抗α烯醇化酶抗體在自身免疫性甲狀腺炎中的表達(dá)

張紅梅，秦娟，項(xiàng)陽(yáng)，李靜，單忠艷，滕衛(wèi)平

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)　110001）

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抗α烯醇化酶抗體在自身免疫性甲狀腺炎中的表達(dá)

張紅梅，秦娟，項(xiàng)陽(yáng)，李靜，單忠艷，滕衛(wèi)平

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001）

摘要目的對(duì)自身免疫性甲狀腺炎（AIT）患者外周血抗α-烯醇化酶抗體（ENO1Ab）表達(dá)及其與抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）產(chǎn)生和甲狀腺功能（甲功）變化的相關(guān)性進(jìn)行分析。方法ELISA檢測(cè)患者抗ENO1總IgG及4種亞型滴度。羅氏E601檢測(cè)患者甲功和TPOAb、TgAb。結(jié)果與非AIT患者相比，無(wú)論是甲功正常還是減退的AIT患者，其血清抗ENO1總IgG和IgG1、IgG2、IgG3亞型的滴度均顯著升高，而IgG4水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在AIT患者中，血清抗ENO1 總IgG和4種亞型的滴度均未顯示與血清游離甲狀腺素（FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、促甲狀腺素（TSH）、TPOAb、TgAb水平有明顯相關(guān)，并且甲減組與甲功正常組相比，其滴度及血TPOAb、TgAb水平也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論在甲狀腺自身免疫反應(yīng)中ENO1Ab的產(chǎn)生顯著增加，但可能不是影響甲功的主要抗體。

關(guān)鍵詞α烯醇化酶；自身抗體；自身免疫；甲狀腺炎

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自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）除可致甲狀腺破壞外，還可引起其他組織器官受累，其中AIT相關(guān)腦損害正逐漸受到多學(xué)科關(guān)注。α-烯醇化酶（α-eno1ase，ENO1）可作為自身抗原誘發(fā)免疫炎性反應(yīng)［1］。國(guó)外已有研究［2-3］報(bào)道了抗

ENO1抗體（ENO1 antibody，ENO1Ab）在AIT病患者外周血中陽(yáng)性檢出率較高（44%～83%）。因此，本研究主要針對(duì)AIT患者外周血ENO1Ab滴度與抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（anti-thyroperoxidase antibody，TPOAb）和抗甲狀腺球蛋白抗體（anti-thyrog1obu1in antibody，TgAb）的產(chǎn)生以及甲狀腺功能（簡(jiǎn)稱甲功）的變化的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象

隨機(jī)選取2013年5月至2015年3月我院門診和病房新診斷的AIT患者44例。其中，甲功正常組22例，甲功減退組（甲減）22例；男2例、女42例；平

均年齡（42.09±14.52）歲。另選取沒(méi)有AIT并且甲功正常者36例（非AIT組），男8例，女28例；平均年齡（41.03±13.71）歲。所有入選者均否認(rèn)腦血管疾病、風(fēng)濕免疫病、惡性腫瘤和近期感染病史。AIT診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］：血清TPOAb或TgAb升高，并且甲狀腺超聲顯示為彌漫性低回聲，可伴有網(wǎng)格狀改變或分布不均勻。非AIT患者主要來(lái)自于年齡匹配、為篩查有無(wú)甲狀腺結(jié)節(jié)或甲功異常而就診者，根據(jù)其甲功、TPOAb、TgAb測(cè)定以及甲狀腺超聲檢查結(jié)果確定為無(wú)AIT且甲功正常者。

1.2方法

1.2.1血ENO1Ab檢測(cè)：以重組ENO1蛋白（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，1 μg/孔）作為包被抗原，利用pH 9.6，0.05 mo1/L碳酸鹽緩沖液作為包被液，間接ELISA法檢測(cè)外周血抗ENO1總IgG和4種亞型滴度［5］。為測(cè)總IgG，血清1∶50稀釋；為測(cè)IgG1亞型，血清1∶200稀釋，IgG2亞型1∶15，IgG3亞型1∶15，IgG4亞型1∶5稀釋。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗人總IgG以及IgG1、IgG2、IgG3、IgG4二抗（北京博奧森公司）的稀釋度均為1∶10 000。

1.2.2甲功檢測(cè)：利用羅氏E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血清甲狀腺功能（包括TSH、FT3、FT4、TPOAb、TgAb）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行Mann Whitney U檢驗(yàn)分析比較組間差異，采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AIT與非AIT患者中血總IG和4種亞型滴度分析

與非AIT患者相比，無(wú)論是甲功正常還是已出現(xiàn)甲減的AIT患者，其血清中ENO1總IgG和其IgG1、IgG2、IgG3亞型的滴度均顯著升高，而IgG4亞型無(wú)明顯差異（圖1、2）。

