TNFAIP8在卵巢癌中的表達(dá)及其對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

楊大磊，畢芳芳，于大海

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

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TNFAIP8在卵巢癌中的表達(dá)及其對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

楊大磊，畢芳芳，于大海

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

摘要目的探討TNFAIP8在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，以及TNFAIP8對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測189例卵巢癌組織中TNFAIP8蛋白的表達(dá)情況。通過雙向調(diào)控TNFAIP8基因的表達(dá)，觀察TNFAIP8對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果在189例卵巢癌組織中，TNFAIP8陽性表達(dá)率為84.66%（160/189），其陽性表達(dá)與卵巢癌的分級顯著相關(guān)。在卵巢癌細(xì)胞中上調(diào)TNFAIP8表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的增殖能力顯著增加，而干擾其表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降。結(jié)論TNFAIP8在卵巢癌組織中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與卵巢癌的分級顯著相關(guān)。TNFAIP8過表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，可能成為卵巢癌診斷治療的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞卵巢癌；TNFAIP8；增殖

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卵巢癌是導(dǎo)致女性死亡的主要惡性腫瘤之一［1］。盡管近年來卵巢癌的手術(shù)方式和藥物治療有了很大的進(jìn)步，但由于卵巢癌發(fā)生的部位以及缺乏特異性癥狀和篩選方法，導(dǎo)致患者的整體生存率仍然很低［2-3］。因此，探索卵巢癌發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制，對于深入理解該腫瘤的生物學(xué)行為并開發(fā)相應(yīng)的靶向治療手段具有十分重要的意義。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8（tumor necrosis factor α-induced protein 8，TNFAIP8）又叫SCC-S2、GG2-1和MDC-3.13，分子量為21 000，含有一個(gè)DED結(jié)構(gòu)域。其作為一個(gè)腫瘤致癌基因，最初在人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)［4］，其過表達(dá)能夠被腫瘤壞死因子α和活化的核因子κB誘導(dǎo)，后來研究［5-9］發(fā)現(xiàn)TNFAIP8在前列腺癌、食道癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌等許多人類腫瘤中均發(fā)揮作用。過表達(dá)TNFAIP8能夠抑制caspase-8和caspase-3的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的體外增殖能力與侵襲能力［10］。TNFAIP8還能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2、基質(zhì)金屬蛋白酶1、基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)［11］。然而，有關(guān)TNFAIP8在卵巢癌組織中的表達(dá)模式及其與臨床病理因素的相關(guān)性目前尚無報(bào)道，其在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能也未見報(bào)道。

本文中，我們研究了TNFAIP8蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)行了臨床病理因素相關(guān)分析。此外，我們還在卵巢癌細(xì)胞中通過雙向調(diào)控TNFAIP8蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了TNFAIP8在卵巢癌細(xì)胞系中的促腫瘤作用，并為TNFAIP8促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系增殖提供了證據(jù)。

1　材料與方法

1.1組織樣本

本研究通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。189例卵巢癌標(biāo)本來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科2007年至2010年的存檔蠟塊。根據(jù)WHO組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，由2位病理醫(yī)師獨(dú)立做出組織學(xué)診斷。臨床病理信息從患者的病案記錄中獲得。所有患者在術(shù)前均未接受過化療或放射治療。

