大孔樹(shù)脂分離純化狀元豆黃酮及其抗油脂氧化研究

黎英 劉春艷 潘銀來(lái) 李子月 曾珍清 鄭蘭香 陳雪梅

摘 要 為研究大孔樹(shù)脂對(duì)狀元豆黃酮的純化工藝條件和效果，以狀元豆黃酮粗提液為原料，吸附率和解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較6種不同樹(shù)脂對(duì)狀元豆黃酮的靜態(tài)吸附和解吸性能，篩選出AB-8樹(shù)脂進(jìn)行分離狀元豆黃酮，并考察了純化前后狀元豆黃酮對(duì)食用油脂（豬油和花生油）的抗氧化效果。結(jié)果表明：最佳工藝條件為上樣質(zhì)量濃度4.0 mg/mL，上樣流速3.0 BV/h，上樣體積140 mL，用60 mL 65%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（pH6.0）為洗脫劑，以2.0 BV/h流速洗脫，得到AB-8樹(shù)脂對(duì)狀元豆黃酮的吸附率和解吸率分別為93.06%和95.12%，回收率為89.04%，得率為52.46%，純度提高了約2.91倍。狀元豆黃酮對(duì)油脂有一定的抗氧化效果，對(duì)豬油氧化抑制效果好于花生油，且純化后抗氧化效果明顯增強(qiáng)，是一種潛在的天然抗氧化劑資源。

關(guān)鍵詞 狀元豆；黃酮；大孔吸附樹(shù)脂；純化；油脂；抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

狀元豆學(xué)名大萊豆（Phaseolus limensis Macf.），為豆科（Leguminosae），蝶形花亞科（Papilionoideae），菜豆屬（Phaseolus），一年生纏繞草本植物。是福建閩西種植歷史悠久的地方性特色經(jīng)濟(jì)作物，具有較高的食用和藥用保健價(jià)值，且富含黃酮和多糖類(lèi)物質(zhì)[1-4]?，F(xiàn)有研究表明，其性平和，味甘美，具有補(bǔ)血、祛濕、強(qiáng)腎、健胃、養(yǎng)顏防衰老等功效，在抗氧化、通便、防止骨質(zhì)疏松、抑制癌細(xì)胞等方面也有顯著的作用[5-6]。

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)天然抗氧化劑，于植物體內(nèi)廣泛存在，具有清除自由基、抑菌、抗氧化和預(yù)防心血管疾病等功效。樹(shù)脂吸附分離技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的一種分離、純化天然產(chǎn)物有效成分的方法，可顯著提高有效成分的相對(duì)含量，具有選擇性好、吸附容量大、吸附迅速、操作簡(jiǎn)單、成本低、解吸容易、環(huán)保及可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)[7]。目前，有關(guān)大孔吸附樹(shù)脂分離純化植物中黃酮類(lèi)化合物的研究較多[8-12]，但是由于不同來(lái)源的植物黃酮組成和極性強(qiáng)弱存在差別，所適用的樹(shù)脂類(lèi)型也就有一定差異。而近年來(lái)，僅有少量研究針對(duì)狀元豆?fàn)I養(yǎng)成分、栽培、活性成分提取進(jìn)行探討[1-4]，對(duì)狀元豆黃酮提取物的純化及對(duì)油脂的抗氧化作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

基于以上研究背景及前期試驗(yàn)獲得狀元豆黃酮基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)狀元豆黃酮粗提液進(jìn)行分離，對(duì)6種大孔樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)篩選，通過(guò)靜態(tài)、動(dòng)態(tài)試驗(yàn)研究狀元豆黃酮的分離純化工藝，同時(shí)與油脂常用的Vc抗氧化劑進(jìn)行比較，探討了純化前后的狀元豆黃酮化合物對(duì)不同油脂的抗氧化效果，以期獲得有效提高狀元豆黃酮的富集條件，為狀元豆黃酮工業(yè)化生產(chǎn)和作為新型天然食品抗氧化劑的開(kāi)發(fā)利用及研發(fā)具有保健功效的含油食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 狀元豆，由龍巖市上杭縣農(nóng)科所提供；蘆丁，美國(guó)Sigma公司；樹(shù)脂XDA-9、S-8、DM-130、AB-8、ADS-17、HPD-100，廈門(mén)柏嘉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、維生素C、三氯甲烷、碘、冰乙酸、碘化鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純；花生油、豬油市購(gòu)。

