淫羊藿苷聯(lián)合齊墩果酸對RAW264.7小鼠巨噬細胞遷移和M1極化的影響

明康文，洪創(chuàng)雄，姜濤，王劍

（1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州　510301；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州　510405）

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淫羊藿苷聯(lián)合齊墩果酸對RAW264.7小鼠巨噬細胞遷移和M1極化的影響

明康文1，洪創(chuàng)雄2，姜濤2，王劍2

（1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州510301；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510405）

摘要：【目的】探討淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用對RAW264.7巨噬細胞遷移及極化的影響，并探究雌激素受體在此過程中的作用?！痉椒ā颗囵B(yǎng)RAW264.7巨噬細胞，隨機分為空白組［不加脂多糖（LPS）及藥物］、LPS組（加入終濃度為20 μg/L 的LPS）、1.5 μmol/L淫羊藿苷+1.5 μmol/L齊墩果酸組、3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組、雌激素受體拮抗劑ICI182780（終濃度1×10-3mmol/L）+1.5 μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齊墩果酸組、ICI182780（終濃度1×10-3mmol/L）+3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組。應用Transwell小室遷移實驗觀察淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用對LPS誘導的巨噬細胞遷移效應的影響；應用流式細胞術觀察淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用對LPS誘導的巨噬細胞M1極化的抑制作用，并用雌激素受體阻斷劑ICI183780觀察雌激素受體在這個過程中的作用?！窘Y果】Transwell小室遷移實驗結果表明：與空白組比較，LPS組可顯著促進RAW264.7巨噬細胞的遷移（P<0.05）；與LPS組比較，ICI182780+1.5 μmol/L淫羊藿苷+1.5 μmol/L齊墩果酸組、ICI182780+3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組均可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的遷移（P<0.05），且ICI182780+3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組作用優(yōu)于ICI182780+1.5 μmol/L淫羊藿苷+1.5 μmol/L齊墩果酸組（P<0.05）。流式細胞術檢測結果顯示：與空白組比較，LPS組CD11c+表達顯著升高（P<0.05），說明20 μg/L的LPS可以刺激RAW264.7巨噬細胞，使其向M1極化；與LPS組比較，1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸組、3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組可協(xié)同LPS作用于RAW264.7巨噬細胞，使其向M1極化（P<0.05）；與LPS組比較，ICI182780+1.5 μmol/L淫羊藿苷+1.5 μmol/L齊墩果酸組、ICI182780+3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組均可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞向M1極化（P<0.05），且ICI182780+3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齊墩果酸組作用優(yōu)于ICI182780+1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齊墩果酸組（P<0.05）?！窘Y論】淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用可能通過雌激素受體產生促進RAW264.7巨噬細胞的遷移和M1極化的作用，并在雌激素受體受到抑制后產生相反的作用。

關鍵詞：淫羊藿苷；動脈粥樣硬化/中藥療法；齊墩果酸；巨噬細胞/病理學；遷移；極化；雌激素受體；細胞培養(yǎng)

淫羊藿苷是中草藥淫羊藿的主要活性成分，屬于黃酮苷類化合物［1］。齊墩果酸是中藥女貞子的主要成分［2］。兩者皆為加味二至丸（淫羊藿、女貞子、墨旱蓮）的重要組成藥物，其中女貞子和淫羊藿均被證實有植物雌激素樣作用［3-4］。本研究采用體外培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細胞，通過脂多糖（LPS）刺激誘導其遷移及M1極化，以雌激素受體拮抗劑ICI182780拮抗雌激素受體，探究淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用對巨噬細胞遷移和極化過程中的作用，并探討其與雌激素受體之間的關系，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1細胞株小鼠巨噬細胞系RAW 264.7（由本實驗室保存），加入含10%（體積分數）胎牛血清、100 U/mL青霉素、鏈霉素的高糖DMEM，置于體積分數5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中生長。細胞生長至70%～80%融合后傳代，一般2～3 d傳代1次。

