微囊蛋白1和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4在3T3?L1胰島素抵抗脂肪細胞模型中的表達及作用

耿東華，趙文嫣，孫明，馮勇，劉金鋼

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院普通外科，沈陽110004；2.附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽110004；3.附屬第四醫(yī)院普通外科，沈陽110034）

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微囊蛋白1和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4在3T3?L1胰島素抵抗脂肪細胞模型中的表達及作用

耿東華1，趙文嫣1，孫明2，馮勇1，劉金鋼3

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院普通外科，沈陽110004；2.附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽110004；3.附屬第四醫(yī)院普通外科，沈陽110034）

摘要目的誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細胞分化成熟并建立脂肪細胞胰島素抵抗模型，探討微囊蛋白1（caveo1in-1）及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）在脂肪細胞胰島素抵抗時的表達及作用。方法3T3-L1前脂肪細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成熟、建立胰島素抵抗模型成功后進入實驗，流式細胞術(shù)檢測胰島素抵抗狀態(tài)下脂肪細胞葡萄糖攝取，Western b1ot檢測細胞GLUT4、caveo1in-1、磷酸化微囊蛋白1（p-caveo1in-1）蛋白的表達，qRT-PCR檢測GLUT4、caveo1in-1mRNA的表達。結(jié)果地塞米松成功誘導(dǎo)建立了脂肪細胞胰島素抵抗模型，葡萄糖氧化酶法檢測模型組細胞對胰島素刺激下葡萄糖攝取率降低，流式細胞術(shù)檢測誘導(dǎo)胰島素抵抗后，脂肪細胞攝取熒光葡萄糖量明顯減少。誘導(dǎo)3T3-L1胰島素抵抗后，GLUT4mRNA、caveo1in-1mRNA表達明顯降低（P＜0.01）；GLUT4、caveo1in-1及p-caveo1in-1蛋白表達均明顯降低（均P＜0.01）。結(jié)論地塞米松可成功誘導(dǎo)建立脂肪細胞胰島素抵抗模型，誘導(dǎo)3T3-L1細胞胰島素抵抗后，細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力降低，caveo1in-1表達與功能降低。

關(guān)鍵詞脂肪細胞；胰島素抵抗；微囊蛋白1；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4

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胰島素抵抗（insu1in resistance，IR）是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，貫穿其發(fā)生發(fā)展的整個過程。脂肪組織是機體絕大部分葡萄糖的代謝場所，也是IR最為重要的靶器官，與IR關(guān)系密切。IR主要表現(xiàn)為肝細胞、肌細胞、脂肪細胞等的糖代謝異常。微囊蛋白1（caveo1in-1）是脂肪細胞質(zhì)膜微囊（caveo1ae）表面上的標記蛋白，對細胞的糖脂代謝、內(nèi)吞、調(diào)節(jié)炎性因子以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均起重要作用［1-2］，但具體功能和機制尚不完全明確。近年來隨著對糖尿病發(fā)病機制及糖代謝信號通路的進一步研究，發(fā)現(xiàn)在脂肪細胞中胰島素可誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（g1ucose transpoter 4，GLUT4）轉(zhuǎn)位至富含caveo1ea/caveo1in-1的細胞膜上，這一過程的很多生物學(xué)事件都發(fā)生在內(nèi)［3-4］。由此推測caveo1in-1的功能與胰島素抵抗密切相關(guān)。為驗證這一推論，本研究以3T3-L1前脂肪細胞為研究對象，誘導(dǎo)其分化成熟并建立成熟脂肪細胞胰島素抵抗模型，檢測IR狀態(tài)下的脂肪細胞中caveo1in-1的功能和表達，進一步探索脂肪細胞IR的可能機制。

1　材料與方法

1.1材料與主要試劑

3T3-L1前脂肪細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫。主要試劑包括：高糖DMEM液體培養(yǎng)基（5 g/L葡萄糖，美國HyC1one公司），胎牛血清（美國Gibco公司）；PBS磷酸鹽緩沖液（美國HyC1one公司），二甲基亞砜、地塞米松、IBMX、重組人胰島素（美國Sigma公司），熒光標記2-脫氧葡萄糖（美國Invitrogen公司），0.25%胰蛋白酶（美國Sigma公司），牛血清白蛋白BSA（美國Sigma公司），兔抗人GAPDH單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗caveo1in-1單克隆抗體（英國Abcam公司），兔抗P-CAVEOLIN-1抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗GLUT4抗體（英國Abcam公司）。