1.2免疫組織化學(xué)檢測

所有組織均經(jīng)中性甲醛固定、石蠟包埋后，制成4 μm厚度的切片。切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化以及檸檬酸修復(fù)液中進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)2 min。采用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，并采用正常山羊A血清孵育以減少非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗使用單克隆鼠源性TNFAIP8抗體（1∶400，美國Abcam公司）4℃孵育過夜。以非免疫IgG代替一抗作為陰性對照。生物素標(biāo)記的二抗（中國邁新生物科技有限公司）37℃孵育30 min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，脫水，封片。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)細(xì)胞著色的百分比及著色的強(qiáng)度，對TNFAIP8的表達(dá)進(jìn)行半定量評分。胞質(zhì)著色視為陽性。根據(jù)細(xì)胞著色百分比分為4個(gè)等級：1，1%～25%；2，26%～50%；3，51%～75%；4，76%～100%。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度分為3個(gè)等級：0，無染色；1，弱陽性染色；2，強(qiáng)陽性染色。TNFAIP8的表達(dá)又被劃分成3個(gè)等級：0分，無著色；1分，淺黃色顆粒；2分，深黃色或者黃褐色顆粒。每一張組織切片都對應(yīng)一個(gè)百分比分?jǐn)?shù)和著色分?jǐn)?shù)，將二者相乘，所得的乘積（0～8分）即為該切片的最終得分。將得分≤4分定義為低表達(dá)，＞4分定義為高表達(dá)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3從ATCC（美國Manassas）細(xì)胞庫獲得。細(xì)胞系用含有10%小牛血清（美國Invitrogen公司）的RPMI 1640（美國Gibco公司）培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）培養(yǎng)，并將其置于5% 的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。pCMV6-TNFAIP8質(zhì)粒以及對照的空白質(zhì)粒pCMV6購自美國Origene公司。TNFAIP8 siRNA和對照siRNA均購自美國Dharmacon公司。根據(jù)說明書，使用Attractene轉(zhuǎn)染試劑（德國Qiagen公司）對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，采用PCR和Western b1ot檢測干擾效率。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR

對于培養(yǎng)細(xì)胞或卵巢癌組織采用TRIZOL（美國Invitrogen公司）提取總RNA。采用ABI high capacity cDNA RT kit（美國App1ied Biosystems公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用ABI7900實(shí)時(shí)定量PCR儀，并使用TNFAIP8特異性探針（Hs00405413_m1）檢測其在組織與細(xì)胞中的含量，內(nèi)參采用β- actin （Hs99999903_m1）。

1.5Western b1ot

采用Pierce細(xì)胞裂解液（美國Thermo公司）對細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，然后分別提取其總蛋白，取40 μg的總蛋白通過12%濃度的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜（美國Mi11ipore公司）上。1%脫脂奶粉封閉2 h，兔源性一抗TNFAIP8（1∶800，美國Sigma公司）4℃過夜。山羊抗兔鼠二抗（1∶2 000，美國Santa Cruz公司）37℃孵育2 h。ECL顯色，自動電泳凝膠成像分析儀采集結(jié)果。

1.6CCK8實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后，將腫瘤細(xì)胞以1 000/孔的密度接種在含10%小牛血清培養(yǎng)基的96孔板中，每孔加入20 μL CCK8溶液，37℃孵育4 h后，采用分光光度計(jì)檢測490 nm波長的吸收峰值進(jìn)行定量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析TNFAIP8表達(dá)與臨床病理因素之間的相關(guān)性。細(xì)胞增殖和TNFAIP8 mRNA數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1TNFAIP8在卵巢癌組織中高表達(dá)且與腫瘤分級顯著相關(guān)

為了研究TNFAIP8蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，對189例卵巢癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)TNFAIP8蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1）。TNFAIP8在正常卵巢組織中呈弱表達(dá)或不表達(dá)（圖1A），而在卵巢癌組織中呈中度表達(dá)或強(qiáng)表達(dá)，陽性率為84.66%（160/189）（圖1B～1H）。臨床病理因素的分析結(jié)果顯示，TNFAIP8的陽性表達(dá)與卵巢癌的分級（P= 0.031 0）顯著相關(guān)，而與患者年齡（P= 0.407 3）、組織學(xué)分型（P= 0.121 0）、FIGO分期（P= 0.290 9）不相關(guān)（表1）。

2.2TNFAIP8促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖

為了探究TNFAIP8在卵巢癌細(xì)胞中的潛在功能，在SKOV3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染TNFAIP8質(zhì)粒和特異性siRNA，上調(diào)和下調(diào)TNFAIP8的表達(dá)量，并通過Western b1ot和實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TNFAIP8質(zhì)粒后，SKOV3細(xì)胞中TN-FAIP8蛋白表達(dá)顯著上升，而干擾掉TNFAIP8后，其表達(dá)顯著下降（圖2A）。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TNFAIP8質(zhì)粒后，細(xì)胞的增殖能力顯著高于對照組，而干擾掉TNFAIP8后，細(xì)胞的增殖能力顯著下降（圖3）。

表1　TNFAIP8表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Distribution of TNFAIP8 status in colorectal cancer according to clinicopathological characteristics

圖1　卵巢組織中TNFAIP8的表達(dá)模式Fig.1 Expression pattern of TNFAIP8 protein in ovarian tissues