1.2藥物齊墩果酸（廣州齊云生物技術有限公司提供，批號：110709，純度＞980 mg/g）、淫羊藿苷（上海市融禾醫(yī)藥公司提供，批號：20081478，純度＞980 mg/g）。采用二甲基亞砜（DMSO）助溶，-4℃保存，實驗前用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，DMSO終濃度小于體積分數0.1%。雌激素受體拮抗劑ICI182780以DMSO配置成50 mmol/L的儲存液，-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑與儀器脂多糖（LPS，美國Sigma公司產品，批號：L2880）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DMSO（上海翊圣生物科技有限公司產品）；雌激素受體拮抗劑ICI182780（購自齊云生物技術有限公司，貨號：M182780）；異硫氰酸熒光素（FITC）標記CD11c+抗體（美國BD公司產品）；結晶紫染色液（碧云天公司產品）；Transwell 24孔板（美國Corning公司產品，孔徑為8 μm）；ORMA 371型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司產品）；iMark型酶標儀16138、C6流式細胞儀（美國Bio-Rad公司產品）。

1.4RAW264.7細胞活力檢測調整RAW264.7細胞懸液濃度為1×105/mL，加入96孔培養(yǎng)板內，每孔體積為100 μL，置于5%（體積分數）CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。吸出舊的培養(yǎng)基，分別加入淫羊藿苷與齊墩果酸混合培養(yǎng)基，終濃度分別為1.5 μmol/L、3.0 μmol/L?？瞻捉M加含0.1%（體積分數）DMSO的培養(yǎng)基，每組設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 20 μL，37℃培養(yǎng)4 h后，每孔加入150 μL的DMSO，于490 nm處檢測各孔的吸光度值。實驗重復3次以上。

1.5Transwell小室遷移實驗調整RAW264.7細胞懸液濃度為1×106/mL，上室每孔加入100 μL細胞懸液，下室加入600 μL含10%（體積分數）的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞貼壁，換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（使細胞同步化），加入藥物干預。實驗分組：空白組（不加LPS及藥物）、LPS組（加入終濃度為20 μg/L的LPS）、給藥1組（1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸組）、給藥2組（3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組）、給藥3組（ICI182780+1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸組）、給藥4組（ICI182780+3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組）。除空白組和LPS組外，各給藥組均在加藥后4 h加入終濃度為20 μg/L的LPS作用24 h。取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，以40 g/L多聚甲醛固定15 min，再用PBS清洗1次，結晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并統(tǒng)計遷移至下室的細胞數量（隨機選取3個視野）。

1.6流式細胞術檢測RAW264.7細胞CD11c+的表達調整RAW 264.7細胞懸液濃度為1×106/mL，接種至12孔板。待細胞貼壁后換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（使細胞同步化），加入藥物干預。實驗分組同1.5項。除空白組和LPS組外，各給藥組均在加藥后4 h加入終濃度為20 μg/L的LPS作用24 h。消化收集細胞于250 μL的離心管中PBS清洗2～3次，離心，加入200 μL PBS重懸細胞后，加入1 μL大鼠抗小鼠的流式抗體CD11c+，4℃避光孵育30 min。采用流式細胞分析儀檢測，以CD11c+標記百分率代表M1極化的比例。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0 for Windows軟件進行分析。數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組RAW264.7細胞活力檢測結果比較表1結果顯示：與空白組比較，分別給予1.5 μmol/L淫羊藿苷+1.5 μmol/L齊墩果酸、3.0 μmol/L淫羊藿苷+ 3.0 μmol/L齊墩果酸均未顯示出細胞毒性作用（P＞0.05）。

表1　各組RAW264.7細胞活力檢測結果比較Table 1 RAW264.7 macrophage viability of various groups　（±s）

表1　各組RAW264.7細胞活力檢測結果比較Table 1 RAW264.7 macrophage viability of various groups?。ā纒）