1.1.2 設(shè)備與儀器 循環(huán)水多用真空泵（SHB-3型）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2002型），鄭州杜甫儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800型），日本島津公司；精密pH計(jì)（PHS-3C型），上海雷磁儀器廠；電熱恒溫水浴鍋（DK-S24型），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子分析天平（TB-114型），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；玻璃層析柱（Ф35 mm×800 mm、Ф10mm×300 mm）、自動(dòng)部分收集器（BSZ-100型）、恒流泵（DHL-A型），上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理 將XDA-9、S-8、DM-130、AB-8、ADS-17、HPD-100大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸制，攪拌，待樹(shù)脂沉淀，傾去上層懸浮小顆粒。選?。ě?5 mm×800 mm）玻璃層析柱，濕法裝柱。先用95%乙醇以2 BV/h洗脫至流出液加等量蒸餾水不變渾濁后，再用蒸餾水洗脫至無(wú)醇味。用5% HCl溶液浸泡5 h后蒸餾水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡5 h后蒸餾水洗至中性，用蒸餾水浸泡備用。

1.2.2 狀元豆黃酮提取、鑒定及含量測(cè)定

（1）狀元豆黃酮粗提液的制備。將狀元豆干燥、粉碎過(guò)60目篩，脫脂備用。準(zhǔn)確稱取一定量放入150 mL三角瓶中，按照文獻(xiàn)[3]中參數(shù)略作修改提取狀元豆黃酮，即按液料比30 ∶ 1（mL/g）加入60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在設(shè)定的超聲處理?xiàng)l件（40 ℃、工作1.5 s、間隙2 s）、450 W的超聲功率下提取40 min，提取2次后真空抽濾，濃縮，得狀元豆黃酮的粗提液。真空干燥備用。

（2）黃酮的定性檢驗(yàn)。鹽酸鎂粉反應(yīng)：于狀元豆黃酮的乙醇提取液中加入少許鎂粉，振搖后滴入幾滴濃鹽酸，1～2 min后觀察顏色變化。

氫氧化鈉溶液反應(yīng)：于狀元豆黃酮的乙醇提取液中加入幾滴1%的NaOH， 1～2 min后觀察顏色變化。

三氯化鋁溶液反應(yīng)：于狀元豆黃酮的乙醇提取液中加入幾滴1%的AlCl3，通過(guò)紙斑反應(yīng)，1～2 min后置于紫外光下觀察顏色變化。

（3）黃酮的含量測(cè)定。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照文獻(xiàn)[3]方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：A=10.585C+0.046 4，R2=0.999 8，C（黃酮質(zhì)量濃度）在0.0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)與A（吸光度）具有良好的線性關(guān)系。將粗提液稀釋?zhuān)? mL置于25 mL容量瓶中，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線同法操作后測(cè)吸光度值，代入回歸方程計(jì)算提取液中總黃酮含量。

1.2.3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)

（1）大孔樹(shù)脂的靜態(tài)篩選。分別稱取2.0 g上述處理好的6種（XDA-9、S-8、DM-130、AB-8、ADS-17、HPD-100）大孔樹(shù)脂，于150 mL具塞磨口錐形瓶中，依次加入30.0 mL質(zhì)量濃度為2.407 mg/mL的狀元豆黃酮粗提液，振蕩（25 ℃，120 r/min，24 h），將樹(shù)脂過(guò)濾，測(cè)定濾液吸光度并計(jì)算平衡質(zhì)量濃度。用蒸餾水沖洗上述吸附飽和的樹(shù)脂3～5次，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇50.0 mL振蕩（25 ℃，120 r/min，24 h），過(guò)濾測(cè)定各樹(shù)脂解吸液吸光度并計(jì)算解吸液質(zhì)量濃度，按以下公式計(jì)算各樹(shù)脂吸附量、吸附率、解吸率和回收率，選出最佳的分離純化狀元豆黃酮大孔樹(shù)脂。

（2）大孔樹(shù)脂AB-8的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)。按照1.2.3-（1）節(jié)所述方法振蕩吸附，測(cè)定1、2、3、4、5、7、9、11、13、15、18、21、24 h的吸附平衡液中狀元豆黃酮質(zhì)量濃度，繪制動(dòng)力學(xué)曲線。

