hsa?miR?138的生物信息學分析及分子調(diào)控通路預(yù)測

孫丹，于萌，鄭明星，高營，朱育焱

（中國醫(yī)科大學1.附屬第一醫(yī)院泌尿外科；2.實驗動物部，沈陽110001）

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hsa?miR?138的生物信息學分析及分子調(diào)控通路預(yù)測

孫丹1，于萌2，鄭明星1，高營1，朱育焱1

（中國醫(yī)科大學1.附屬第一醫(yī)院泌尿外科；2.實驗動物部，沈陽110001）

摘要目的對hsa-miR-138進行靶基因、功能富集分析（GO分析）、信號通路富集分析及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測等生物信息學分析，為后續(xù)深入研究hsa-miR-138功能提供實驗驗證的理論基礎(chǔ)。方法通過UCSC基因組瀏覽器、TargetScan、starbase、DAVID及KEGG公共數(shù)據(jù)庫、Chipbase等在線工具分析hsa-miR-138序列，預(yù)測hsa-miR-138-1的靶基因，對預(yù)測的靶基因進行GO分析和信號通路富集分析，預(yù)測hsa-miR-138的可能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。結(jié)果hsa-miR-138序列在各物種間具有高度保守性。通過對目前文獻的檢索，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-138-1的靶基因中既有抑癌基因，也有癌基因。GO分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-138-1靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、RNA代謝過程的調(diào)節(jié)、基因表達、生物大分子的合成等方面（P＜0.01），KEGG通路分析提示相關(guān)信號通路主要涉及癌癥通路、軸突導(dǎo)向、細胞內(nèi)噬作用、Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生理病理過程。應(yīng)用Chipbase預(yù)測出hsamiR-138的19個調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)論hsa-miR-138可能參與多種重要的生物學過程，并作為雙向調(diào)節(jié)因子調(diào)控腫瘤的生物學行為。

關(guān)鍵詞hsa-miR-138；生物信息學；靶基因；信號通路

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微小RNA（microRNA，miRNA）是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類長度約為20～24個核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼單鏈小RNA，其種子序列與靶基因的3′UTR結(jié)合后，可降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯，從而負調(diào)控靶基因，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。miRNA廣泛參與器官發(fā)育、細胞增殖分化、細胞凋亡等生理過程，也與復(fù)雜的腫瘤的生物學行為及特性有關(guān)［1-3］。本研究擬對人miR-138（hsa-miR -138）的研究文獻進行總結(jié)分析，通過生物信息學方法預(yù)測miR-138靶基因，并對其進行功能及信號通路富集分析，應(yīng)用軟件數(shù)據(jù)庫查詢其轉(zhuǎn)錄因子，推測其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

圖1　位于人類chr3（P21，32）染色體44155704?44155802的miR?138?1（uc011azu.1）Fig.1 miR?138?1（uc011azu.1）at chr3：44155704?44155802

圖2　位于人類chr16（q13）染色體56892430?56892513的miR?138?2（uc002ekc.3）Fig.2 miR?138?2（uc002ekc.3）at chr16：56892430?56892513

1　材料與方法

運用UCSC基因組在線瀏覽工具（UCSC gene browser，http：//genome.ucsc.edu/）分析hsa-miR-138在人類基因組中的位置及保守性。運用mirbase （http：//mirbase.org/index.shtm1）查詢hsa-miR-138的堿基序列；選擇TargetScan（http：//www.targetscan. org/）及starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測hsa-miR-138-1的靶基因及轉(zhuǎn)錄因子等。

采用DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.abcc.ncifcrf. gov/）對hsa-miR-138-1預(yù)測靶基因集合進行功能富集分析（GO分析）和基于KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www. genome.jp/）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析（Pathway分析）。以P＜0.05為顯著性閾值，得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計學意義的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病通路。

通過Chipbase（http：//deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/）在線預(yù)測網(wǎng)站，查詢hsa-miR-138-1與其轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因間的相互作用關(guān)系，繪制出可能存在的調(diào)控hsa-miR-138-1的轉(zhuǎn)錄因子及hsa-miR-138-1調(diào)控的靶基因三者之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

2　結(jié)果

2.1hsa-miR-138在人類基因組中的位置及保守性分析

運用UCSC基因組在線瀏覽工具分析了hsamiR-138在人類基因組中所處的位置，結(jié)果如圖1、2所示：miR-138-1（uc011azu.1）位于chr3：44155704-44155802，miR-138-2（uc002ekc.3）位于chr16：56892430-56892513。hsa-miR-138是由不同染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工而成的具有相同成熟體序列的miRNA，包括2個亞型，即hsa-miR-138-1和hsa-miR-138-2。hsa-miR-138-1定位于人類chr3（P21，32）染色體44155704-44155802位置，共99 bp；hsa-miR-138-2定位于人類chr16（q13）染色體56892430-56892513位置，共84 bp，在人、獼猴、小鼠、狗和大象等脊椎動物中呈高度保守。于mirbase上查到成熟的hsa-miR-138-5p序列為AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG，共23個nt。成熟的hsa-miR-138-2-3p序列為GCUA UUUCACGACACCAGGGUU，共22個nt。

