影響。1×105/ml的BMSC單細(xì)胞懸液分為2組，每組10個(gè)樣品。置37℃、相對(duì)體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞孵箱孵育1h后，加入終濃度為0.2μg/ml羅丹明123。37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)30min。PBS洗滌細(xì)胞2遍，重懸于DMEM培養(yǎng)液中(各組分別加入終濃度5μg/ml 利福平和PBS)。37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)60min，200g離心10min，離心半徑12cm。重懸于0.5ml PBS中，立即以流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488nm和525nm。不含羅丹明123染液的BMSC為對(duì)照組。

1.2.3 地塞米松胞內(nèi)蓄積 應(yīng)用地塞米松ELISA試劑盒檢測(cè)BMSC胞內(nèi)的地塞米松蓄積。1×105/ml的BMSC單細(xì)胞懸液分為2組置于24孔板，每組分別加入終濃度5μg/ml利福平和PBS后，繼而加入10-6mol/L地塞米松孵育24h，每組10個(gè)樣本。24h后以細(xì)胞裂解液裂解BMSC，900g離心10min。取上清液，根據(jù)地塞米松ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組的地塞米松濃度。

1.2.4 油紅O染色 各組分別孵育14d后，以4%多聚甲醛固定10min。蒸餾水洗去固定液，70%乙醇浸漬1min，加油紅O染液染色20min, 棄去染液，70%乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗并用蒸餾水洗5min，蘇木精復(fù)染?！?00光鏡下計(jì)數(shù)各組爬片上胞漿中包含紅色脂滴顆粒的脂化細(xì)胞。

1.2.5 堿性磷酸酶(AKP)染色 各組孵育14d后，以固定液固定5s。干燥后用基質(zhì)液染色15min，流水沖洗好晾干；蘇木精復(fù)染10min后水沖，晾干后鏡檢。×400光鏡下計(jì)數(shù)各組爬片上AKP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞。

1.2.6 三酰甘油含量的定量檢測(cè) 各組孵育14d后，分別以50μl細(xì)胞裂解液完全裂解各組細(xì)胞，700g離心10min，離心半徑12cm。取上清液。測(cè)定管取16μl上清液，標(biāo)準(zhǔn)管取16μl R3液，空白管取16μl蒸餾水；分別與1ml R1液混勻，37℃水浴15min。各管分別加入500μl R2液混勻，37℃溫箱內(nèi)靜置5min。以空白管調(diào)零，550nm測(cè)吸光度。根據(jù)說(shuō)明書(shū)提供的公式計(jì)算血清三酰甘油(TG)濃度(mmol/L)。

1.2.7 AKP含量的定量檢測(cè) 依據(jù)AKP 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，各組細(xì)胞孵育14d后，重懸于PBS，加入60μl 蛋白上清液與100μl 緩沖液、基質(zhì)液，充分混勻。各組于37 ℃水浴反應(yīng)15min，加顯色劑150μl終止反應(yīng)并混勻。各組于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.8 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ) mRNA和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的mRNA表達(dá) 孵育14d后，各組細(xì)胞中加入1000ml TrizoI 試劑和200mI ChIoroform，混勻后離心，收集離心液的RNA 層并加入2-ProponoI 500ml繼續(xù)離心。去除上清液，以75%乙醇清洗沉淀物，離心去除乙醇，以雙蒸水溶解RNA。U-1500 Spectrophoto-meter型分光光度儀(HITACHI 公司，日本)測(cè)RNA濃度。

取各組RNA 1μg，經(jīng)DNA 酶處理后，用SuperScript Ⅱ試劑盒經(jīng)DNA Engine 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，用SYBR Green Ⅰ法，在95°C經(jīng)3min變性后，進(jìn)行95℃15s、60℃15s 和72℃ 30s反應(yīng)，40次循環(huán)。對(duì)各組的熒光PCR 產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析。每一個(gè)周期的最后一個(gè)步驟都設(shè)置了熒光產(chǎn)物的檢測(cè)。為確定擴(kuò)增的特異性，應(yīng)用循環(huán)方案對(duì)所有最終聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了熔融曲線分析。此外，沒(méi)有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的樣品也進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以排除基因組的核酸污染。從一系列的GAPDH質(zhì)?；蚪McDNA稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。PPARγ和Runx2表達(dá)均分別以GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物在表1中列出。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)引物