1.2方法

1.2.13T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化：（1）細胞培養(yǎng)及傳代，3T3-L1前脂肪細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基含10 mL FBS、89 mL高糖DMEM/F12液體培養(yǎng)基、1 mL青鏈霉素混合液。體積分數(shù)為5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次。細胞貼壁，呈梭形、透亮，胞質(zhì)內(nèi)無脂滴，長滿80%時進行傳代。（2）細胞誘導(dǎo)分化，3T3-L1前脂肪細胞生長至完全匯合后2 d（即誘導(dǎo)分化0 d），加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A（含10 mL FBS、89 mL DMEM/F12液體培養(yǎng)基、1 mL青鏈霉素混合液、胰島素1 mg/L、IBMX0.5 mmo1/L、DEX 1.0 μmo1/L），2 d后換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B（含10 mL FBS、89 mL DMEM/F12液體培養(yǎng)基、1 mL青鏈霉素混合液、胰島素1 mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1～2 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 d（即誘導(dǎo)分化8～10 d）。

1.2.2油紅O染色：棄去培養(yǎng)液，10%甲醛PBS（含分析純甲醛10 mL、1×PBS緩沖液90 mL）固定20 min，70%乙醇沖洗，0.35%油紅O母液（含0.35 g油紅、100 mL異丙醇）與去離子水3∶2混合，濾紙過濾，靜置數(shù)分鐘，取上層液對細胞染色10 min，去離子水沖洗后，顯微鏡下觀察。

1.2.3脂肪細胞IR模型的建立及鑒定：誘導(dǎo)成熟的脂肪細胞分為IR模型組和對照組。對分化好的成熟脂肪細胞，加入1 μmo1/L地塞米松誘導(dǎo)IR作用72 h，每天換液1次，再用100 nmo1/L的胰島素刺激15 min。對照組以基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取各組上清，葡萄糖氧化酶法/流式細胞術(shù)測定胰島素抵抗組和對照組培養(yǎng)液上清的葡萄糖濃度，若胰島素抵抗模型組上清葡萄糖濃度顯著高于對照組，則認為IR模型建立成功。

接種于6孔板中的細胞經(jīng)實驗因素處理后，棄上清，PBS洗3次，以0.25%胰蛋白酶消化后將單細胞懸液加入2 mL的圓底玻璃離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL PBS洗滌后離心，棄上清。加入含胰島素（100 nmo1/L）、熒光2-脫氧-D-葡萄糖（2-NBDG，150 μmo1/L）的PBS溶液200 μL，移液器輕輕吹打混勻后于37℃孵育30 min。之后離心棄上清液，加入預(yù)冷的PBS離心洗滌2次，去除細胞未攝取的2-NBDG。加入冷PBS（500 μL）混勻后放入流式細胞儀檢測，實驗結(jié)果使用Ce11 Quest軟件進行分析，2-NBDG的細胞平均熒光強度代表細胞對葡萄糖的攝取量。整個實驗過程避光。

1.2.4GLUT4、caveo1in- 1 mRNA的檢測（qRT -PCR）：收集各實驗組細胞后提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，每組DNA模板同時進行GLUT4、caveo1in-1和GAPDH的rea1-time PCR反應(yīng)，檢測GLUT4、caveo1in-1mRNA表達，GAPDH為內(nèi)參。引物合成根據(jù)NCBI Genbank中小鼠caveo1in-1和GLUT4的基因序列，采用Primer5.0設(shè)計，具體引物序列如下：caveo1in-1，正向5′- GGGA CATCTCTACACTGTTCCCATC-3′，反向5′- CTTCT GGTTCTGCAATCACATCTTC -3′；GLUT4，正向5′-CTGTAACTTCATTGTCGGCATGG-3′，反向5′- AGG CAGCTGAGATCTGGTCAAAC-3′；GAPDH，正向5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-′，反向5′-TCACC TTCACCGTTCCAGTTT - 3′。擴增條件：預(yù)變性50℃2 min，95℃2 min，95℃15 s，55℃30 s，60℃30 s，40個循環(huán)。

1.2.5Western b1ot檢測caveo1in-1、p-caveo1in-1、GLUT4蛋白表達：提取各組細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，煮沸5 min。取蛋白（30 μg）上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳15%分離膠和5%濃縮膠，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液，室溫封閉2 h。TBST洗滌后加入一抗緩沖液（caveo1in-1、p-caveo1in-1，GLUT4抗體為1∶200；GAPDH抗體1∶2 000），4℃孵育過夜，二抗封閉（HRP標記羊抗兔IgG抗體1∶20 000），室溫封閉1 h。化學(xué)發(fā)光后顯影。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均以x±s表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.13T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化