2.2基于文獻報道的hsa-miR-138靶基因功能分析

通過對目前文獻的檢索，發(fā)現(xiàn)大部分文獻報道的miR-138功能為抑癌基因［4-6］。如Ma等［7］研究發(fā)現(xiàn)miR-138在膽囊癌中通過作用于Bag-1而抑制腫瘤細胞的增殖。Yu等［8］研究發(fā)現(xiàn)miR-138-5p通過下調(diào)FOXC1抑制胰腺癌細胞的增殖。Chen等［9］發(fā)現(xiàn)miR-138的缺失可引起Limk1上調(diào)，從而促進卵巢癌的轉(zhuǎn)移。Jiang等［10］發(fā)現(xiàn)在舌鱗狀細胞癌中，miR-138可以通過抑制靶基因GNAI2而抑制癌細胞生長。Xu等［11］證實miR-138在口腔鱗狀細胞癌中通過調(diào)節(jié)YAP1抑制癌細胞增殖。Yang等［12］證實miR-138在小細胞肺癌中可以直接作用于H2AX，從而抑制腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)。Liang等［13］報道m(xù)iR-138在人腎透明細胞癌中的表達下調(diào)，并且可以通過作用于EZH2而使癌細胞衰老。

然而筆者也發(fā)現(xiàn)，在少數(shù)腫瘤中，miR-138-1能抑制癌基因表達，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞遷移、侵襲。Chan等［14］發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤發(fā)生的細胞網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中，miR-138-1既抑制促凋亡基因從而抑制凋亡，又抑制增殖抑制因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子，促進膠質(zhì)瘤細胞存活、增殖基因的表達，從而增進膠質(zhì)瘤細胞的惡性潛能。分類總結(jié)文獻已報導(dǎo)的hsa-miR-138-1靶基因中的抑癌基因及癌基因見圖3。

圖3　文獻報道的hsa?miR?138?1靶基因中的抑癌基因和癌基因及其功能Fig.3 Target genes of hsa?miR?138?1，including both oncogenes and tumor suppressor genes，and their function

2.3hsa-miR-138-1靶基因預(yù)測及靶基因GO和KEGG通路分析

GO分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-138-1靶基因功能主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、RNA代謝過程的調(diào)節(jié)、基因表達、生物大分子的合成等方面，見圖4；KEGG通路分析涉及的信號通路主要有癌癥通路、軸突導(dǎo)向、慢性髓細胞樣白血病、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、細胞內(nèi)噬作用、NORCH和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，見表1，圖5。

挑選其中靶基因較為集中的軸突導(dǎo)向分子通路（axon guidance）繪制靶基因的分布示意圖，結(jié)果見圖6。

2.4生物信息學預(yù)測hsa-miR-138的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

通過Chipbase的查詢，得出調(diào)控miR-138的轉(zhuǎn)錄因子共有19個，見圖7。

3　討論

miRNA的功能非常廣泛，包括調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和發(fā)育等，并在腫瘤形成等病理過程中發(fā)揮重要作用。憑借整合生物學、數(shù)學和計算機知識，利用多種數(shù)據(jù)庫的獨特優(yōu)勢，生物信息學在miRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及miRNA靶基因的預(yù)測等研究中發(fā)揮了重要作用。本研究利用生物信息學技術(shù)初步揭示了miR-138與其上游轉(zhuǎn)錄因子及相應(yīng)下游靶基因組成的復(fù)雜圖景，有助于進一步研究該miRNA分子的癌生物學功能及其調(diào)控機制。

圖4　hsa?miR?138?1靶基因的GO分析Fig.4 Gene ontology analysis on the targets of hsa?miR?138?1

表1　hsa?miR?138?1靶基因的KEGG通路分析結(jié)果Tab.1 KEGG pathway analysis on the targets of hsa?miR?138?1

圖5　hsa?miR?138?1靶基因的KEGG通路分析結(jié)果Fig.5 KEGG pathway analysis on the targets of hsa?miR?138?1

在miRNA基因家族中，部分miRNA表現(xiàn)出雙重功能，具有明顯的組織或細胞特異性。miR-138是這類“雙重功能”miRNA的典型代表，它在多數(shù)實體瘤中表現(xiàn)為類似抑癌基因的作用，但在膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)為類似癌基因的功能。Pignot等［15］發(fā)現(xiàn)hsamiR-138在非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌中表達均上調(diào)。Kozinn等［16］證明hsa-miR-138在膀胱癌細胞耐藥過程中可能發(fā)揮了癌基因的作用。Nordentoft等［17］發(fā)現(xiàn)抑制hsa-miR-138可以增加部分膀胱癌細胞對順鉑的反應(yīng)，提示miR-138可使膀胱癌細胞對順鉑化療產(chǎn)生耐藥性，并可作為一種新的癌細胞對化療敏感性反應(yīng)的標記物。與上述研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)在miR-138的預(yù)測靶基因中存在已被報道的泌尿系腫瘤抑癌基因UNC5A［18-19］和UNC5D［20-22］，而一些在膀胱癌進展中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、Jun、c-Myc則可能直接參與了miR-138的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。因此，miR-138可能在膀胱癌中也表現(xiàn)為類似癌基因的功能。miRNA雙重功能的具體機制目前尚不清楚。有研究認為，miRNA所調(diào)控的靶基因眾多，功能各異，其中有些是抑癌基因，有些是癌基因，在調(diào)控部分抑癌基因表達的同時又可調(diào)控部分癌基因的表達，因此miRNA的功能表現(xiàn)為這些下游靶基因的綜合作用。另有研究認為，miRNA靶基因的表達有其時空特異性，因此miRNA的雙重功能可能與特定時空下靶基因的選擇性表達有關(guān)。