2.2甲減組與甲功正常組血總IG和4種亞型差異及2組ENO1Ab陽(yáng)性率分析

圖1　AIT患者血清抗ENO1總IgG滴度分析Fig.1 Serum level of total IgG against ENO1 in AIT patients with euthyroidism and hypothyroidism

在AIT患者中，甲減組與甲功正常組相比，抗ENO1總IgG和4種亞型的滴度以及血TPOAb、TgAb水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以非AIT組抗ENO1總IgG測(cè)定結(jié)果建立正常參考范圍，分析2組AIT患者中ENO1Ab陽(yáng)性率。AIT甲減組和甲功正常組相比，血ENO1Ab陽(yáng)性率（100%vs 95.5%）也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3血清總IG及4種亞型與甲功和抗體的相關(guān)性

在全部AIT患者中，血清抗ENO1總IgG和4種亞型的滴度均未顯示與血游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）促甲狀腺激素（thyroid stimu1ating hormone，TSH）、TPOAb、TgAb水平有明顯相關(guān)性，見(jiàn)表1。

3　討論

ENO1Ab在多種自身免疫疾病中可被檢測(cè)到［6］。特別是抗ENO1氨基端自身抗體在橋本腦病患者中陽(yáng)性率顯著高于正常對(duì)照［7-8］。本研究較系統(tǒng)地分析了AIT患者中ENO1Ab表達(dá)及其與甲狀腺特異自身抗體和甲功的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIT患者血清ENO1Ab水平明顯升高，為IgG1、IgG2、IgG3亞型顯著增加；但血FT4、FT3、TSH水平與血抗ENO1總IgG及其亞型均無(wú)顯著相關(guān)；血清甲狀腺特異抗體TPOAb、TgAb也未顯示與ENO1Ab滴度明顯相關(guān)。提示在AIT這種經(jīng)典器官自身免疫病中也有ENO1Ab這種非甲狀腺特異自身抗體產(chǎn)生；其影響可能不是以對(duì)甲狀腺細(xì)胞的損害為主。

圖2　AIT患者中血清中抗ENO1抗體IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型滴度分析Fig.2 Serum levels of IgG1，IgG2，IgG3 and IgG4 subtypes against ENO1 in AIT patients

表1　AIT患者血清ENO1Ab滴度與TPOAb、TGAb及甲功的相關(guān)性分析（r）Tab.1 Analysis of the correlations between serum ENO1Ab level and TPOAb，TGAb，as well as thyroid function（r）

既往研究［6］已發(fā)現(xiàn)，ENO1Ab在器官特異和非器官特異性自身免疫病中有較高水平表達(dá)，包括類風(fēng)濕（6%～66%）、狼瘡（19%～80%）、系統(tǒng)性硬化癥（15%～30%）等。本研究又發(fā)現(xiàn)AIT患者中該抗體陽(yáng)性率高達(dá)94.5%～100%。ENO1在原核及真核生物中均廣泛表達(dá)，例如幽門螺旋桿菌［2］和牙周炎致病菌牙齦卟啉單胞菌［3］等微生物中，由于這些微生物與人體ENO1蛋白在氨基酸序列上有高度一致性（51.4%～82%），其感染可能導(dǎo)致自身耐受被打破，而誘發(fā)針對(duì)人體ENO1的交叉自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致ENO1Ab產(chǎn)生，并進(jìn)一步引起細(xì)胞受損［9］。國(guó)外學(xué)者利用牙齦卟啉單胞菌ENO1蛋白進(jìn)行免疫，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗環(huán)瓜氨酸ENO1抗體，并最終發(fā)生關(guān)節(jié)炎［3］。提示微生物感染確實(shí)可能打破人類機(jī)體對(duì)ENO1免疫耐受，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。而對(duì)類風(fēng)濕患者的研究顯示，從交叉自身免疫反應(yīng)發(fā)生至臨床起病可能需要數(shù)年之久。但是如果針對(duì)ENO1蛋白的交叉反應(yīng)均是這些自身免疫病的啟動(dòng)因素，那么其在不同個(gè)體中啟動(dòng)不同種自身免疫病的機(jī)制尚不清楚，是否受到某些自身免疫易感基因的調(diào)控還有待于進(jìn)一步研究。此外，在各種已發(fā)生的自身免疫炎癥反應(yīng)中，caspase-1通常被激活。研究發(fā)現(xiàn)，ENO1蛋白可作為caspase-1底物而被分解為多肽，這些多肽如在局部未被有效清除，則可作為自身抗原而誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)和ENO1Ab產(chǎn)生。最新研究還發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞表面SUPER蛋白是參與凋亡細(xì)胞被免疫細(xì)胞識(shí)別和處理的關(guān)鍵因素，該蛋白是指在活細(xì)胞中正常存在、在進(jìn)化上高度保守、對(duì)蛋白酶敏感、普遍廣泛表達(dá)且暴露于細(xì)胞表面的蛋白。ENO1是凋亡細(xì)胞表面最豐富的酶，被認(rèn)為是最典型SUPER蛋白，可作為自身抗原誘導(dǎo)針對(duì)原發(fā)病所致凋亡細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生ENOAb1。而且單核和巨噬細(xì)胞在免疫炎癥狀態(tài)下被激活，IFN-γ等因子可刺激其ENO1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移增多，膜上過(guò)度表達(dá)ENO1也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗ENO1抗體［10］。目前筆者正在分別利用Tg和ENO1重組蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫，探討在AIT中ENO1Ab產(chǎn)生的具體機(jī)制。