（3）上樣液質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8吸附效果的影響。用蒸餾水將狀元豆粗提物配制成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL的上樣液，各取50 mL分別加至經(jīng)預(yù)處理好的2.0 g樹(shù)脂，振蕩（25 ℃、120 r/min、4 h）后測(cè)定各吸附平衡液狀元豆黃酮質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算吸附率。

（4）上樣液pH值對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8吸附效果的影響。準(zhǔn)確稱取7份2.0 g預(yù)處理好的樹(shù)脂于150 mL具塞磨口錐形瓶中，各分別加入pH值（用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)）為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0上樣液50 mL（質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL），振蕩（25 ℃、120 r/min、4 h）后測(cè)定各吸附平衡液狀元豆黃酮質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算吸附率。

（5）洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8解吸效果的影響。將吸附飽和的樹(shù)脂用蒸餾水沖洗除去殘留液后抽濾，分別加入體積分?jǐn)?shù)為35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液各50 mL，振蕩（25 ℃、120 r/min、24 h）后測(cè)定各解吸平衡液狀元豆黃酮質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算洗脫率。

（6）洗脫液pH值對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8解吸效果的影響。將吸附飽和的樹(shù)脂用蒸餾水沖洗除去殘留液后抽濾，加入用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為65%）各50 mL，振蕩（25 ℃、120 r/min、24 h）后測(cè)定各解吸平衡液狀元豆黃酮質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算洗脫率。

1.2.4 大孔樹(shù)脂AB-8動(dòng)態(tài)吸附、洗脫試驗(yàn)

（1）上樣流速和體積對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8吸附效果的影響。用濕法裝柱，將10 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂AB-8裝入玻璃層析柱（Ф10 mm×300 mm，1BV約20 mL）。按上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取一定體積質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的狀元豆黃酮粗提液，用恒流泵調(diào)節(jié)分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 BV/h流速通過(guò)樹(shù)脂柱，用部分收集器以每10 mL為一組收集流出液，并測(cè)定各流出液狀元豆黃酮質(zhì)量濃度，繪制流出液黃酮質(zhì)量濃度變化曲線。

（2）洗脫流速對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8解吸效果的影響。按上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)吸附條件，把7份質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的狀元豆黃酮粗提液，分別以3 BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂柱，待吸附完全后，用蒸餾水以3～4 BV/h流速?zèng)_洗樹(shù)脂柱至流出液無(wú)色（以除去多糖及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，用苯酚-濃硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)）。再用一定體積65%乙醇溶液（pH6.0）分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 、4.0 BV/h洗脫流速（用恒流泵調(diào)節(jié)）進(jìn)行洗脫，用部分收集器收集洗脫液，測(cè)定流出液狀元豆黃酮吸光度并計(jì)算其質(zhì)量濃度，繪制AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

（3）洗脫體積對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8解吸效果的影響。按1.2.4-（2）節(jié)條件操作，一定體積65%的乙醇溶液（pH6.0）用恒流泵調(diào)節(jié)以2 BV/h的洗脫速度進(jìn)行洗脫，10 mL體積收集1管，測(cè)定、計(jì)算并繪制變化曲線。

1.2.5 狀元豆黃酮對(duì)油脂抗氧化試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[13]推薦的碘量法，油脂中的過(guò)氧化物在無(wú)水酸性條件下，使I-定量氧化成I2，I2與I-結(jié)合生成易溶于水的I3-，利用標(biāo)準(zhǔn)碘液吸光值與I3-的吸光值進(jìn)行比較定量。參考文獻(xiàn)[24]的方法處理，在25 mL具塞比色管中，依次加入2.0 mL冰醋酸-氯仿和1.0 mL 1%淀粉溶液，分別取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL已標(biāo)定過(guò)的KI-I2標(biāo)準(zhǔn)溶液（含碘 0.00～1.26 μg），加去離子水定容至刻度，搖勻，取上層清液，以去離子水為參比，在353 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，I2含量（m/μg）對(duì)吸光度值（A）的線性回歸方程為：m=224.215 3A+56.078 5，R2=0.998 5。

