人正常子宮內(nèi)膜原代腺上皮細(xì)胞的優(yōu)化分離和培養(yǎng)

陸 雯， 瞿俊杰， 萬小平

(同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院婦產(chǎn)科，上海 201204)

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·基礎(chǔ)研究·

人正常子宮內(nèi)膜原代腺上皮細(xì)胞的優(yōu)化分離和培養(yǎng)

陸 雯， 瞿俊杰， 萬小平

(同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院婦產(chǎn)科，上海 201204)

目的 優(yōu)化人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的方法，提供子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病研究的體外細(xì)胞模型。方法 采用酶消化、篩網(wǎng)過濾、離心的方法體外分離和培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜腺上皮與間質(zhì)細(xì)胞。腺上皮細(xì)胞鑒定采用光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；免疫細(xì)胞熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測上皮細(xì)胞角蛋白(CK)和間質(zhì)細(xì)胞波形蛋白(Vim)的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)診刮獲得的18份標(biāo)本中有17份分離培養(yǎng)成功；細(xì)胞形態(tài)符合腺上皮細(xì)胞特征，CK免疫熒光及免疫化學(xué)染色陽性，Vim染色陰性，純度達(dá)90%以上；正常原代人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞不能傳代，培養(yǎng)5～6d后細(xì)胞逐漸衰老。結(jié)論 改良后的原代培養(yǎng)方法取材簡單，克服了污染問題，可獲得高純度及足夠數(shù)量的人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

子宮內(nèi)膜； 腺上皮細(xì)胞； 細(xì)胞原代培養(yǎng)

正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立是研究子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的重要手段。與腫瘤細(xì)胞能永生化生長及傳代的特征不同，正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞體外生長困難，不能傳代，僅能通過原代培養(yǎng)的方法獲取細(xì)胞作為研究模型[1-2]。因此，找到一種簡便、高效的原代培養(yǎng)方法對(duì)子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的研究至關(guān)重要。目前已有的方法存在取材困難(多數(shù)為術(shù)中切除子宮后刮取)、經(jīng)陰道取材易污染、獲取細(xì)胞數(shù)較少等問題，使正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)較為困難。本研究從取材、分離及培養(yǎng)方法等方面進(jìn)行了改進(jìn)，為人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了簡便高效的方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本獲取

標(biāo)本取自2014年7至10月在本院婦科因異常子宮出血接受經(jīng)陰道診刮患者的子宮內(nèi)膜18例，其中10例為宮腔鏡下取得?；颊吣挲g28～45歲，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受激素治療。所有標(biāo)本均經(jīng)H-E染色及病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜組織。

1.2 主要試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM/F12 (1∶1) (美國,Gibco)，胎牛血清 (美國,HyClone)，胰蛋白酶(美國,HyClone)；青霉素100U/ml 、鏈霉素100U/ml、甲硝唑100U/ml (中國，江陰齊氏)；自配磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline， PBS)；自配D-Hank’S平衡鹽溶液( hank’s balanced salt solution， HBSS)；廣譜細(xì)胞角蛋白(cytokeratin， CK) 抗體(美國,Sigma) 及細(xì)胞波形蛋白(Vimentin， Vim) 抗體(美國, CST)；150μm 及38μm篩網(wǎng)(中國，上海實(shí)生)；恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080，上海精宏)；離心機(jī)(德國，Eppendorf Centrifuge 5810R)；倒置顯微鏡(TS100， Nikon)等。

1.3 人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)

參照Zhang[3]和Osteen等[4]的方法，加以改良。(1) 無菌條件下刮取子宮內(nèi)膜組織3～5g，刮宮時(shí)于后穹窿放置無菌小紗布，盡量避免組織與陰道壁接觸；將內(nèi)膜組織置于盛有3ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12，加雙抗及甲硝唑)的無菌收集管中，盡快進(jìn)行分離培養(yǎng)；(2) 超凈臺(tái)下操作，以D-Hank’S液+雙抗 (青霉素100U/ml+鏈霉素100U/ml)+甲硝唑100U/ml洗液洗滌組織3次，并浸泡5min；再以細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，盡量去除紅細(xì)胞；(3) 將內(nèi)膜組織剪碎成2～3mm3小塊，使用0.1%胰酶-EDTA消化，置37°C恒溫消化約30min，每隔10min震蕩一次, 并鏡檢觀察其消化情況；(4) 將消化后的組織細(xì)胞懸液輕柔吹打，使用100目(150μm孔徑)篩網(wǎng)過濾組織懸液，去除黏液及未消化組織；(5) 濾過液再使用400目(38μm孔徑)篩網(wǎng)過濾分離上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞；收集濾液，離心半徑10cm，1000r /min，離心10min，棄上清液，沉淀物主要為間質(zhì)細(xì)胞；使用細(xì)胞培養(yǎng)液反沖篩網(wǎng)，所得反沖液主要含內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞團(tuán)；(6) 離心半徑 10cm，1000r/min，離心5min，棄上清液，收集沉淀的腺上皮細(xì)胞團(tuán)；(7) 將腺細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)后接種于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基(加雙抗)，置于濕潤的含相對(duì)體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中，24h后換液。