由于ENO1在血管內(nèi)皮、神經(jīng)元等組織細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，針對(duì)ENO1的自身免疫反應(yīng)可能是參與引起AIT患者甲狀腺外病變的重要機(jī)制，如橋本腦病和流產(chǎn)、腎小球腎炎［1，7-8，11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，ENO1Ab可通過(guò)識(shí)別ENO1的膜聯(lián)形式和/或干擾它的功能而誘發(fā)免疫炎性反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。在狼瘡腎炎患者的腎小球中表達(dá)最多的是抗ENO1和膜聯(lián)蛋白A1 IgG2型自身抗體［13］。ENO1被認(rèn)為是大腦中主要纖溶酶原受體。纖溶酶原與ENO1結(jié)合后刺激纖溶酶活化，可促進(jìn)降解淀粉樣蛋白β，具有神經(jīng)保護(hù)作用［14-15］。日本學(xué)者初步研究［7-8］已發(fā)現(xiàn)橋本腦病患者中血ENO1Ab陽(yáng)性率高44%～83.3%，而本研究也發(fā)現(xiàn)AIT患者血ENO1Ab顯著升高，但還需進(jìn)一步確定ENO1Ab是否為導(dǎo)致腦功能異常的直接病因，其潛在病理意義和產(chǎn)生機(jī)制還有待研究。

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（編輯于溪）

Expressionof Alpha-enolase Specific Autoantibodyinthe Patientswith Autoimmune Thyroiditis

ZHANGHongmei，QINJuan，XIANGYang，LIJing，HANZhongyan，TENGWeiping
（Department of Endocrino1ogy and Metabo1ism，Institute of Endocrino1ogy，The First Hospita1，China Medica1 University，Liaoning Provincia1 Key Laboratory of Endocrine Diseases，Shenyang110001，China）

AbstractObjective Toinvestigatetheexpressionofanti-ENO1autoantibody（ENO1Ab）inpatientswithautoimmunethyroiditis（AIT）andexp1ore its corre1ation with thyroid functions and the production of c1assica1 thyroid-specific autoantibodies，inc1uding anti-thyroperoxidase antibody （TPOAb）and anti-thyrog1obu1in antibody（TgAb）. Methods Serum 1eve1s of ENO1-specific tota1 IgG and four subc1asses were determined by ELISA using recombinant ENO1 protein as coat antigen. Serum FT4，F(xiàn)T3，TSH，TPOAb and TgAb were measured on Roche E601. Results As compared with the contro1s，serum 1eve1s of ENO1-specific tota1 IgG，IgG1，IgG2 and IgG3 werea11significant1y increased in both AIT patients with euthyroidism and hypothyroidism. Among a11 the AIT patients，neither serum titer ofENO1-specific tota1 IgG nor the four isotypes were significant1y corre1ated with that of FT4，F(xiàn)T3，TSH，TPOAb or TgAb. There were no significant differences in serum titers of ENO1-specific tota1 IgG between AITpatientswitheuthyroidismandhypothyroidism，aswe11asthe TPOAband TgAb.Conclusion Theproductionof ENO1Abcanbeobvious1yinducedinthyroidautoimmuneresponses；however，itmaynotbethemainpathogenicfactortoaffectthyroideconomy.

Keywordsα-eno1ase；autoantibody；autoimmunity；thyroiditis

中圖分類號(hào)R581.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)0258-4646（2016）06-0499-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.005

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81273296；30972740）、遼寧省教育廳第四批遼寧特聘教授人才項(xiàng)目（2014-187）

作者簡(jiǎn)介：張紅梅（1985 -），女，技師，本科.

通信作者：李靜，E-mai1：1ijingendocrine@126.com

收稿日期：2015-12-25