組別空白組給藥1組給藥2組N666 D（λ=490 nm）0.57±0.08 0.56±0.06 0.57±0.04

2.2各組對RAW264.7巨噬細胞遷移能力的影響比較表2、圖1結果顯示：與空白組比較，20 μg/L 的LPS組刺激24 h可顯著促進RAW264.7巨噬細胞的遷移（P＜0.05）；與空白組比較，1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸、3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸也可促進RAW264.7巨噬細胞的遷移（P＜0.05），但與LPS組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與LPS組比較，ICI182780+1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸組、ICI182780 + 3.0 μmol/L淫羊藿苷+ 3.0 μmol/L齊墩果酸組均可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的遷移（P＜0.05），且ICI182780+3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組作用優(yōu)于ICI182780 + 1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸組（P＜0.05）。說明在雌激素受體拮抗劑ICI182780存在的情況下，淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用可以抑制RAW264.7巨噬細胞的遷移，其作用可能與雌激素受體相關。

表2　各組對RAW264.7巨噬細胞遷移能力的影響比較Table 2　Comparison of macrophage migration of various groups?。ā纒）

表2　各組對RAW264.7巨噬細胞遷移能力的影響比較Table 2　Comparison of macrophage migration of various groups?。ā纒）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與LPS組比較；③P＜0.05，與給藥3組比較

組別N n遷移至下室的細胞/（個·視野-1）空白組LPS組給藥1組給藥2組給藥3組給藥4組333333 133.0±6.66 194.0±4.93①198.0±8.50①183.7±17.95①161.3±2.91②93.3±2.60②③

2.3各組對RAW64.7巨噬細胞CD11c+表達的影響表3、圖2結果顯示：與空白組比較，LPS組CD11c+表達顯著升高（P＜0.05），20 μg/L的LPS組可以刺激RAW264.7巨噬細胞，使其向M1極化；與LPS組比較，1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸、3.0 μmol/L淫羊藿苷+ 3.0 μmol/L齊墩果酸組可協(xié)同LPS作用于RAW264.7巨噬細胞，使其向M1極化（P＜0.05）；與LPS組比較，ICI182780+ 1.5 μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸組、ICI182780 + 3.0 μmol/L淫羊藿苷+ 3.0 μmol/L齊墩果酸組均可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞向M1極化（P＜0.05），且ICI182780 + 3.0 μmol/L淫羊藿苷+3.0 μmol/L齊墩果酸組作用優(yōu)于ICI182780 + 1.5μmol/L淫羊藿苷+ 1.5 μmol/L齊墩果酸組（P＜0.05）。說明雌激素受體在雌激素受體拮抗劑ICI182780存在的情況下，淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用可以抑制RAW264.7巨噬細胞向M1極化，其作用可能與雌激素受體相關。

圖1　各組對RAW264.7巨噬細胞遷移能力的影響（結晶紫染色，×20）Figure 1 RAW264.7 macrophage polarization in various groups（by crystal violet staining，×20）

表3　各組對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞CD11c+表達的影響比較Table 3 The percentage of CD11c+positive labeling in LPS-induced RAW264.7 macrophages of various groups?。ā纒）

表3　各組對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞CD11c+表達的影響比較Table 3 The percentage of CD11c+positive labeling in LPS-induced RAW264.7 macrophages of various groups?。ā纒）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與LPS組比較；③P＜0.05，與給藥3組比較

組別空白組LPS組給藥1組給藥2組給藥3組給藥4組N333333 pCD11c+標記百分率/% 16.9±0.8 86.6±0.3①95.1±0.8①②90.0±0.2①②79.7±1.0①②62.8±0.4①②③