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 所得的數(shù)據(jù)均采用Stata 7.0軟件進(jìn)行兩兩比較t檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 BMSC分離培養(yǎng)

BMSC細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，貼附于培養(yǎng)瓶底部， 每7～10d生長(zhǎng)達(dá)到融合。以0. 25%胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞于24h內(nèi)完全貼壁，形態(tài)與原代細(xì)胞相似，7～10 d達(dá)到融合。取第4～6代細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2.2 BMSC的P糖蛋白活性檢測(cè)

5μg/ml利福平處理細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度低于PBS處理組(P<0.01)(圖1A)。5μg/ml利福平處理后，BMSC胞內(nèi)地塞米松濃度低于PBS處理組(P<0.01)(圖1B)。

圖1 BMSC胞內(nèi)rhodamine123熒光值和地塞米松蓄積Fig.1 Mean fluorescent value of rhodamine123 and dexamethasone accumulation in BMSCs(A) 5μg/ml利福平減少BMSC胞內(nèi)rhodamine123熒光值(B) 5μg/ml利福平減少BMSC胞內(nèi)地塞米松蓄積*PBS處理BMSC與5μg/ml利福平處理BMSC相比較，aP<0.01

2.3 油紅O染色

B組中BMSC胞漿中出現(xiàn)逐漸增多的脂滴，被油紅O染為紅色。A組BMSC未出現(xiàn)脂肪化(圖2A)。B組脂化細(xì)胞數(shù)高于A組。A組脂化細(xì)胞數(shù)和C組、D組無(wú)顯著差異(表2)。

2.4 AKP染色

AKP染色陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色胞漿。A組AKP染色最顯著，B組AKP染色減弱。C組和D組BMSC的AKP染色呈陰性(圖2B)。

圖2 油紅O和堿性磷酸酶染色Fig.2 Oil red O staining and AKP staining of BMSCs(A) 油紅O染色： B組中10-6mol/L地塞米松導(dǎo)致BMSC成脂分化，胞內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴，應(yīng)用利福平后，抑制地塞米松誘導(dǎo)的成脂分化： A組、C組和D組油紅O染色呈陰性；(B) 堿性磷酸酶染色： A組堿性磷酸酶染色強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿為紅色，B組堿性磷酸酶染色減弱，C組和D組染色為陰性

2.5 TG定量檢測(cè)

B組TG含量高于A組。A組三酰甘油含量和C組、D組無(wú)顯著差異，表2。

表2 成脂分化細(xì)胞數(shù)量，三酰甘油和堿性磷酸酶活性定量

分組成脂分化細(xì)胞數(shù)量/cm2甘油三酯含量/mmol·L-1堿性磷酸酶活性/U·L-1A組10.8±5.1712.50±0.70199.80±68.75aB組90.4±9.02b14.03±0.66b60.00±26.24bC組12.60±5.5012.08±1.1029.00±14.05D組10.6±3.3612.24±0.7529.80±10.33

注： A組與B組、C組和D組相比較，aP<0.01；B組與A組、C組和D組相比較，bP<0.01

2.6 AKP定量檢測(cè)

A組AKP含量高于B組。B組AKP含量高于C組和D組。C組和D組AKP表達(dá)呈陰性(表2)。

2.7 PPARγ mRNA和Runx2 mRNA表達(dá)

B組PPARγ mRNA表達(dá)高于A組。A組PPARγ mRNA表達(dá)和C組、D組無(wú)顯著差異(圖3)。A組Runx2 mRNA表達(dá)高于B組。B組Runx2 mRNA表達(dá)高于C組和D組。

圖3 PPARγ mRNA和Runx2 mRNA定量Fig.3 Quantitative analysis of PPARγ mRNA and Runx2 mRNA(A) PPARγ2 mRNA半定量： B組PPARγ2 mRNA表達(dá)最高，A組、C組和D組表達(dá)較低，無(wú)顯著差異(B) Runx2 mRNA半定量： A組Runx2 mRNA表達(dá)最高，B組Runx2 mRNA表達(dá)降低，C組和D組表達(dá)最低，無(wú)顯著差異*A組與B組相比較， aP<0.01； B組與A組、C組和D組相比較，bP<0.01；A組與B組、C組和D組相比較，cP<0.01