采用國(guó)際上通用的Schall烘箱強(qiáng)化貯存法考察狀元豆黃酮提取物對(duì)油脂的抗氧化作用[14]，于250 mL錐形瓶中各稱取20 g動(dòng)物油（或花生油），分為8組，每組設(shè) 3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，加入不同比例（0.02%、0.04%、0.06%）的狀元豆黃酮提取物和0.02%Vc，用漩渦混合器搖勻后，與空白對(duì)照組（未添加任何抗氧化劑的油脂）置于（65±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中加速氧化，間隔一段時(shí)間取定量待測(cè)試油樣于15 mL干燥的比色管中，加入冰醋酸-氯仿混合溶液3 mL混勻，再加入飽和KI堿液0.2 mL輕搖30 s，然后置暗處3 min，去離子水加至刻度后加塞，顛倒混勻 2～3次，靜置約5～10 min，待水相澄清后，取上清液于353 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)，以空白作參比，并由回歸方程計(jì)算出碘含量。按下式計(jì)算POV（油脂過(guò)氧化值）及η（抗氧化劑對(duì)油脂的氧化抑制率）。比較不同濃度狀元豆黃酮對(duì)油脂抗氧化作用[15-17]。

式中POV0為未對(duì)油脂進(jìn)行強(qiáng)制氧化初始時(shí)的過(guò)氧化值；POV1為添加抗氧化劑（黃酮或Vc）的油脂強(qiáng)制氧化后的過(guò)氧化值；POV2為空白對(duì)照組（即未添加任何抗氧化劑的油脂）強(qiáng)制氧化后的過(guò)氧化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 狀元豆黃酮提取物的鑒定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，狀元豆黃酮提取物與鹽酸鎂粉、NaOH和AlCl3溶液反應(yīng)，依次產(chǎn)生橙色泡沫溶液、溶液變黃色及在紫外光下呈黃綠色熒光，綜合3個(gè)顏色試驗(yàn)，初步鑒定得出狀元豆提取液中含有黃酮類(lèi)化合物[18]。

2.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

2.2.1 大孔樹(shù)脂類(lèi)型的確定 通過(guò)比較不同型號(hào)樹(shù)脂的極性、孔徑大小、比表面積及考察靜態(tài)吸附解吸試驗(yàn)對(duì)狀元豆黃酮吸附和解吸特性，篩選出適合狀元豆黃酮分離純化的最優(yōu)樹(shù)脂（見(jiàn)表1）。從表1可知，6種樹(shù)脂的吸附和解吸性能差異較大，其中AB-8樹(shù)脂的吸附率、解吸率和回收率，顯著高于其他5種樹(shù)脂（p<0.05）。HPD-100樹(shù)脂吸附率雖比較高，但解吸率比較低，而S-8樹(shù)脂的解吸率雖然與AB-8樹(shù)脂相近，但吸附率卻明顯低于AB-8樹(shù)脂。其原因可能是由于狀元豆黃酮類(lèi)化合物含有酚羥基，呈現(xiàn)一定的弱極性，在孔徑較小的弱極性AB-8樹(shù)脂上更容易吸附，故吸附量相對(duì)較高；同時(shí)可能由于AB-8樹(shù)脂比表面積較大，有利于洗脫，故解吸率和回收率相應(yīng)也較大?？紤]到樹(shù)脂對(duì)狀元豆黃酮類(lèi)化合物的分離富集效果、洗脫難易及解吸率高低，故選定AB-8大孔樹(shù)脂作進(jìn)一步研究。

2.2.2 大孔樹(shù)脂AB-8的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué) 從圖1可看出，AB-8樹(shù)脂在較短時(shí)間內(nèi)完成了對(duì)狀元豆總黃酮的吸附作用，并且在3 h左右吸附基本達(dá)到飽和，之后吸附動(dòng)力學(xué)曲線隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸趨于平緩。因此從節(jié)約時(shí)間和吸附效果看，大孔樹(shù)脂AB-8可快速吸附狀元豆黃酮類(lèi)化合物，并滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。

2.2.3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附效果的影響

由圖2可知，上樣液質(zhì)量濃度低時(shí)，狀元豆黃酮吸附率也低，當(dāng)質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，吸附率值達(dá)到最大，之后隨質(zhì)量濃度的增加卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于樣品質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)，被吸附分子與樹(shù)脂吸附基團(tuán)之間接觸的機(jī)會(huì)少，致使吸附率低；當(dāng)質(zhì)量濃度增大到一定值后，由于AB-8樹(shù)脂的粒徑（0.3～1.25 mm）較小，會(huì)發(fā)生多層吸附，導(dǎo)致樹(shù)脂內(nèi)部微孔堵塞利用率降低。此外濃度較高時(shí)，黃酮溶液溶解性會(huì)降低，雜質(zhì)含量增加，使分子擴(kuò)散受抑制，不利于狀元豆黃酮與樹(shù)脂的結(jié)合造成吸附率下降。故選擇4.0 mg/mL為上樣液質(zhì)量濃度為宜。