3　討論

動脈粥樣硬化（AS）是一個復雜的代謝性心血管疾病，在針對其形成的研究中，提出了各種學說，如羅素發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞的浸潤，提出了動脈粥樣硬化炎癥學說、損傷應答學說以及德國病理學家威爾嘯提出的脂質浸潤學說［5］。在上述各種學說中，巨噬細胞的作用可以說是貫穿了動脈粥樣硬化整個發(fā)生發(fā)展的過程中。巨噬細胞按照其表現(xiàn)和分泌的細胞因子可以分為2種極化類型，即經典活化的M1型和選擇性活化的M2型巨噬細胞［6］。其中，M1型巨噬細胞在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中通過分泌促炎性的細胞因子如腫瘤壞死因子-α等和趨化因子參與炎癥進程，表現(xiàn)為促進炎癥反應。而M2型巨噬細胞則通過分泌抑制性細胞因子如白細胞介素-10等下調免疫應答，表現(xiàn)為抑制炎癥反應［7］。在AS進程中，M1型巨噬細胞主要存在于不穩(wěn)定斑塊中［8］，CD11c+為其表面特異性標志物，可作為其M1極化的檢測標志。

雌激素通過雌激素受體（ER）參與體內生理和病理相關過程，在AS進程中，雌激素可直接作用于內皮細胞、平滑肌細胞、血管外膜的成纖維細胞，對心血管系統(tǒng)有直接的保護作用。如雌激素可以通過非基因途徑激活ERK1/2途徑上調cyclin D1的表達促進內皮細胞增殖與修復［9］；在血管平滑肌細胞則可通過膜雌激素受體激活ERK1/2信號通路而抑制平滑肌細胞的增殖，這一過程受caveeolin-1蛋白介導［10-12］；雌激素還可以抑制球囊損傷術后血管外膜成纖維細胞的增殖［13-14］。但國外流行病學研究［15-16］結果顯示：在50～59歲婦女中（對應中醫(yī)中絕經期前）通過補充雌激素或具有雌激素效應的藥物可以降低心肌梗死發(fā)病風險，但在70～79歲時（對應中醫(yī)絕經期后），補充雌激素反而會增加心肌梗死的發(fā)病風險。所以說，雌激素的作用在女性動脈粥樣硬化的進程中呈拋物線形作用。ICI172780是一種甾體類選擇性雌激素受體調節(jié)劑，是ER的特異性拮抗劑，它通過ER降解而下調雌激素受體，影響ER二聚體化、干擾ER細胞核定位等方式減少與ER的結合。ERα和ERβ都對特異性拮抗劑ICI172780反應，ICI172780基本可以完全阻斷雌激素的效應［17］。

圖2　各組經LPS誘導RAW264.7巨噬細胞CD11c+表達流式細胞圖Figure 2　Flow cytometry results of CD11c+expression in LPS-induced RAW264.7 macrophages of various groups

本課題組發(fā)現(xiàn)臨床上加味二至丸在防治更年期婦女動脈粥樣硬化中有著較好的療效，并通過卵巢切除更年期大鼠模型，以加味二至丸進行干預。預實驗結果提示加味二至丸可以改善卵巢切除大鼠動脈管周脂肪收縮功能。因淫羊藿與女貞子為具有植物雌激素效應的中藥，推測加味二至丸可能通過雌激素受體產生作用。本研究RAW264.7巨噬細胞活力檢測結果顯示：1.5 μmol/L淫羊藿苷+1.5 μmol/L齊墩果酸、3.0 μmol/L淫羊藿苷+ 3.0 μmol/L齊墩果酸對細胞生長增殖無任何毒性作用，可用于實驗后續(xù)研究。Transwell小室遷移實驗結果表明：在LPS刺激下巨噬細胞遷移數量明顯增加，加入淫羊藿苷與齊墩果酸后，其效應反而是增加的，表明淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用可促進巨噬細胞的遷移。此實驗結果與預期不相符，推測原因可能是在體內與體外藥物作用濃度不一致所導致的。但當雌激素受體拮抗劑ICI183780存在時，淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用卻能顯著抑制巨噬細胞的遷移，提示淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用在雌激素受體受到拮抗時發(fā)揮作用，而且隨著濃度的增加抑制巨噬細胞遷移的能力逐漸增強。流式細胞術檢測巨噬細胞M1極化實驗結果表明：LPS可以誘導巨噬細胞向M1極化，且作用明顯。加入淫羊藿苷與齊墩果酸后，M1極化的比例是增加的，表明淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用可促進巨噬細胞向M1極化。但當雌激素受體拮抗劑ICI183780存在時，淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用卻能顯著抑制巨噬細胞向M1極化，提示淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用在雌激素受體受到拮抗時產生作用，并隨濃度的增加作用增強。

