三黃湯對3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝的影響

劉慶豐，劉　毅，焦　正，李中東，施孝金，鐘明康

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 1.臨床藥學(xué)研究室，上?！?00040；2. 中醫(yī)科，上?！?00040)

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三黃湯對3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝的影響

劉慶豐1，劉毅2，焦正1，李中東1，施孝金1，鐘明康1

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 1.臨床藥學(xué)研究室，上海200040；2. 中醫(yī)科，上海200040)

摘要：目的研究三黃湯(SHD)對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝的作用及可能的調(diào)控機制。方法高糖高胰島素(含地塞米松)誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細胞發(fā)生胰島素抵抗，給予對照藥物羅格列酮(Ros)或不同濃度SHD干預(yù)24 h，檢測培養(yǎng)上清中葡萄糖減少(消耗)量、甘油和游離脂肪酸(NEFA)濃度以及細胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量；以2-脫氧-[3H]-葡萄糖攝入法觀察脂肪細胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運率；應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT-4)的mRNA表達水平，以Western blot檢測GLUT-4蛋白的表達水平。結(jié)果與對照組相比，SHD的中高劑量(5、10、20、40 g·L-1)能使胰島素抵抗脂肪細胞的葡萄糖消耗量和葡萄糖的轉(zhuǎn)運率增加(P<0.01)、脂肪細胞內(nèi)TG降低(P<0.01)，細胞上清液中甘油的濃度不同程度增加(P<0.01)，并明顯減少NEFA的溢出，以上變化在三黃湯5～20 g·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系；同時，Ros增加葡萄糖消耗、葡萄糖的轉(zhuǎn)運率和細胞內(nèi)TG積累(P<0.01)，對培養(yǎng)上清中甘油、NEFA無明顯影響(P>0.05)。SHD中、高劑量與Ros都能不同程度明顯上調(diào)GLUT-4的mRNA和蛋白表達水平(P<0.01)。結(jié)論SHD能明顯增加3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取和消耗，促進細胞內(nèi)TG分解，并減少NEFA溢出，通過調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝改善胰島素抵抗。

關(guān)鍵詞：三黃湯；葡萄糖；甘油三酯；甘油；游離脂肪酸；葡萄糖轉(zhuǎn)運子4；3T3-L1細胞

現(xiàn)代研究表明，肥胖作為一種低度炎癥[1]，可以促進以胰島素抵抗為中心環(huán)節(jié)的多種代謝綜合癥，如高血糖、高血壓、高血脂、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。脂肪細胞中糖脂代謝失衡會導(dǎo)致脂肪組織中脂肪細胞增多及腫大，引發(fā)肥胖的發(fā)生與發(fā)展。三黃湯(sanhuang decoction,SHD)主要由黃芪、黃連、蒲黃等中藥組成，依據(jù)國家自主知識產(chǎn)權(quán)的專利藥物益氣散聚方(公開號：CN 101530517A)的精簡方(三黃方，醫(yī)院協(xié)定處方)配制；該方具有推動氣化、活血散瘀、清熱祛濕、調(diào)脂消炎的功效；臨床應(yīng)用多年，用于治療以糖脂異常、腹部肥胖、非酒精性脂肪肝等為主要癥狀的代謝綜合癥患者。前期，我們已報道了SHD(又名三黃口服液、益氣湯)的制備方法，并對其進行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制研究，表明其主要化學(xué)成分為異喹啉類生物堿、綠原酸、黃酮類成分，另外含有少量的三萜皂苷類、倍半萜類化合物和其它有機酸類等[2-3]。本研究通過觀察SHD對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝的影響，以及對脂肪細胞糖轉(zhuǎn)運過程起限速作用的GLUT-4表達的影響，探討SHD改善脂肪細胞糖脂代謝的作用與機制，為臨床應(yīng)用提供理論支持。

