基于DPPH、ABTS和FRAP的中藥女貞子抗氧化譜效關系研究

李昌勤 姚辰 朱榮遙 黃勇鑫 康文藝 王金梅

[摘要]運用HPLC測定不同加熱條件處理的女貞子藥材的特征圖譜，通過DPPH、ABTS和FRAP法測定不同條件處理女貞子的抗氧化能力，運用偏最小二乘法進行數(shù)據(jù)分析，研究女貞子量化特征圖譜和抗氧化活性的相關性，探討女貞子抗氧化活性的物質基礎，并篩選活性色譜峰。從35個匹配特征圖譜中篩選出S1，S2，S15，S24，S27，S29，S32，S33，S35與女貞子清除DPPH自由基能力呈顯著正相關；S1，S2，S5，S8，S16，S27，S33與女貞子清除ABTS自由基顯著正相關；S12，S20，S22，S28，S30，S31，S32，S34與女貞子還原Fe3+能力顯著正相關。其中S1，S2，S27，S33與女貞子清除DPPH自由基、ABTS自由基均正相關，S32與女貞子清除DPPH自由基、還原Fe3+能力均正相關。通過與對照品比對確定了S3為紅景天苷、S19為木犀草苷、S21為特女貞苷、S22為橄欖苦苷、S23為女貞苷、S33為木犀草素、S34為芹菜素。試驗結果表明特女貞苷和紅景天苷等雖是規(guī)定的表征女貞子藥材優(yōu)劣的指標成分，但女貞子藥效并不是靠個別成分含量決定。通過分析與藥效相關的化合物群的含量才能真實反映藥材的質量。

[關鍵詞]女貞子； 抗氧化活性； 偏最小二乘法； 譜效關系

[Abstract]Characteristic chromatogram of Ligustri Lucidi Fructus which were processed by heat treatment with different temperatures and times was developed by HPLC DPPH， ABTS and FRAP assays were performed to determine the antioxidant activity The spectrumeffect correlation was studied using Partial Least Squares（PLS）to explore the active ingredients of Ligustri Lucidi Fructus by investigating the relationship between HPLC spectrum and antioxidant activity S1， S2， S15， S24， S27， S29， S32， S33 and S35 were characteristic compounds in 35 matching characteristic chromatograms which were positive relationship with scavenging DPPH free radical activity S1， S2， S5， S8， S16， S27 and S33 were significantly positively related to scavenge ABTS free radical activity S12， S20， S22， S28， S30， S31， S32 and S34 were significantly positively related to restore Fe3+ activity Among the chromatographic peaks， S1， S2， S27 and S33were positively related to scavenge DPPH free radical and ABTS free radical activity， and S32 was positively related to scavenge DPPH free radical and restore Fe3+ activity S3， S19， S21， S22， S23， S33 and S34 were determined as salidroside， luteolin7Oglucoside， specnuezhenide， oleuropein， ligustroflavone， luteolin andapigenin， respectively The results showed that although specnuezhenide and salidroside were stipulated index compounds to evaluate the quality of Ligustri Lucidi Fructus， the Ligustri Lucidi Fructus pharmcodynamic effect did not depend on the contents of those index components The quality of traditional Chinese medicines（TCMs）should be determined by the compound groups associated with pharmcodynamic effect

[Key words]Lucidi Ligustri Fructus； antioxidant activity； partial least squares； spectrumefficacy

doi：104268/cjcmm20160917

女貞子為木犀科女貞屬植物女貞Ligustrum lucidum Ait的干燥成熟果實，性涼，味甘、苦，歸肝、腎經，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)的功效，臨床上多用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，內熱消渴，骨蒸潮熱等證[1]。女貞子主要含有萜類、黃酮類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油、脂肪酸類和氨基酸類等化學成分[2]。藥理學研究顯示具有保肝、強心、抗炎、抑菌、抗病毒、抗癌、提高免疫力、抗衰老、降血糖和降血脂等作用[2]。

癌癥、心腦血管疾病等與機體某些內源性自由基導致的生物大分子如蛋白質、核酸和DNA不可逆的氧化損傷密切相關，尤其是活性氧如超氧陰離子自由基、羥基自由基和脂質自由基等[34]。研究表明，女貞子不同提取部位均有較好的抗氧化活性[58]。