3 討 論

糖皮質(zhì)激素是誘導(dǎo)BMSC成脂分化的關(guān)鍵因子[12]。當(dāng)BMSC成脂分化增強(qiáng)，成骨分化抑制[13]。其中，糖皮質(zhì)激素濃度是調(diào)控BMSC的分化的重要因素。隨糖皮質(zhì)激素濃度升高，BMSC成脂分化增強(qiáng)，成骨分化被抑制。近年來(lái),發(fā)現(xiàn)人多藥耐藥基因1編碼的P糖蛋白活性增強(qiáng)能降低糖皮質(zhì)激素的胞內(nèi)蓄積[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用維拉帕米抑制P糖蛋白活性后，相同濃度糖皮質(zhì)激素環(huán)境中BMSC成脂分化增強(qiáng)[14]。但增強(qiáng)P糖蛋白活性對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)BMSC成脂分化的干預(yù)尚缺乏研究。

利福平是常用的P糖蛋白活性增強(qiáng)劑[10]。本研究采用Feller N介紹的熒光染料羅丹明123結(jié)合流式細(xì)胞儀的方法對(duì)P糖蛋白活性進(jìn)行檢測(cè)[11]。羅丹明123是特異性的P糖蛋白底物，可被P糖蛋白逆濃度梯度泵至細(xì)胞外。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)熒光殘留量能夠準(zhǔn)確反映P糖蛋白活性；胞內(nèi)羅丹明123蓄積越多，P糖蛋白活性越弱[15]。因此，胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度和P糖蛋白活性成反比。本研究中應(yīng)用5μg/ml利福平對(duì)BMSC進(jìn)行預(yù)處理后，顯著降低了BMSC胞內(nèi)羅丹明123熒光染料的蓄積，即上調(diào)了P糖蛋白活性。糖皮質(zhì)激素也是P糖蛋白底物[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)利福平升高BMSC的P糖蛋白活性后，BMSC胞內(nèi)蓄積的地塞米松濃度下降。

高濃度地塞米松誘導(dǎo)BMSC成脂分化[9]。本研究中，10-6mol/L地塞米松誘導(dǎo)BMSC胞內(nèi)PPARγ表達(dá)增加，發(fā)生成脂分化。地塞米松濃度是影響B(tài)MSC成脂分化的關(guān)鍵調(diào)控因素[9]。有研究發(fā)現(xiàn)10-6mol/L地塞米松相比10-10mol/L地塞米松誘導(dǎo)的成脂分化更為顯著[16]。地塞米松濃度下降，PPARγ表達(dá)減少，BMSC成脂分化被抑制[9]。本研究中利福平上調(diào)了BMSC的P糖蛋白活性，胞內(nèi)地塞米松濃度下降，PPARγ表達(dá)減少，成脂分化明顯受到抑制。由于PPARγ是BMSC成脂分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，而單純應(yīng)用利福平不改變BMSC胞內(nèi)PPARγ mRNA水平和成脂分化。因此，推測(cè)利福平抑制了BMSC的成脂分化是通過(guò)上調(diào)P糖蛋白活性減少地塞米松在胞內(nèi)的蓄積，進(jìn)而降低地塞米松與胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，從而抑制PPARγ介導(dǎo)的BMSC成脂分化。

Runx2和AKP是BMSC早期成骨分化的重要標(biāo)志[17-18]。本研究中利福平導(dǎo)致地塞米松誘導(dǎo)條件下BMSC的Runx2和AKP表達(dá)增加，促進(jìn)了BMSC的成骨分化。但單獨(dú)應(yīng)用利福平并不能增加BMSC的Runx2和AKP表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用10-6mol/L地塞米松在誘導(dǎo)BMSC成脂分化的同時(shí)，BMSC也表達(dá)較弱的成骨標(biāo)志物AKP和Runx2。因此，推測(cè)利福平增強(qiáng)BMSC的成骨分化是通過(guò)調(diào)控地塞米松對(duì)BMSC的誘導(dǎo)作用而呈現(xiàn)。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)PPARγ會(huì)抑制Runx2表達(dá)，進(jìn)而抑制BMSC的成骨分化。應(yīng)用microRNA下調(diào)PPARγ表達(dá)后，Runx2表達(dá)增加[19]。因此，推測(cè)利福平是通過(guò)上調(diào)BMSC的P糖蛋白表達(dá)，降低胞內(nèi)地塞米松濃度，從而減少了PPARγ表達(dá)，削弱了PPARγ對(duì)Runx2的抑制作用，促進(jìn)BMSC成骨分化。