1材料

1.1實驗對象

3T3-L1細胞株(購自中國科學(xué)院上海細胞典藏所)。

1.2藥品與試劑

三黃湯(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院制劑室制備，藥材總含量4.20 g·mL-1，小檗堿、巴馬汀、藥根堿、綠原酸含量分別為8.39、1.74、0.76、1.96 g·L-1，患者口服量為1.20 g·kg-1·d-1；通常由醫(yī)院制劑室統(tǒng)一煎制后發(fā)給患者，目前尚未成為正式院內(nèi)制劑)由黃芪、黃連、蒲黃、澤瀉、茵陳組成，藥材全部購自上海虹橋中藥飲片有限公司；馬來酸羅格列酮(純度>98%，鄭州荔諾生物科技有限公司)；小牛血清(Gibco，批號：1270008)；優(yōu)級胎牛血清(Gibco，批號：1300001)；地塞米松(批號：123K11611)、胰島素(Sigma，批號：096K16911)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma，批號：BCBF4310 V)、油紅O (Amresco，批號：2716B062)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，批號：1290007)；KRP緩沖液(131.2×10-3mol·L-1NaCl、4.71×10-3mol·L-1KCl、2.47×10-3mol·L-1CaCl2、2.48×10-3mol·L-1Na3PO4、1.24×10-3mol·L-1MgSO4，10×10-3mol·L-1HEPES，pH7.4)、2-脫氧-[3H]-葡萄糖(武漢楷倫化學(xué)新材料有限公司)；脫脂奶粉、硝酸纖維膜購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；葡萄糖臨床檢測試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司，批號：20081013)；甘油三酯試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130702)，甘油含量測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：E1002)；游離脂肪酸測試盒(日本和光純藥工業(yè)株式會社，批號：KMM5430)；TRIzol(Invitrogen，批號：5189701)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，批號：00057250)；SYBR Green PCR試劑盒(美國ABI公司，批號：0905051)；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成?？捡R斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140521)；蛋白Marker(Fermentas Life Science公司，批號：SM0671)；兔抗大鼠β-actin一抗(美國SantaCruz公司，批號：0807)；小鼠抗大鼠GLUT4抗體(R&D公司，批號：BKZ01)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號：ZB-2301)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(批號：ZB-2305)、增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒(批號：GG98315)均為美國Pierce公司產(chǎn)品；丙烯酰胺(4.21 mol·L-1)-甲叉雙丙烯酰胺(5.22×10-2mol·L-1)、2×Sample Buffer、吐溫20均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3儀器

高速冷凍離心機(德國 Sigma公司，型號：2-16PK)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，型號：Heracell150I)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，型號：Ti-U)，熒光定量PCR儀(ABI公司，型號：7500)，酶標(biāo)儀(BioTek，型號：SynergyHT)，電泳儀(Tanon公司，EPS 300)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(上海琪特分析儀器有限公司，型號：STS-8A)；凝膠成像分析儀(GE公司，型號：LAS 3000)。

2方法

2.1構(gòu)建3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型

與秦佑[4]報道方法類似，簡言之，將3T3-L1細胞株，置于含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞融合2 d后(分化0 d)，加含0.50×10-3mol·L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤，1.01×10-6mol·L-1地塞米松，1.72×10-4mol·L-1(1.0 mg·L-1)胰島素，10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h(分化3 d)，換以含1.72×10-4mol·L-1胰島素的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h(分化5 d)，隨后以10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換培養(yǎng)液1次。

2.2實驗分組

24孔板培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞，分化d 10進行分組?？瞻讓φ战M(Con)：10%胎牛血清的DMEM；三黃湯分為5個劑量組：相對生藥量2.5、5、10、20、40 g·L-1；羅格列酮對照組(Ros)：羅格列酮1.0×10-5mol·L-1。每個試驗藥物重復(fù)6孔，各孔給予同等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)，37 ℃溫育24 h。