2個實驗的結果相符，共同證實雌激素受體在巨噬細胞的遷移和M1極化中有著重要的作用，而淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)合使用可能通過雌激素受體產生促進巨噬細胞遷移和向M1極化。而當雌激素受體拮抗劑ICI182780阻斷了雌激素受體后，淫羊藿苷與齊墩果酸聯(lián)用可以抑制RAW264.7巨噬細胞和M1極化。本研究結果提示加味二至丸在防治女性動脈粥樣硬化中不僅是通過雌激素受體產生作用，還可通過其他途徑產生作用，具體機制有待進一步研究。

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【責任編輯：黃玲】

Effect of Combined Use of Icariin and Oleanolic Acid on Migration and M1 Polarization of RAW264.7 Macrophages

MING Kangwen1，HONG Chuangxiong2，JIANG Tao2，WANG Jian2
（1.Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510301 Guangdong，China；
2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of the combined use of icariin and oleanolic acid on the migrationand polarization of RAW264.7 macrophages，and to explore the role of estrogen receptor in the migration and polarization process.Methods The cultured RAW264.7 macrophages were randomized into blank control group，lipopolysaccharide（LPS）group（with a final concentration of 20 μg/L of LPS added），low-dose medication group （1.5 μmol/L of both icariin and oleanolic acid），high-dose medication group（3.0 μmol/L of both icariin and oleanolic acid），low-dose medication and ICI182780 group（estrogen receptor antagonist ICI182780 at final concentration of 1×10-3mmol/L+1.5 μmol/L of icariin and oleanolic acid），and high-dose medication and ICI182780 group（ICI182780 at final concentration of 1×10-3mmol/L + 3.0 μmol/L of both icariin and oleanolic acid）.Transwell chamber culture was applied to observe the effect of combined use of icariin and oleanolic acid on the migration of macrophages induced by LPS.Flow cytometry was applied to observe the inhibitory effect of the combined use of icariin and oleanolic acid on M1 macrophage polarization induced by LPS，and ICI183780 was applied to observe the effect of estrogen receptor on the migration and polarization process.Results The result of Transwell chamber culture showed that LPS（20 μg/L）could significantly promote the migration of RAW264.7 macrophages.Compared with LPS group，LPS-induced RAW264.7 macrophage migration was obviously inhibited in low- and high-dose medication and ICI182780 groups（P＜0.05），and inhibition of high-dose medication and ICI182780 group was superior to that of the low dose group（P＜0.05）.Flow cytometry results showed that CD11c +was highly expressed in LPS group（P＜0.05 compared with the control group），indicating that 20 μg/L of LPS stimulated RAW264.7 macrophages and induced it to become M1 polarization.Compared with LPS group，low- and high-dose medication groups had synergistic action on LPS in inducing the M1 polarization of RAW264.7 macrophages（P＜0.05）.Compared with LPS group，low- and high-dose medication and ICI182780 groups had inhibitory effect on LPS-induced M1 polarization in RAW264.7 macrophages（P＜0.05），and the effect of high-dose medication and ICI182780 group was superior to that of the low-dose group （P＜0.05）.Conclusion The combined use of icariin and oleanolic acid can promote the migration and M1 polarization of RAW264.7 macrophages probably mediated by estrogen receptors，and has the opposite effect when estrogen receptor is inhibited.

Key words：icariin；atherosclerosis/TCD therapy；oleanolic acid；macrophages/pathology；migration；polarization；estrogen receptors；cell culture

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0366 - 06

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．020

收稿日期：2015-10-23

作者簡介：明康文（1976-），女，副主任中醫(yī)師，碩士研究生導師；E-mail：mkw1976828@sina.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：81373799）；廣東省自然科學基金資助項目（編號：S201201001040967）