近年來(lái)，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)BMSC成脂分化被認(rèn)為是激素性股骨頭壞死的重要機(jī)制[4-6]。Cui等[20]利用示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)植入股骨頭內(nèi)的BMSC，全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)其在股骨頭內(nèi)轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞。前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用利福平可以減少糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭內(nèi)脂肪化，改善股骨頭內(nèi)骨形成，降低股骨頭壞死率。但有學(xué)者認(rèn)為利福平是通過(guò)誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞色素P450表達(dá)和活性，促進(jìn)激素在肝臟的代謝，削弱激素的藥理作用，降低激素性股骨頭壞死[21]。本研究有力支持了利福平可直接通過(guò)上調(diào)股骨頭內(nèi)BMSC的P糖蛋白活性，抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的BMSC成脂分化，促進(jìn)成骨分化。

總之，利福平通過(guò)上調(diào)BMSC的P糖蛋白活性，降低地塞米松在BMSC胞內(nèi)蓄積，抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的BMSC成脂分化。這為利福平靶向應(yīng)用于股骨頭預(yù)防激素性股骨頭壞死提供了理論依據(jù)。

[1] Grané li C, Karlsson C, Brisby H,et al. The effects of PPAR-γ inhibition on gene expression and the progression of induced osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J]. Connect Tissue Res, 2014,55： 262-274.

[2] Takada I, Kouzmenko AP, Kato S. Molecular switching of osteoblastogenesis versus adipogenesis： implications for targeted therapies[J]. Expert Opin Ther Targets, 2009,13： 593-603.

[3] Gharibi B, Abraham AA, Ham J,et al. Adenosine receptor subtype expression and activation influence the differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and adipocytes[J]. J Bone Miner Res, 2011,26： 2112-2124.

[4] Han N, Yan Z,Guo CA, et al. Effects of p-glycoprotein on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Calcif Tissue Int, 2010,87： 246-253.

[5] Lee MJ, Chen HT, Ho ML,et al. PPARγ silencing enhances osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. J Cell Mol Med, 2013,17： 1188-1193.

[6] Sun ZB, Wang JW, Xiao H, et al. Icariin may benefit the mesenchymal stem cells of patients with steroid-associated osteonecrosis by ABCB1-promoter demethylation： a preliminary study[J]. Osteoporos Int, 2015,26： 187-197.

[7] Li Z, Zhao D, Wang B. ABCB1 gene polymorphisms and glucocorticoid-induced avascular necrosis of the femoral head susceptibility： a meta-analysis[J]. Med Sci Monit, 2014,20： 2811-2816.

[8] Sun Z, Yang S, Ye S, et al. Aberrant CpG islands’ hypermethylation of ABCB1 in mesenchymal stem cells of patients with steroid-associated osteonecrosis[J]. J Rheumatol, 2013,40： 1913-1920.

[9] Yin L, Li YB, Wang YS. Dexamethasone-induced adipogenesis in primary marrow stromal cell cultures： mechanism of steroid-induced osteonecrosis[J]. Chin Med J (Engl), 2006,119： 581-588.

[10] Song G, Ju Y, Shen X, et al. Mechanical stretch promotes proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2007,58： 271-277.

[11] Feller N, Kuiper CM, Lankelma J,et al. Function detection of MDR1/P170 and MRP/P190-mediated multidrug resistance in tumor cells by flow cytometry[J]. Br J Cancer, 1995,72： 543-549.