女貞子化學成分復雜，化學成分與活性量效關系尚不清楚，且女貞子指標性成分特女貞苷等有效成分會在貯藏過程中發(fā)生變化[9]，繼而影響其臨床治療。中藥“譜效關系”研究能使中藥活性成分整體特征精細表達與多指標、多靶點的作用機制緊密聯(lián)系，符合中藥作用特點，可合理確定中藥藥效物質基礎[10]。因此，本文采用經典恒溫加速法對女貞子藥材進行處理，以研究女貞子藥材化學成分變化下與藥理活性相應的變化規(guī)律，并通過偏最小二乘回歸分析方法篩選出女貞子藥材與抗氧化作用相關的色譜峰，為女貞子藥材資源的質量控制及進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1材料

島津LC20AT高效液相色譜系統(tǒng)，LC solution色譜工作站（日本島津株式會社）。InertSustain RPC18色譜柱（46 mm×150 mm，5 μm）；Multiskan MK3全波長酶標儀（美國Thermo Electron公司）；GRP9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；KQ500DB超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SB2000旋轉蒸發(fā)儀（日本東京理化株式會社）；VORTEX6漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器有限公司）；DHG9053A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），AB135S型1/10萬級電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司，瑞士）。

DPPH（1，1diphenyl2picrylhydrazyl，日本東京化成工業(yè)株式會社），2，2′連氨（3乙基苯并噻唑啉6磺酸）二氨鹽（ABTS，美國Fluka公司）；Fe3+三吡啶三亞嗪（TPTZ，比利時Acros organics公司）；二丁基羥基甲苯（butylatedhydroxytoluene，比利時Acros organics公司，BHT）；沒食子酸丙酯（propyl gallate，比利時Acros organics公司，PG）；丁基羥基茴香醚（butylatedhydroxyanisole，比利時Acros organics公司，BHA）；甲醇（美國Fisher公司，色譜純），乙腈（美國Fisher公司，色譜純），水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

女貞子藥材2013年冬至后采集于河南大學金明校區(qū)植物園，經河南大學中藥研究所李昌勤教授鑒定為木犀科植物女貞L lucidum的干燥成熟果實，標本存放于河南大學中藥研究所。

2方法

21經典恒溫加速試驗

將均勻分裝好的48份女貞子樣品稱重后均勻置于50，60，70，80 ℃恒溫干燥箱（恒溫±02 ℃）中，根據(jù)樣品存放溫度不同，每個溫度段設定相應4個時間點，每個時間點3個平行，并在規(guī)定時間內取出樣品，立刻冷卻至室溫，稱重，備用。

22樣品溶液制備

按照文獻[9]，將加速試驗后的女貞子搗碎，取女貞子碎片2 g，精密稱定，每個樣品做3個平行，分別加入藥材10倍量的水，浸泡30 min后煎煮回流30 min，2層紗布趁熱過濾，藥渣加藥材6倍量的水，煎煮回流30 min，2層紗布趁熱過濾，用力擠干，合并兩次濾液，放涼后置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過022 μm濾膜，即得。

23 DPPH法

參照文獻[1112]，將10 μL樣品溶液和175 μL 200 μmol·L-1的DPPH溶液先后加入至96微孔板中，置陰暗處反應20 min后，用酶標儀在492 nm處測定A。每份樣品平行操作3次，取平均值，計算出清除率，并運用SPSS 190軟件進行probit回歸，預測樣品的IC50。

24ABTS法

參照文獻[13]，將ABTS配制成7 mmol·L-1的水溶液，與配制成的245 mmol·L-1的K2S2O8水溶液混合，使用前在暗處放置12 h以上，使用時用甲醇稀釋使吸光度在734 nm處為078～082，待用。取10 μL樣品加入200 μL ABTS自由基工作液混勻測定A。每份樣品平行3次，取平均值，計算出清除率及半數(shù)抑制率IC50。