2.2.4 上樣液pH值對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附效果的影響

上樣液的酸堿度變化會(huì)影響目標(biāo)成分在溶液中的電離程度，使其在溶液中的存在形式和溶解度相應(yīng)發(fā)生改變，進(jìn)而影響溶液的極性和大孔樹(shù)脂與目標(biāo)成分之間的作用力及吸附效果[19]。由圖3可知，大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)狀元豆黃酮的吸附率，隨上樣液pH值的增大呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在pH值為 4～6時(shí)AB-8樹(shù)脂對(duì)狀元豆黃酮的吸附率差別不大（p>0.05）。由于狀元豆黃酮類(lèi)化合物含多羥基酚類(lèi)而呈現(xiàn)一定弱酸性，在酸性條件下，有利于其保持分子狀態(tài)，進(jìn)而易于其借助范德華力被樹(shù)脂吸附；在堿性條件下則使?fàn)钤裹S酮類(lèi)化合物分解離子化，導(dǎo)致不利與樹(shù)脂發(fā)生物理吸附?？紤]到未調(diào)節(jié)pH值之前狀元豆黃酮原液pH值為5.72～5.86，為了減少因pH調(diào)節(jié)引起提取液中黃酮含量及其他物質(zhì)的變化，因而本試驗(yàn)中不調(diào)節(jié)狀元豆黃酮上樣液的pH值。

2.2.5 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸效果的影響 由圖4可知，解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)65%時(shí)解吸效果最好。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，狀元豆提取液中混雜的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等水溶性物質(zhì)大量溶出不利于總黃酮類(lèi)物質(zhì)的洗脫；而乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，提取液中的醇溶性雜質(zhì)和親脂性強(qiáng)的成分溶出量加大，與黃酮類(lèi)化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，也造成了黃酮物質(zhì)的溶解量減小。故選擇65%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液洗脫。

2.2.6 洗脫液pH值對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸效果的影響

由圖5可知，AB-8樹(shù)脂的解吸率受洗脫劑pH的變化影響較大，當(dāng)pH<6時(shí)，隨著pH值的升高狀元豆黃酮解吸率相應(yīng)地增加，當(dāng)pH=6時(shí)解吸率達(dá)最大值（83.55%）。隨后解吸率明顯下降，這可能與狀元豆黃酮提取物呈弱酸性有密切關(guān)系。故解吸液pH值選取6.0較為合理。

2.3 大孔樹(shù)脂AB-8動(dòng)態(tài)吸附、洗脫試驗(yàn)

2.3.1 上樣流速和體積對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附效果的影響 一般情況下，目標(biāo)物質(zhì)量濃度在流出液為上樣液的1/10左右時(shí)，認(rèn)為基本達(dá)到了目標(biāo)物的泄漏點(diǎn)，泄露點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間越早，說(shuō)明樣液中目標(biāo)物吸附愈不充分[20-21]。由圖 6可看出，泄漏液中的黃酮質(zhì)量濃度，隨上樣流速的增大泄露點(diǎn)出現(xiàn)越早，流速為4.0、3.0、2.0、1.0 BV/h時(shí)樹(shù)脂泄露點(diǎn)依次出現(xiàn)在90、140、170、200 mL附近，流速>5.0 BV/h后未出現(xiàn)泄漏點(diǎn)。這可能是因?yàn)樵谙嗤瑫r(shí)間內(nèi)，流速越小，黃酮提取液與樹(shù)脂接觸時(shí)間越長(zhǎng)，向樹(shù)脂內(nèi)部擴(kuò)散越充分，從而吸附量也就越大；反之，流速越大，接觸時(shí)間過(guò)短來(lái)不及被吸附就流出，從而使泄漏液中狀元豆質(zhì)量濃度偏高，因此，流速越慢吸附效果越好，但泄漏點(diǎn)出現(xiàn)延遲，造成操作周期延長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低。從圖6也可知，泄漏液濃度隨上樣液體積的增加呈先遞增后趨向恒定（即接近上樣濃度），上樣體積過(guò)大時(shí)大孔樹(shù)脂容易中毒，物料不能完全被樹(shù)脂吸附導(dǎo)致?lián)p失較多，且樹(shù)脂再生困難，影響其重復(fù)利用；反之，體積過(guò)小會(huì)使樹(shù)脂不能被充分利用，利用率低，增加成本[22]。綜合考慮，吸附流速和上樣體積為3.0 BV/h，140 mL比較適宜。