1.4 子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞鑒定

(1) 倒置相差顯微鏡觀察腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)差異；(2) 免疫細(xì)胞熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)： 細(xì)胞角蛋白(CK)及波形蛋白(Vim)分別是上皮及間質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記。采用免疫細(xì)胞熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)法，通過檢測CK和Vim 對(duì)原代分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。將兩種細(xì)胞分別接種于多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片，4%多聚甲醛固定。一抗： 小鼠抗人細(xì)胞CK 抗體 1∶200，兔抗人細(xì)胞Vim 抗體1∶200。分別于光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡及下觀察，鏡下取10個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞純度。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞分離及培養(yǎng)結(jié)果

共獲取經(jīng)陰道診刮的子宮內(nèi)膜標(biāo)本17例，其中10例為宮腔鏡下取得。其中增殖期內(nèi)膜12例,全部分離培養(yǎng)成功；分泌期內(nèi)膜6例，5例分離培養(yǎng)成功。培養(yǎng)成功率94%，1例因發(fā)生污染培養(yǎng)失敗。每1g子宮內(nèi)膜組織可獲得(5～8)×106個(gè)成活的上皮細(xì)胞。

2.2 腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn)

子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞呈不同生長形態(tài)(圖1)。培養(yǎng)24h后腺上皮細(xì)胞貼壁，為旋渦狀排列的致密單層細(xì)胞團(tuán)，鋪路石樣生長，邊緣清晰，細(xì)胞外形似蝌蚪；3～5d細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期；6 d后腺上皮細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)開始出現(xiàn)大量空泡，邊緣模糊，逐漸衰老死亡，周圍成纖維細(xì)胞迅速生長替代上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞經(jīng)消化傳代后大量死亡，存活細(xì)胞均為間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。間質(zhì)細(xì)胞呈長梭形生長，單層，排列緊密，3～4d達(dá)對(duì)數(shù)生長期，可在傳10代以內(nèi)保持基本形態(tài)不變。

圖1 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞呈不同生長形態(tài)Fig.1 The morphology of endometrial glandular epithelial and stromal cells(400×)

2.3 免疫細(xì)胞熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

對(duì)分離所得腺上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，可見在超過90%內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中CK在胞漿內(nèi)染色陽性, 而Vim表達(dá)陰性(圖2、3)。

圖2 免疫細(xì)胞熒光對(duì)正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞純度鑒定Fig.2 The purity of isolated normal endometrial epithelia cells by immunofluorescence staining(400×)

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞純度鑒定Fig.3 The purity of isolated normal endometrial epithelia cells by immunocytochemistry staining

3 討 論

子宮內(nèi)膜隨性激素發(fā)生周期性變化是女性維持正常生育功能的必要條件，一旦這種周期平衡發(fā)生改變將會(huì)導(dǎo)致不孕、內(nèi)膜異位癥、腫瘤等疾病的發(fā)生，而這些疾病的發(fā)生機(jī)制目前尚未完全明確。從倫理及實(shí)際操作的角度而言，基于體外細(xì)胞模型的研究較體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更為簡便易行；從實(shí)驗(yàn)技術(shù)角度而言，由于子宮內(nèi)膜組織構(gòu)成復(fù)雜，若能將不同細(xì)胞成分(主要為腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞)分離培養(yǎng)將更有助于對(duì)疾病發(fā)生機(jī)制的深入研究。

正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞不能傳代和建株，因此原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)是目前子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病研究的主要體外細(xì)胞模型來源?，F(xiàn)有的方法囿于取材困難(多數(shù)為術(shù)中切除子宮后刮取)、經(jīng)陰道取材易污染、操作步驟復(fù)雜、獲取細(xì)胞數(shù)較少等問題而難以掌握應(yīng)用。本研究在取材、消化、分離技術(shù)等方面進(jìn)行了優(yōu)化，操作簡便。

首先,本研究從取材方面進(jìn)行了優(yōu)化。由于陰道內(nèi)存在大量細(xì)菌，經(jīng)陰道刮宮獲取的子宮內(nèi)膜極易受細(xì)菌污染而培養(yǎng)失敗，故既往研究中的子宮內(nèi)膜樣本多數(shù)通過手術(shù)切除子宮后直接刮取獲得[1-2]。而經(jīng)手術(shù)獲得樣本遠(yuǎn)不及刮宮獲取樣本簡便易行，且功血等疾病的子宮內(nèi)膜的取材主要經(jīng)診刮獲取[5]。主要從以下步驟進(jìn)行了優(yōu)化： (1) 取 材時(shí)在后穹窿放置無菌小紗布，盡量避免標(biāo)本與陰道壁直接接觸。(2) 獲取標(biāo)本后即放入加有雙抗及甲硝唑的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，并以加有雙抗及甲硝唑的D-Hank’S液多次沖洗標(biāo)本，并浸泡5min。由于陰道菌群主要為厭氧菌，對(duì)甲硝唑敏感，因此在培養(yǎng)液及沖洗液中加入甲硝唑可大大降低污染的發(fā)生率，本研究中取材的18例標(biāo)本僅1例發(fā)生污染。