25FRAP法

參照文獻[14]，取10 μL樣品加入到96微孔板中，加入200 μL新鮮配制的TPTZ工作液，混勻，37 ℃暗處反應30 min后，用酶標儀在595 nm處測定A。每份樣品平行測定3次，取平均值。測定不同濃度的Trolox吸光度繪制標準曲線，樣品抗氧化結果以Trolox當量（mmol·g-1）表示。

26女貞子藥材特征圖譜分析

色譜條件為InertSustain RPC18色譜柱（46 mm×150 mm，5 μm），流動相甲醇（A）02%冰乙酸水溶液（B）梯度洗脫（0～18 min，20%～26% A；18～30 min，26%～30% A；30～50 min，30%～35% A；50～60 min，35% A；60～72 min，35%～44% A；72～120 min，44%～50% A；120～125 min，50%～100% A；125～150 min，100% A），流速06 mL·min-1，檢測波長240 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，測定。見圖1。

27數(shù)據(jù)分析

本試驗采用偏最小二乘回歸分析方法對女貞子量化特征圖譜數(shù)據(jù)和抗氧化活性數(shù)據(jù)分別進行分析。分析前，采用中國藥典委員會推薦的軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 10 A版》對特征圖譜的各峰保留時間進行校正，并對其峰面積進行標準化處理，得到量化特征峰的數(shù)據(jù)。采用DPS705分析軟件，以色譜峰面積為自變量（X），抗氧化活性數(shù)據(jù)為因變量（Y），建立偏最小二乘回歸方程，分別篩選出與清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和還原Fe3+能力顯著相關的色譜峰。

3 結果

31女貞子藥材抗氧化活性測定結果

不同加速溫度及時間點的女貞子樣品清除DPPH，ABTS自由基的IC50和還原Fe3+能力的Trolox當量值，見表1。

32量化色譜峰的確定

用軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 10 A版》，以女貞子藥材生品水煎液色譜圖為參照譜，時間窗口05 min，選擇各圖譜中均含有且峰形相對較好的色譜峰位進行多點校正，釆用平均數(shù)法生成對照圖譜。結果17張?zhí)卣鲌D譜匹配出個79共有峰。由于女貞子樣品中所含部分化合物隨經典恒溫加速試驗差異變化不大。某些微量成分也有可能也對抗氧化活性產生影響，故將部分峰形較好，但含量較低的色譜峰也納入考察范圍。最終選擇35個色譜峰作為研究對象，見圖2。女貞子藥材特征圖譜色譜峰匹配數(shù)據(jù)見表2。

33譜效關系的偏最小二乘回歸分析

331偏最小二乘回歸方程的建立以女貞子各樣品的抗氧化活性數(shù)據(jù)作為因變量，樣品量化特征圖譜色譜峰信息作為自變量，利用DPS705統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行Zscore標準化處理，然后對其進行偏最小二乘回歸分析，見圖3，數(shù)據(jù)標準化后模型誤差平方和r2隨潛在因子增加逐漸增大又減小，在潛在因子達到16時，R2達到最大，分別解釋自變量方差8686%，8735%，9744%，并得到3個回歸方程，如下。

332變量投影重要性分析結果見圖4。自變量的標準化回歸系數(shù)的絕對值越大，則該自變量對因變量的影響就越顯著[15]。若標準化回歸系數(shù)為正，該自變量與因變量呈正相關，反之則為負相關。VIP（變量投影重要性）圖的縱坐標值越大，說明該自變量對相應因變量的貢獻越大。

偏最小二乘回歸結果表明：S1，S2，S15，S24，S27，S29，S32，S33，S35與DPPH法IC50的相反數(shù)呈正相關且其回歸系數(shù)絕對值和VIP值較大，當它們含量增加時，樣品清除DPPH自由基的能力增強，其中S27，S29，S32，S33，S35更有統(tǒng)計意義；S13，S14，S21，S22，S26，S34與DPPH法IC50的相反數(shù)呈負相關且其回歸系數(shù)絕對值和VIP值較大，當它們含量增加時，樣品清除DPPH自由基的能力減弱，其中S21，S34更有統(tǒng)計意義。