2.3.2 洗脫流速對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸效果的影響 由圖7可看出，解吸率在1～2 BV/h區(qū)間時(shí)變化不大，超過(guò)2 BV/h后隨洗脫流速的增加而劇降。說(shuō)明洗脫流速越慢，解吸的效果越好，這可能是由于流速太快，洗脫劑與被吸附黃酮接觸時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)致深層吸附的黃酮不能很好地被置換出來(lái)；而流速太慢，耗時(shí)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此在解吸率不受影響的情況下，洗脫速度選擇2.0 BV/h較為合理。

2.3.3 洗脫體積對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸效果的影響 由圖8可知，在2 BV/h流速條件下，收集液峰值出現(xiàn)在20～50 mL之間，曲線的峰形對(duì)稱性較好，沒(méi)有明顯拖尾現(xiàn)象，洗脫集中。洗脫體積接近60 mL時(shí)，幾乎檢測(cè)不出狀元豆總黃酮，說(shuō)明基本將樹(shù)脂吸附的狀元豆黃酮全部洗脫，洗脫達(dá)到終點(diǎn)。因此洗脫劑用量選擇60 mL即可。

2.4 狀元豆黃酮純化結(jié)果

根據(jù)上述各因素的優(yōu)化結(jié)果，在試驗(yàn)中將10 g已預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂AB-8濕法裝柱，質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL（不需調(diào)pH值）的狀元豆黃酮提取液，上樣140 mL在3.0 BV/h 吸附流速條件下進(jìn)行吸附試驗(yàn)，再用60 mL，65%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（pH6.0）以2.0 BV/h流速進(jìn)行洗脫試驗(yàn)，收集洗脫液，測(cè)定，濃縮，真空干燥。結(jié)果得到大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)狀元豆黃酮黃酮的吸附率和解吸率分別為93.06%和95.12%，回收率為89.04%，經(jīng)純化處理后狀元豆黃酮純度由粗體液的18.03%提高到52.46%，純度提高了約2.91倍。

2.5 狀元豆黃酮對(duì)油脂抗氧化作用

從表2、表3可見(jiàn)，狀元豆黃酮對(duì)豬油的抗氧化性隨其使用量的增加而呈現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)，經(jīng)過(guò)純化處理后的狀元豆黃酮組的抗氧化效果總體優(yōu)于未純化處理的組。隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，添加了0.04%純化過(guò)的狀元豆黃酮組對(duì)豬油的抗氧化效果與0.02% Vc組的效果接近，0.06%的粗提物組的抗氧化效果稍強(qiáng)于0.02%的純提物組；在添加0.02%～0.06%的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，狀元豆黃酮對(duì)植物油的氧化抑制效果的變化趨勢(shì)大體相同，隨質(zhì)量濃度增大而逐漸增強(qiáng)，具有一定劑量相關(guān)效應(yīng)，但總體上，未經(jīng)純化處理的狀元豆黃酮組的抗氧化效果總體不及純化處理過(guò)的組，其中添加了0.02%Vc組對(duì)花生油的抗氧化效果優(yōu)于0.02%～0.06%粗提物組，弱于0.02%～0.06%純提物組。

總體上看，花生油組氧化抑制效果不及豬油組明顯，這可能與豬油主要由飽和脂肪酸組成，相對(duì)植物油中不飽和脂肪酸更難氧化有關(guān)，且經(jīng)過(guò)純化處理過(guò)的狀元豆黃酮的抗氧化效果明顯上升；并且在烘箱強(qiáng)制溫度相同下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，含不同質(zhì)量濃度的粗提組和純提組對(duì)油脂的保護(hù)率均先升高后有所下降，這可能是因?yàn)榍捌陔A段抗氧化劑對(duì)油脂氧化所起的作用較大，到后期由于長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)制既使油脂發(fā)生自氧化反應(yīng)程度更加劇烈，同時(shí)又使抗氧化劑的抗氧化活性成分減少所致[23-24]。