2.3脂肪細胞染色鑒定

采用油紅O染色方法觀察脂肪細胞分化情況[4]。3.33×10-3mol·L-1甲醛室溫下固定細胞1 h，PBS洗3次，應(yīng)用浮片法油紅O溶液室溫染色2 h，用異丙醇洗去未著色的染料，然后用蘇木精復(fù)染細胞核，明場鏡下觀察拍攝。

2.4葡萄糖消耗與TG分解產(chǎn)物測定

收集培養(yǎng)上清，應(yīng)用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶(GOD-POD)法測定殘存的葡萄糖濃度，以未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度與之相減得出葡萄糖消耗量，同時采用bicinchoninic acid(BCA)法測定總蛋白濃度，以mol·g-1·Pro校正結(jié)果；應(yīng)用甘油激酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法測定游離甘油的濃度；應(yīng)用酯酰輔酶A合成酶-酯酰輔酶A氧化酶(ACS-ACOD)法測定NEFA濃度；各實驗的具體步驟根據(jù)試劑說明書進行。

2.5細胞內(nèi)TG含量測定

細胞刮刀收集脂肪細胞，37 ℃-液氮反復(fù)凍融3次裂解細胞，1 000 r·min-1離心5 min，應(yīng)用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-POD)法測定TG濃度，測定細胞蛋白濃度，以mol·mg-1·Pro校正細胞內(nèi)TG含量。

2.6葡萄糖轉(zhuǎn)運實驗

將上述誘導(dǎo)好的3T3-L1細胞以KRP緩沖液洗3次，再以含有胰島素(1.0×10-8mol·L-1)的KRP緩沖液孵育30 min，加入含2-脫氧-[3H]-葡萄糖(1.85×104Bq·mL-1)的KRP緩沖液孵育10 min，然后以預(yù)冷的含0.01 mol·L-1葡萄糖的PBS液快速洗滌3次終止反應(yīng)，再加入1 mL NaOH(1.0×10-4mol·L-1)，2 h后取0.2 mL細胞裂解液于閃爍液中避光放置12 h，用液體閃爍計數(shù)器進行計數(shù)。另設(shè)一組細胞加入細胞松弛素B(1.0×10-5mol·L-1)作為對照，所有數(shù)據(jù)減去該值，作為各組葡萄糖攝取率。

2.7逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR(real-time PCR)檢測GLUT-4 mRNA的表達

根據(jù)TRIzol說明書抽提細胞總RNA，紫外分光光度計測定濃度[5]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取3 μg總RNA以O(shè)ligo(dT)18為引物，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)總體積20 μL，其中2 μL cDNA樣本進行PCR擴增。GLUT-4引物上游:5′-CCCCGCTGGAATGAGGTTTTTGAGGTGAT-3′，下游：5′-CAG ACAGGGGCCGAAGATTGGGAGACAGT-3′；β-actin引物上游:5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游：5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 25 s，55℃ 25 s，72℃ 50 s，共40個循環(huán)，72℃后延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束由7500軟件分析結(jié)果，計算CT(每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))值，為避免假陽性信號，使用熔解曲線來檢查非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成。以β-actin基因為內(nèi)標(biāo)參照，使用比較法(△△CT)來計算基因的相對定量。

2.8Western blot檢測GLUT-4蛋白的表達

與袁芳[6]報道方法類似，簡要過程為：取15 μL樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再用含脫脂奶粉和Tween20的TBST室溫下封閉2 h后加入兔抗小鼠GLUT-4抗體(1 ∶1 000)和抗β-actin抗體(1 ∶1 000)孵育(一抗)，4℃搖床上過夜，然后以吐溫/PBS洗滌膜3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)孵育膜，室溫輕搖2 h，充分洗滌后用ECL顯影曝光，洗片。掃描儀掃描電泳條帶，用“MultiGauge”(version 3.1)軟件進行光密度積分值分析，計算出GLUT-4與內(nèi)參照β-actin的光密度積分值之比作為GLUT-4的相對含量值。