S1，S2，S5，S8，S16，S27，S33與ABTS法IC50的相反數(shù)呈正相關且其回歸系數(shù)絕對值和VIP值較大，當它們含量增加時，樣品清除ABTS自由基的能力增強，其中S2，S5，S33更有統(tǒng)計意義；S13，S14，S20，S21，S22，S24，S34與ABTS法IC50的相反數(shù)呈負相關且其回歸系數(shù)絕對值和VIP值較大，當它們含量增加時，樣品清除ABTS自由基的能力減弱，其中S13，S14，S21，S22，S24更有統(tǒng)計意義。

S12，S20，S22，S28，S30，S31，S32，S34與FRAP法的Trolox當量值呈正相關且其回歸系數(shù)絕對值和VIP值較大，當它們含量增加時，樣品還原三價鐵離子的能力增強，其中S20，S22，S30，S31，S32更有統(tǒng)計意義；S11，S13，S15，S25，S33與FRAP法的Trolox當量值呈負相關且其回歸系數(shù)絕對值和VIP值較大，當它們含量增加時，樣品還原三價鐵離子的能力減弱，其中S25更有統(tǒng)計意義。

34色譜峰成分鑒定

文獻報道[16]，不同來源的女貞子水煎液中均含有紅景天苷、酪醇、特女貞苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素等有效成分。結合本課題組現(xiàn)有條件，采用文獻中報道的成分的對照品在HPLC上進樣，匹配出峰3為紅景天苷、峰19為木犀草苷、峰21為特女貞苷、峰22為橄欖苦苷、峰23為女貞苷、峰33為木犀草素、峰34為芹菜素，色譜圖見圖5。

4 討論

文獻報道，紅景天苷、木犀草苷等7種成分均有顯著的體外抗氧化活性[1924]，但本研究僅篩選出橄欖苦苷、木犀草素和芹菜素具有抗氧化作用。其中，橄欖苦苷和木犀草素與女貞子清除DPPH和ABTS自由基能力呈正相關，對Fe3+還原能力呈負相關，而芹菜素僅與女貞子的Fe3+還原能力呈正相關。中藥的藥效并不僅僅是基于某個或幾種化合物，而可能是基于一個或幾個化合物或微量成分的化合物群，而在貯存或處理的過程中，這些化合物群相互之間可能會進行此消彼長的可逆或不可逆的轉化，在這種轉過過程中，藥效也在進行相應的變化。

文獻檢索發(fā)現(xiàn)，已報道的中藥材飲片“譜效關系”的研究均是基于不同產地、不同采收期、不同來源的藥材而進行的[15，2528]。而同種藥材在長期的地域化差異下，會有很多變種，那么相應所含的化學成分和微量元素含量也有差別。在這種情況下進行的“譜效關系”研究是否忽略了某些細微的但可能起決定因素的信息？結果是否可信？“譜效關系”研究是否能基于同一來源的藥材或飲片而排除上述干擾因素進行？課題組前期采用經典恒溫加速試驗對中藥的有效期進行過研究，發(fā)現(xiàn)經加速后的藥材或飲片中的有效成分均有不同程度的變化[2930]。因此，本文采用經典恒溫法對藥材進行差異化前處理，以對女貞子藥材的藥效物質基礎進行準確的篩選。

偏最小二乘回歸是典型的譜效關系研究常用數(shù)據(jù)處理方法，其融合了主成分分析、典型相關分析和多元線性回歸分析這三種分析手段，能夠在模型自變量存在嚴重多重相關性且樣本量較少的情況下進行回歸分析。偏最小二乘回歸擬合的數(shù)學模型包含了原有自變量的信息，更容易判別系統(tǒng)信息與“噪聲”，甚至是非隨機性的“噪聲”。因此，偏最小二乘回歸在分析類似于中藥特征圖譜這樣小樣本、高維度的數(shù)據(jù)時有獨特的優(yōu)勢。

本文雖然篩選出了女貞子不同機制的抗氧化活性相關色譜峰，但尚不完全了解其結構特征。下一步將通過質譜等手段對其進行結構鑒定，以進一步辨識出女貞子的相關藥效物質基礎，為女貞子藥材資源的質量控制及進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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[責任編輯丁廣治]