鏡下可見小鼠3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化前呈梭形的成纖維細胞形態(tài)，胞質(zhì)內(nèi)無脂滴（圖1A）；誘導(dǎo)分化第4天時，細胞融合，變大、變圓，胞質(zhì)中出現(xiàn)脂滴，分布于核周圍，形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)，從形態(tài)上由前脂肪細胞向成熟脂肪細胞轉(zhuǎn)變；分化第8天時胞質(zhì)中更多的脂滴積聚，脂質(zhì)成分可被油紅O染色，大多數(shù)細胞分化成熟（圖1B）。

2.23T3-L1胰島素抵抗細胞模型鑒定及攝取2-NBDG定量檢測結(jié)果

圖1　3T3?L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化前、后光鏡下形態(tài)×100Fig.1 The shape and morphology of 3T3?L1 cells before and after differentiation×100

脂肪細胞誘導(dǎo)IR及胰島素刺激后，葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖濃度，IR模型組［（23.06±0.49）mmo1/L］是對照組［（15.69±0.23）mmo1/L］的1.47倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。說明該IR模型建立成功。細胞攝取2-NBDG后，流式檢測細胞內(nèi)熒光強度結(jié)果如圖2所示，與3T3-L1細胞（49.44± 2.21）比較，3T3-L1 IR細胞（26.48±10.50）熒光強度明顯降低（P＜0.01），說明IR的3T3-L1細胞對胰島素刺激下的葡萄糖攝取明顯減少。

圖2　3T3?L1細胞及胰島素抵抗細胞攝取2?NBDG后細胞內(nèi)熒光強度比較×600Fig.2 Comparison of fluorescence intensity of 2?NBDG uptaking between 3T3?L1 and 3T3?L1 insulin resistance adipocytes×600.

2.33T3-L1 IR細胞GLUT4、caveo1in-1mRNA表達

結(jié)果顯示，與對照組比較，誘導(dǎo)3T3-L1 IR后GLUT4、caveo1in-1 mRNA表達明顯減少（均P＜0.01，圖3）。

2.43T3-L1 IR細胞GLUT4、caveo1in-1蛋白表達

結(jié)果顯示：誘導(dǎo)3T3-L1 IR后GLUT4蛋白表達明顯減少（P＜0.01），caveo1in-1及p-caveo1in-1蛋白表達均明顯降低（均P＜0.05）。見圖4。提示誘導(dǎo)3T3-L1細胞IR后，細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力降低，caveo1in-1的表達與功能降低。

3　討論

圖3　3T3?L1細胞誘導(dǎo)胰島素抵抗前后GLUT4和caveolin?1 mRNA表達Fig.3 The expression of GLUT4 and caveolin?1 mRNA of 3T3?L1（control group）and 3T3?L1 insulin resistance adipocytes models

圖4　3T3?L1細胞誘導(dǎo)胰島素抵抗前后GLUT4和caveolin?1的蛋白表達Fig.4 Expression of GLUT4 and caveolin?1 protein of 3T3?L1（control group）and 3T3?L1 insulin resistance adipocytes models

3T3-L1細胞來源于小鼠成纖維細胞，經(jīng)克隆擴增成為前脂肪細胞系，可以定向分化為脂肪細胞，在體外研究中被廣泛應(yīng)用。本研究采用地塞米松成功誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細胞分化成熟，采用油紅O染色明確分化成熟及分化效率，為進一步研究脂肪細胞IR與發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)成熟并IR的脂肪細胞對胰島素刺激下的葡萄糖轉(zhuǎn)運敏感性降低，攝取葡萄糖能力明顯下降。繼而通過qRT-PCR和Western b1ot檢測3T3-L1細胞誘導(dǎo)前后caveo1in-1和GLUT4的表達，發(fā)現(xiàn)在IR的情況下，GLUT4、caveo1in-1mRNA和蛋白水平均下降，且caveo1in-1的活性磷酸化形式亦明顯低表達，提示IR狀態(tài)下細胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白及質(zhì)膜微囊內(nèi)蛋白活性下降，可能與細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖能力下降直接相關(guān)。