2.9數(shù)據(jù)分析

3結(jié)果

3.1脂肪細胞分化前后形態(tài)學(xué)變化

3T3-L1前脂肪細胞為梭形，呈纖維母細胞的形態(tài)，細胞質(zhì)內(nèi)無脂滴。誘導(dǎo)分化后，細胞變大變圓，細胞質(zhì)內(nèi)逐漸出現(xiàn)脂滴，8～12 d后分化率85%以上。分化成熟的脂肪細胞，胞質(zhì)內(nèi)大量脂滴聚集于核周，脂滴可被油紅O染成紅色。見Fig 1。

3.2三黃湯對脂肪細胞葡萄糖消耗與TG代謝的影響

與Con比較，三黃湯各劑量組、羅格列酮對照組不同程度促進細胞葡萄糖攝取利用，培養(yǎng)上清葡萄糖消耗量較對照組均明顯增加(P<0.01，除2.5 g·L-1組外)，其中SHD各劑量組(由低到高)、Ros較對照組分別增加102%、120%、150%、166%、154%、215%；三黃湯降低細胞內(nèi)TG積累(P<0.05或0.01)，羅格列酮使細胞內(nèi)TG積累增加(P<0.01)；中高劑量的三黃湯增加細胞培養(yǎng)上清中甘油含量但降低游離脂肪酸的含量，作用明顯(P<0.01)；羅格列酮對培養(yǎng)上清中甘油和游離脂肪酸含量作用不明顯(P>0.05)。結(jié)果見Tab 1。在實驗條件下，20 g·L-1的三黃湯對胰島素抵抗的3T3-L1細胞糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用接近最大化。

Fig 1　Morphological changes of 3T3-L1 adipocyte before and after differentiation(×200)

A:3T3-L1 adipocyte before differentiation；B:3T3-L1 adipocyte before differentiation stained with oil O;C:3T3-L1 adipocyte after differentiation stained with oil O

3.3三黃湯對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

將Con組葡萄糖攝取率設(shè)為1，較正常細胞葡萄糖攝取率下降58.1%。干預(yù)12 h后，葡萄糖攝取率發(fā)生明顯變化。由低到高三黃湯各劑量組、羅格列酮對照組不同程度促進胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率(P<0.01，除2.5 g·L-1三黃湯組外)，它們較Con組分別增加2%、39%、78%、111%、86%、251%；2.5 g·L-1的三黃湯不能明顯增加胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取率(P>0.05)，但有增加趨勢。提示干預(yù)時間為12 h的條件下，20 g·L-1三黃湯對脂肪細胞葡萄糖攝取率的作用接近最大化，見Fig 2。

3.4三黃湯對GLUT-4的mRNA和蛋白表達的影響

與Con組比較，三黃湯各劑量組及羅格列酮組均能不同程度升高脂肪細胞GLUT-4的mRNA和蛋白表達水平；其中中高劑量的三黃湯組、羅格列酮組與Con組相比較，對GLUT-4的mRNA表達水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見Fig 3和Fig 4。

Tab 1　Dose-effect of SHD on glucose and lipid metabolism of insulin resistant 3T3-L1±s,n=6)

**P<0.01，*P<0.05vsCon

Fig 2　Dose-effect of SHD on glucose intake ratio

1:Con group;2:SHD 2.5 g·L-1group;3:SHD 5 g·L-1group;4:SHD 10 g·L-1group;5:SHD 20 g·L-1group;6:SHD 40 g·L-1group;7:Ros group.**P<0.01vscontrol group

1:Con group;2:SHD 2.5 g·L-1group;3:SHD 5 g·L-1group;4:SHD 10 g·L-1group;5:SHD 20 g·L-1group;6:Ros group.**P<0.01vscontrol group

Fig 4　Effect of SanHuang decoction on expression of GLUT4 protein in 3T3-L1 adipocytes by Western blot