圖6　預(yù)測的hsa?miR?138?1靶基因在軸突導(dǎo)向分子通路中的分布示意圖Fig.6 Distribution of the predicted target genes of hsa?miR?138?1 in axon guidance pathway

圖7　通過Chipbase查詢得出的調(diào)控miR?138的轉(zhuǎn)錄因子Fig.7 Regulatory transcription factors of hsa?miR?138 predicted with Chipbase

miRNA靶基因數(shù)目大，種類多，廣泛地參與眾多細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在生命活動中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用。GO分析可對特定miRNA的靶基因進行分類注釋，供不同需求者進行篩選和提取。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-138靶基因的GO注釋主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、RNA代謝過程的調(diào)節(jié)、生物大分子的合成等方面。KEGG可對某一miRNA諸多靶基因所涉及信號通路進行整合分析，本研究KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)miR-138靶基因功能顯著富集于癌癥通路、軸突導(dǎo)向、細胞內(nèi)噬作用、Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生理病理過程。目前關(guān)于miR-138生物學功能的研究多集中于單一或多重靶基因的鑒定，但針對某一信號通路整體調(diào)控的研究，尚未見報道。本研究結(jié)果提示miRNA-138具有可待挖掘的多重生物學功能，可通過調(diào)節(jié)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，未來可在其作用機制和對Wnt、Notch、TGF-β等信號通路的整體調(diào)控方面展開深入研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法對miR-138進行序列分析、靶基因預(yù)測、GO分析和KEGG信號通路分析及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，結(jié)果顯示受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的miR-138可能通過調(diào)控多個靶基因參與信號通路的調(diào)節(jié)，在腫瘤發(fā)展、分子生物合成、神經(jīng)發(fā)育等生理病理過程中發(fā)揮著重要作用。上述分析揭示的某些轉(zhuǎn)錄因子→hsa-miR-138→靶基因信號通路可作為頗有研究價值的生物學靶標，為進一步探索miR-138異常表達群體所涉及的分子機制提供理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)。

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（編輯王又冬）

Bioinformatic Analysisofhsa-miR-138and Predictionof Its Molecular Regulation Pathways

SUNDan1，YUMeng2，ZHENGMingxing1，GAOYing1，ZHUYuyan1
（1. Department of Uro1ogy，The First Hospita1，China Medica1 University，Shenyang 110001，China；2. Department of Laboratory Anima1，China Medica1 University，Shenyang110001，China）

AbstractObjective To predict target genes of hsa-miR-138 by bioinformatic ana1ysis，carry out functiona1 enrichment ana1ysis and signa1 pathway enrichment ana1ysis of the target genes，and exp1ore its transcriptiona1 regu1atory factors，so as to provide a theoretica1 basis for the further study ofhsa-miR-138function.Methods The sequences of hsa-miR-138wereana1yzedwithUCSC，andhsa-miR-138-1targetgeneswerepredictedusing TargetScan，starbase. Functiona1 enrichment ana1ysis of target genes and signa1 pathway enrichment ana1ysis were carried out using DAVID and KEGG database. Chipbase was used to predict the possib1e transcriptiona1 regu1atory factors of hsa-miR-138. Results The sequence of hsa-miR-138washigh1yconservedamongvariousspecies.Bysearchingthecurrent1iteratures，thetargetgenesofhsa-miR-138-1werefoundtobenoton1ytumor suppressor genes，but a1so cancer genes. GO ana1ysis showed that the target genes of hsa-miR-138-1 were main1y enriched in transcription regu-1ation，transcription，RNA metabo1ism，gene expression，bio1ogica1 macromo1ecu1ar synthesis（P ＜ 0.01），and KEGG pathway ana1ysis indicated that the re1ated signa1ing pathways were invo1ved in the physio1ogica1 and patho1ogica1 processes，inc1uding cancer pathway，axon guidance，endocytosis，Wnt signa1ing pathway，neurotrophin signa1ing pathway. A tota1 of 19 regu1atory transcription factors of hsa-miR-138 were predicted by Chipbase. Conclusion hsa-miR-138 may be invo1ved in some important bio1ogica1 processes，which act as a bi1atera1 regu1ative factor for tumor bio1ogica1behavior.

中圖分類號Q7

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0481-06

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.001

基金項目：國家自然科學基金（81272834，81472404，81472403）

作者簡介：孫丹（1982 -），女，主治醫(yī)師，碩士.

通信作者：朱育焱，E-mai1：zhyy88@hotmai1.com

收稿日期：2015-11-05