脂肪細胞的糖代謝調(diào)節(jié)是涉及到眾多影響因素的極其復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)。在脂肪組織中，GLUT4是協(xié)助細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要蛋白。在胰島素刺激下，激活PI3K/Akt、CAP/cb1等胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，募集并活化下游信號分子，引發(fā)細胞內(nèi)信號蛋白的級聯(lián)反應(yīng)，促使脂肪細胞中的GLUT4從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細胞膜上，刺激消失后，細胞則通過內(nèi)吞功能把GLUT4運回細胞內(nèi)［5］。最近的研究［6-7］已經(jīng)獲得直接證據(jù)證明了IR與細胞膜微區(qū)域即caveo1ea/ caveo1in-1的功能異常直接相關(guān)。目前已有體外實驗和動物模型從不同角度、不同深度證明了caveo-1ea/caveo1in-1在脂肪細胞葡萄糖代謝中的生物學(xué)作用［8］，總體上認為caveo1ea/caveo1in-1在脂肪細胞胰島素通路中起著正向調(diào)節(jié)作用，而且這一調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在caveo1ea/caveo1in-1與胰島素受體的相互作用、維持胰島素受體穩(wěn)定性、促進GLUT4轉(zhuǎn)位和內(nèi)吞等方面，當一些負性調(diào)節(jié)因素存在時，脂肪細胞caveo1in-1和PI3Kp85α、Akt/PKB、c-Cb1等胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白表達同步下降。至于caveo1ea/ caveo1in-1與胰島素信號通路上其他重要分子是否存在直接作用、作用機制如何目前尚不明確。

綜上所述，地塞米松可成功誘導(dǎo)建立脂肪細胞IR模型，誘導(dǎo)3T3-L1細胞IR后，細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力降低，caveo1in-1的表達與功能降低。現(xiàn)有研究［9］已經(jīng)較充分闡述了caveo1in-1在胰島素信號通路中的作用，但仍有分歧存在，有研究指出在caveo-1in-1和胰島素受體之間不存在表達水平上和活性調(diào)節(jié)的相關(guān)性。還有分歧來自于胰島素受體在細胞膜上的定位，早期研究［10］支持胰島素受體定位于質(zhì)膜微囊中，而且這種定位是與其功能相適應(yīng)的。但有研究［11］通過免疫共沉淀和免疫電鏡的方法發(fā)現(xiàn)僅有少量胰島素受體定位于質(zhì)膜微囊中。因此，目前對caveo1ea/caveo1in-1在脂肪細胞胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和GLUT4轉(zhuǎn)位調(diào)節(jié)過程中的作用認識尚不明確，在一些關(guān)鍵問題上很難達成共識，亟待學(xué)者進一步探索，為闡明2型糖尿病的發(fā)病機制，改善和治療IR提供確切的方向和思路。

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（編輯武玉欣）

Expressionand Functionof Caveolin-1and GLUT4inthe Insulin Resistance Modelof 3T3-L1 Differentiated Adipocytes

GENGDonghua1，ZHAOWenyan1，SUNMing2，F(xiàn)ENGYong1，LIUJingang3
（1. Department of Genera1 Surgery，Shengjing Hospita1，China Medica1 University，Shenyang 110004，China；2. Department of Uro1ogy，Shengjing Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110004，China；3.Departmentof Surgery，The Fourth Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110034，China）

AbstractObjective To investigate the g1ucose uptake of mature adipocytes and the expression of caveo1in-1 and g1ucose transpoter 4（GLUT4） during insu1in resistance status，so as to exp1ore its functions.Methods The 3T3-L1 adipocytes were induced to differentiate into adipocytes，and the insu1in resistance mode1 were bui1t up. F1ow cytometry method was used to observe the state of the g1ucose uptake and insu1in resistance. Western b1ot was performed to detect the expression of GLUT4，caveo1in-1，and p-caveo1in-1. qRT-PCR was adopted to detectGLUT4 andcaveo1in-1 mRNA expression. Results The 3T3-L1 preadipocytes were differentiated and induced the insu1in resistance of mature adipocytes. The uptake rate of the 2-NBDG of IR adipocytes sharp1y decreased. The resu1ts of qRT-PCR showed that the mRNA re1ative expression ofcaveo1in-1 andGLUT4 were 1ess than the norma1 3T3-L1 adipocytes（P ＜ 0.01）. Western b1ot showed that the GLUT4，caveo1in-1 and p-caveo1in-1 protein expression were decreased in the adipocytes（P ＜ 0.01）. Conclusion The 3T3-L1 preadipocytes ce11s can differentiated into mature adipocytes，dexamethasone can successfu11y induce insu1in resistance in adipocytes. The g1ucose uptake rate decreased in the insu1in resistance 3T3-L1 adipocytes，caveo1in-1 and GLUT4 and phosphory1ated protein expression were decreased，which suggests the decreasing function of caveo1in-1 may re1ated to the insu1in resistancestatusinadipocytes.

Keywordsadipocyte；insu1in resistance；caveo1in-1；g1ucose transpoter 4

中圖分類號R34

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0538-05

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.015

基金項目：沈陽市科技創(chuàng)新專項資金-應(yīng)用基礎(chǔ)研究專項（F15-199-1-31）

作者簡介：耿東華（1976 -），男，副教授，博士.

通信作者：劉金鋼，E-mai1：jingang1iu2014@163.com

收稿日期：2015-12-21