1:Con group;2:SHD 2.5 g·L-1group;3:SHD 5 g·L-1group;4:SHD 10 g·L-1group;5:SHD 20 g·L-1group;6:Ros group

4討論

從中醫(yī)臟腑角度而言，代謝綜合征的成因主要是脾氣虛弱，加上多食肥甘，惰怠少動。肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，從而傷及中焦氣機，使中焦之氣瘀滯，脾胃升降失常，樞機不得斡旋，脾氣郁滯；脾主四肢肌肉，活動的減少，肌肉的怠惰，也會影響脾的健運。代謝綜合征患者，脾的運化、散精功能出現(xiàn)障礙，精微物質(zhì)進人體內(nèi)，不能為機體所利用。脾不散精，物不歸正化則為痰、為濕、為濁、為脂，臨床出現(xiàn)高血糖、高血脂，傷及脈道，則還會引起高血壓等一系列疾病[7]。“濕、濁、痰、瘀”之邪積存于腹下，則成腹型肥胖，積存于全身各處，則出現(xiàn)周身肥胖，痰濁結(jié)于中焦，郁而化熱，出現(xiàn)痰熱互結(jié)；痰濁日久，因痰致瘀，或因瘀致痰，則出現(xiàn)痰瘀互阻；痰濁壅塞，阻礙氣機升降，使肝失疏泄，致氣滯血瘀痰阻，脂濁流溢皮下，積于脈道，瘀久化熱[8]。三黃湯以此立論，以益氣散結(jié)、清熱化痰為主，佐以祛濕降濁、化瘀調(diào)脂。

臨床實踐中，我們發(fā)現(xiàn)三黃湯對代謝綜合征或2型糖尿病體形肥胖或超重、肚腹碩大者具有肯定的療效，三黃湯還可明顯降低代謝綜合征人群胰島素抵抗程度，并能改善炎癥狀態(tài)，減輕致心血管病的危險性[9]。3T3-L1脂肪細胞是體外研究胰島素抵抗發(fā)病機制和降糖藥物作用機制的重要細胞模型。本實驗采用高濃度葡萄糖及高濃度胰島素培養(yǎng)的脂肪細胞模型，能較好模仿胰島素抵抗患者體內(nèi)高糖高胰島素血癥的病理環(huán)境。以3T3-L1脂肪細胞為載體，給予不同劑量的三黃湯，并采用過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑-羅格列酮作為對照藥物，實驗發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)24 h，5個劑量的三黃湯與Ros均使葡萄糖消耗量分別增加到102%、120%、150%、166%、154%、215%，5個劑量的三黃湯較Ros組稍差。在多數(shù)情況下，葡萄糖轉(zhuǎn)運都是細胞葡萄糖利用的限制步驟，而GLUT-4是負責(zé)脂肪細胞糖轉(zhuǎn)運的主要蛋白；正常生理狀態(tài)下，90%以上的GLUT-4分布于細胞內(nèi)的囊泡中，受胰島素刺激后，轉(zhuǎn)位至細胞膜而促進細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運；刺激消失后，GLUT-4被細胞膜內(nèi)吞而從細胞外膜運回細胞囊泡中[10]。三黃湯上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-4 的mRNA和蛋白的表達，與其重要組分茵陳中綠原酸以及黃連中小檗堿作用類似[11-12]；本實驗同時也驗證了三黃湯與羅格列酮都能明顯增加胰島素抵抗的3T3-L1細胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運率。

羅格列酮雖然增加胰島素敏感性，但具有增加脂質(zhì)積累、引起肥胖的不良反應(yīng)，盡管其與三黃湯都可以通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-4的表達，增加脂肪細胞葡萄糖轉(zhuǎn)用與消耗；但是與羅格列酮增加脂肪細胞胞內(nèi)TG積累不同，三黃湯使胞內(nèi)TG明顯降低，與組方中高含量的生物堿成分特別是小檗堿抗脂肪細胞脂質(zhì)生成的作用相似[13]。

胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的脂肪細胞，其甘油三酯分解加快，F(xiàn)FA過度溢出，而高濃度的FFA又可引起和加重胰島素抵抗，兩者互為因果，相互影響[14]。羅格列酮作為噻唑烷二酮類衍生物胰島素增敏劑的代表藥物，可促進脂肪細胞的葡萄糖攝取，但對脂肪代謝作用并不明顯。三黃湯不但改善脂肪細胞對葡萄糖的攝取，還可提高其儲存脂肪能力，抑制外周游離脂肪酸的溢出，即三黃湯可以同時影響脂肪細胞的糖代謝與脂代謝來緩解胰島素抵抗。但是，三黃湯這種作用的確切機制及能量的去處仍不明確，而且，藥物在體內(nèi)與體外的作用機制并不完全相同，會受到多種因素的影響，因此進一步研究其在體內(nèi)的作用與影響因素將對臨床應(yīng)用帶來更多的參考價值。

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Effect of Sanhuang Decoction on glucose and lipid metabolism in 3T3-L1 adipocytes

LIU Qing-feng1,LIU Yi2,JIAO Zheng1,LI Zhong-dong1,SHI Xiao-jin1,ZHONG Ming-kang1

(1.ClinicalPharmacyLaboratory, 2.DeptofTraditionalChineseMedicine,HuashanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200040,China)

Abstract:AimTo observe the effect of SanHuang Decoction(SHD) on glucose and lipid metabolism in insulin resistance(IR) 3T3-L1 adipocytes.MethodsThe IR model of 3T3-L1 adipocytes was induced by high glucose and hyperinsulinism cultivation(also containing dexamethasone). The adipocytes were treated with rosiglitazone(Ros) and different concentrations of SHD(2.5, 5, 10, 20, 40 g·L-1) for 24 h. The content of glucose disappeared from the culture medium was determined as glucose consumption of the cells. The transport of glucose was observed by 2-deoxidation-[3H]-glucose uptake method. The efflux of nonesterified fatty acids(NEFA) from adipocytes was observed by the concentration of NEFA in the culture medium. The mRNA expression of glucose transporter-4(GLUT-4) was measured by real-time polymerase chain reaction(real-time PCR). The protein expression of GLUT-4 was detected by Western blot.ResultsCompared with the Con group, SHD(5, 10, 20, 40 g·L-1) could significantly induce the glucose consumption and transportion(P<0.01), increase the glycerol content in culture supernatant(P<0.01), reduce the NEFA concentration in culture medium and accumulation of intracellular TG(P<0.01). And all of these change showed a concentration-dependent effect when SFD concentrations were from 5 g·L-1to 20 g·L-1. At the same time, Ros could also remarkably induce the glucose consumption and transportion(P<0.01), and increase the accumulation of intracellular TG(P<0.01); but the concentration of NEFA and glycerol in culture medium did not show any difference in the Ros-treated group(P>0.05).ConclusionSHD can increase insulin sensitivity by increasing glucose transportation and consumption in the 3T3-L1 adipocytes as well as decreasing the NEFA efflux from the cells.

Key words:Sanhuang Decoction; glucose; triglyceride; glycerol; free fatty acid; GLUT-4；3T3-L1 adipocytes

收稿日期:2016-01-20,修回日期:2016-03-10

基金項目：上海市衛(wèi)計委資助項目(No 2010Y007A，20124053)

作者簡介：劉慶豐(1977-)，男，博士，主管藥師，研究方向：中藥藥動學(xué)與藥理學(xué)，E-mail：lqf338@sina.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.025

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0868-06

中國圖書分類號：R289.5；R329.24；R343.23；R344；R458.5；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.050.html

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

鐘明康(1963-)，男，碩士，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，通訊作者，E-mail：wooo_08@163.com