第二，本研究對(duì)組織消化步驟進(jìn)行了改良。多數(shù)學(xué)者目前使用膠原酶對(duì)組織進(jìn)行消化，消化時(shí)間在1～2h不等[1,5-8]。膠原酶對(duì)膠原消化作用強(qiáng)，但對(duì)上皮細(xì)胞的消化作用不大，雖然能提高腺上皮細(xì)胞的存活率，但獲得的細(xì)胞數(shù)較少。王欣等[5]學(xué)者的研究采用低濃度梯度、分次消化的方法可獲得較理想的細(xì)胞活性及產(chǎn)量，但操作步驟較多，單次分離培養(yǎng)需要較長時(shí)間。本研究在團(tuán)隊(duì)既往對(duì)小鼠內(nèi)膜上皮分離培養(yǎng)采用雙酶(膠原酶Ⅰ型和胰蛋白酶聯(lián)合)多次消化的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)[9]，采用0.1%胰蛋白酶單次消化的方法，僅需要30min的消化時(shí)間可得到(5～8) ×106個(gè)成活的上皮細(xì)胞/1g內(nèi)膜組織。但需注意在消化時(shí)需每隔10min震蕩一次，并鏡檢觀察其消化情況，當(dāng)消化液中含有較多成團(tuán)上皮細(xì)胞時(shí)即可終止。

第三，本研究采用不同孔徑的濾網(wǎng)分次過濾分離細(xì)胞，簡便易行。先使用150μm孔徑的篩網(wǎng)去除黏液及未消化組織，再使用38μm孔徑的篩網(wǎng)分離上皮及間質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)過消化后上皮細(xì)胞多成團(tuán)，而間質(zhì)細(xì)胞則分散為單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過試用不同孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)38μm孔徑的篩網(wǎng)能使上皮細(xì)胞的產(chǎn)量達(dá)到較高水平，且細(xì)胞純度能達(dá)到90%。雖然Mylonas[10]在濾網(wǎng)分次過濾的基礎(chǔ)上加用Ficoll純化，可使純度達(dá)95%以上，但細(xì)胞損失量較大，是否加用此法需考慮后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需求。

綜上，本研究從取材開始優(yōu)化，并采用胰蛋白酶單次短時(shí)消化，不同孔徑的濾網(wǎng)分次過濾的方法，對(duì)人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞原代分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行了改良，為子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的研究提供了較好的體外細(xì)胞模型。

[1] 譚先杰，劉東遠(yuǎn)，郎景和，等．子宮內(nèi)膜腺上皮及基質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)作為子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞模型的探索[J]．現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2002，11(1)： 30-32.

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Optimized method for isolation and primary culture ofnormal human endometrial epithelial cells

LUWen,QUJun-jie,WANXiao-ping

(Dept. of Obstetrics and Gynecology, Shanghai First Maternity and Infant Hospital, Tongji University, Shanghai 201204, China)

Objective To develop an optimized method for separation and primary culture of normal human endometrial epithelial cells. Methods The human endometrial epithelial cells were isolated with enzymatic digestion, after filtration and centrifugation the cells were identified by light microscopy and immunocytochemistry/immunofluorescence staining with cytokeratin and vimentin monoclonal antibodies．Results The primary culture of human endometrial epithelial cells was successfully establi-shed in 17 out of 18 endometrial samples from biopsy specimens. The morphology of the cells maintained the biologic characteristics of endometrial glandular epithelial cells．The cells were stained positively with cytokeratin and negatively with vimentin (purity>90%). The glandular epithelial cells could not be passaged, and the cells aging after 5-6d. Conclusion The modified method developed in this study can be used to obtain high purity and adequate normal endometrial glandular epithelial cells for study of endometrial diseases.

endometrium； epithelial cell； primary cell culture

10.16118/j.1008-0392.2016.03.005

2015-12-28

國家自然科學(xué)基金(81402144、81272885、81472427)；同濟(jì)大學(xué)青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)行動(dòng)計(jì)劃(1400804)

陸 雯(1981—)，女，主治醫(yī)師，博士.E-mail: luwen@51mch.com

萬小平.E-mail: wanxiaoping@#edu.cn

R 246.3

A

1008-0392(2016)03-0028-04