3 討論

不同類(lèi)型的大孔吸附樹(shù)脂由于其本身化學(xué)結(jié)構(gòu)、孔徑大小、極性、比表面積的不同，使它們對(duì)同一黃酮類(lèi)化合物的吸附、解吸特性不盡相同[25]。通過(guò)靜態(tài)試驗(yàn)，比較6種不同樹(shù)脂對(duì)狀元豆黃酮的吸附效果，并綜合考慮降低成本及適合工業(yè)化生產(chǎn)等因素，選取吸附量及回收率較高的AB-8樹(shù)脂研究其吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)其能快速實(shí)現(xiàn)吸附平衡，且對(duì)狀元豆黃酮吸附、解吸效果優(yōu)于其他樹(shù)脂。其對(duì)狀元豆黃酮的吸附率和解吸率分別達(dá)到91.28%和87.24%，吸附量和回收率分別達(dá)到32.95 mg/g和79.63%，吸附平衡時(shí)間約為3 h，是一種分離純化狀元豆黃酮的理想樹(shù)脂。

同一類(lèi)型的樹(shù)脂也可能因?yàn)椴煌参锊牧纤崛〉念?lèi)黃酮不同（如分子量、結(jié)構(gòu)及吸附力的不同）及粗提液黃酮含量的不同，而使分離純化效果有所差異。劉廣淼等[9]在研究AB-8樹(shù)脂純化香鱗毛蕨總黃酮時(shí)，確定黃酮純度由4.21%提高到了38.40%；方賀等[10]運(yùn)用AB-8型樹(shù)脂黃花柳花總黃酮進(jìn)行富集，可使總黃酮由純化前（4.60±0.27）%提高至（51.99±0.47）%；駱黨委等[11]利用AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離蘆柑皮總黃酮時(shí)，確定其純度從17.8%提高到63.1%；王曉林等[26]采用AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)錦燈籠宿萼總黃酮富集，確定總黃酮含量由原來(lái)的6.95%提高到23.62%；張昊等[27]研究AB-8大孔樹(shù)脂純化山丹鱗莖總黃酮后表明，黃酮純度從10.56%提高到35.13%。因此，選擇合適的樹(shù)脂類(lèi)型，并對(duì)其進(jìn)行科學(xué)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和各因素參數(shù)分析，有利于提高純化效率。本試驗(yàn)以吸附率、解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附和洗脫試驗(yàn)考察了狀元豆黃酮質(zhì)量濃度、上樣液流速以及洗脫劑濃度等影響因素，確定了最佳分離純化條件：140 mL，4.0 mg/mL（不需調(diào)pH值）的狀元豆黃酮提取液以3.0 BV/h流速上樣，用60 mL體積分?jǐn)?shù)65%乙醇溶液（pH6.0）以2.0 BV/h流速洗脫，在此工藝條件下，大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)狀元豆黃酮黃酮富集由原來(lái)的18.03%提高到52.46%，吸附率和解吸率分別為93.06%和95.12%，回收率為89.04%，純度提高了2.91倍。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證明AB-8樹(shù)脂作為狀元豆黃酮初步純化材料是可行，且分離純化條件也可為工業(yè)生產(chǎn)提供理論參考。

油脂抗氧化試驗(yàn)結(jié)果也表明：狀元豆黃酮對(duì)植物油和動(dòng)物油均有一定的抗氧化效果，總體而言，在氧化抑制效果上隨狀元豆黃酮質(zhì)量濃度增大而逐漸增強(qiáng)，豬油組的抑制效果明顯好于花生油組，且經(jīng)過(guò)純化處理后抗氧化效果明顯上升。在相同強(qiáng)制溫度下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)不同質(zhì)量濃度的粗提組和純提組對(duì)油脂的保護(hù)率均先升高后有所下降。說(shuō)明狀元豆黃酮作為油脂新型天然的抗氧化劑是有潛力、可行的，尤其經(jīng)樹(shù)脂純化處理后可明顯降低其在食品中的添加量，既可抑制油脂氧化，延長(zhǎng)保質(zhì)期，又可起到保健作用，因此有望在含油食品中推廣應(yīng)用。

本研究同時(shí)存在著許多不足，比如，僅從上樣質(zhì)量濃度、上樣流速及洗脫體積等單因素方面研究分析試驗(yàn)條件對(duì)純化狀元豆黃酮的效果，未考慮各單因素的相互作用；對(duì)狀元豆黃酮的分離純化僅局限在大孔樹(shù)脂的初級(jí)階段，對(duì)深層次如有效成分的分級(jí)分離和組分結(jié)構(gòu)分析等方面問(wèn)題的探究都有待進(jìn)一步深入。

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