[12] Naito M, Omoteyama K, Mikami Y,et al. Inhibition of Wnt/β-catenin signaling by dexamethasone promotes adipocyte differentiation in mesenchymal progenitor cells, ROB-C26[J]. Histochem Cell Biol, 2012,138： 833-845.

[13] Wang Y, Li J, Liu M, et al. Inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor-γ in steroid-induced adipogenic differentiation of the bone marrow mesenchymal stem cells of rabbit using small interference RNA[J]. Chin Med J (Engl), 2014,127： 130-136.

[14] 潘志宏，韓寧. P糖蛋白抑制對(duì)體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版， 2010，37： 396-408.

[15] Nakaichi M, Takeshita Y, Okuda M, et al. Expression of the MDR1 gene and P-glycoprotein in canine mast cell tumor cell lines[J]. J Vet Med Sci, 2007,69： 111-115.

[16] Ghali O, Broux O, Falgayrac G,et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation[J]. BMC Cell Biol, 2015,16： 9.

[17] Takahashi T. Overexpression of Runx2 and MKP-1 stimulates transdifferentiation of 3T3-L1 preadipocytes into bone-forming osteoblasts in vitro[J]. Calcif Tissue Int, 2011,88： 336-347.

[18] Mikami Y, Takahashi T, Kato S,et al. Dexamethasone promotes DMP1 mRNA expression by inhibiting negative regulation of Runx2 in multipotential mesenchymal progenitor, ROB-C26[J]. Cell Biol Int, 2008,32： 239-246.

[19] Sun J, Wang Y, Li Y,et al. Downregulation of PPARγ by miR-548d-5p suppresses the adipogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells and enhances their osteogenic potential[J]. J Transl Med, 2014,12： 168.

[20] Cui Q, Wang GJ, Balian G. Pluripotential marrow cells produce adipocytes when transplanted into steroid-treated mice[J]. Connect Tissue Res, 2000,41： 45-56.

[21] Masada T, Iwakiri K, Oda Y, et al. Increased hepatic cytochrome P4503A activity decreases the risk of developing steroid-induced osteonecrosis in a rabbit model[J]. J Orthop Res, 2008,26： 91-95.

Rifampicin inhibits dexamethasone-induced adipogenesis of bone marrow stem cells and its mechanism

HANNing1,2，LIZeng-chun1，CAIZheng-dong2,3，XUChong1

(1. Dept.of Traumatic Surgery, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China; 2. Dept.of Orthopaedics, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 3. Dept. of Orthopaedics, First People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China)

Objective To investigate the effect of rifampicin on dexamethasone-induced adipogenesis of bone marrow stem cells (BNSCs) and its mechanism. Methods BMSCs were isolated from Sprague-Dawley rats and randomly divided into 4 groups. Group A was treated with 5μg/ml rifampicin and 10-6mol/L dexamethasone; group B was treated with PBS and 10-6mol/L dexamethasone; group C and group D were treated with 5μg/ml rifampicin and PBS, respectively. P-glycoprotein activity and intracellular dexamethasone accumulation with the pretreatment of 5μg/ml rifampicin were determined by flow cytometry and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)，respectively. After 14 days, BMSCs in all groups were observed under light microscope after Oil red O and alkaline phosphatase staining; triglyceride and alkaline phosphatase (AKP) activity levels were measured, peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) mRNA and runt-related transcription factor 2 (Runx2) mRNA level were detected by RT-fqPCR. Results Intracellular rhodamine123 fluorescence and dexamethasone level significantly decreased after 5μg/ml rifampicin treatment. Adipogenesis was showed in group B with increased PPARγ mRNA and triglyceride level. There were not adipogensis in group A, group C and group D. AKP staining and levels in group A were higher than those in group B. Conclusion Rifampicin can enhance P-gp activity and inhibit glucocorticoid-induced adipogenesis in BMSCs.

Rifampicin; P-glycoprotein; glucocorticoid; bone marrow stromal cells; adipogenesis

10.16118/j.1008-0392.2016.03.004

2016-01-21

浦東新區(qū)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才資助基金(PWRq2012-13)

韓 寧(1980—)，男，主治醫(yī)師，博士.E-mail: smztmp@126.com

李增春.E-mail: smztmp@126.com

R 521

A

1008-0392(2016)03-0021-07