圖2　Western blot及RT?PCR檢測TNFAIP8的轉(zhuǎn)染及干擾效率Fig.2 Transfection and interference efficiency of TNFAIP8detected by Western blot and RT?PCR

圖3　TNFAIP8對SKOV3細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of TNFAIP8on the proliferation of SKOV3

3　討論

TNFAIP8家族參與許多的生命過程，包括免疫平衡、細(xì)胞程序性死亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。它是新近發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤高度相關(guān)的蛋白，在人體內(nèi)由TNFAIP8基因編碼而成。在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中它的主要功能為細(xì)胞凋亡的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，主要通過抑制細(xì)胞凋亡酶功能從而抑制腫瘤壞死因子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并能夠?qū)е掳腚装彼岬鞍酌甘Щ睢?/p>

已有研究報(bào)道TNFAIP8在許多腫瘤中高表達(dá)，包括胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等，并且該蛋白高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)。有報(bào)道稱，胰腺癌細(xì)胞中TNFAIP8通過表皮生長因子受體信號通路參與癌細(xì)胞的局部浸潤轉(zhuǎn)移，影響胰腺癌的預(yù)后情況。然而，有關(guān)TNFAIP8在卵巢癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理因素的相關(guān)性尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本文中，我們發(fā)現(xiàn)TNFAIP8在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，并且其高表達(dá)與腫瘤的分級顯著相關(guān)。此外，我們在卵巢癌細(xì)胞系中雙向調(diào)控TNFAIP8的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上調(diào)TNFAIP8蛋白水平的表達(dá)能顯著增加細(xì)胞的增殖能力，而干擾掉TNFAIP8的蛋白表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力顯著下降。

TNFAIP8是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抗凋亡分子，其過表達(dá)能夠被活化的核因子κB誘導(dǎo)［7］，有文獻(xiàn)［10］報(bào)道TNFAIP8在乳腺癌細(xì)胞中作為一個(gè)抗凋亡分子，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖以及腫瘤的形成。還有文獻(xiàn)［9］報(bào)道TNFAIP8在大腸癌中高表達(dá)，并且能通過上調(diào)Cyc1in D1促進(jìn)細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖，以上結(jié)果說明TNFAIP8可能通過抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。因此我們推測，在卵巢癌細(xì)胞中TNFAIP8可能也是通過抑制細(xì)胞凋亡和/或促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖的，推測的準(zhǔn)確性需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP8在卵巢癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的分級顯著相關(guān)。此外，通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們還發(fā)現(xiàn)TNFAIP8能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。TNFAIP8可能成為卵巢癌診斷和治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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（編輯陳姜）

Overexpressionof TNFAIP8andthe Influenceon Cell Proliferationin Ovarian Cancer

YANGDa1ei，BIFangfang，YUDahai
（Departmentof Obstetricsand Gyneco1ogy，Shengjing Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110004，China）

AbstractObjective To study the expression of TNFAIP8 in human ovarian cancer and exp1ore its bio1ogica1 function in ovarian cancer ce11s. Methods The expression pattern of TNFAIP8 was ana1yzed in 189 ovarian cancer tissues by immunohistochemistry.TNFAIP8 siRNA and p1asmid were app1ied to exp1ore the inf1uence of TNFAIP8 on ce11 pro1iferation. Results TNFAIP8 was overexpressed in 160 of 189（84.66％）ovarian cancer specimens. There was a significant association between TNFAIP8 overexpression and grade. Up-regu1ated expression of TNFAIP8 in ovarian cancer ce11 can promote ce11 pro1iferation. Converse1y，dep1etion of TNFAIP8 in ovarian cancer ce11 inhibited ce11 growth. Conclusion TNFAIP8 is overexpressed in ovarian cancer and significant1y associated with grade of tumor. Overexpression of TNFAIP8 cou1d promote the pro1iferation of ovariancancerce11s， whichmakesTNFAIP8acandidateoftherapeutictargetsforovariancancertreatment.

Keywordsovarian cancer；TNFAIP8；pro1iferation

中圖分類號R321-33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0526-05

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.012

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃博士啟動基金（201501011）

作者簡介：楊大磊（1981 -），男，技師，碩士.

通信作者：畢芳芳，E-mai1：bifangfang168@163.com

收稿日期：2016-03-07