天然活性分子isatin經(jīng)p53介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡

宋金蓮，馬中良，遲曉偉，陳艷萍，侯　琳

(1. 青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島　266034；2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科,山東 青島　266000；3. 即墨市婦幼保健院檢驗(yàn)科,山東 即墨　266012；4. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,山東 青島　266000)

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天然活性分子isatin經(jīng)p53介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡

宋金蓮1，馬中良2，遲曉偉3，陳艷萍1，侯琳4

(1. 青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島266034；2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科,山東 青島266000；3. 即墨市婦幼保健院檢驗(yàn)科,山東 即墨266012；4. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,山東 青島266000)

摘要:目的探討吲哚醌(isatin)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抗腫瘤作用及其具體的調(diào)控機(jī)制。方法不同濃度isatin(0、50、100、200 μmol·L-1)作用于乳腺癌細(xì)胞48 h后，利用細(xì)胞熒光染色、RT-PCR、Western blot及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)isatin的促凋亡作用。結(jié)果不同濃度isatin處理MCF-7細(xì)胞48 h，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)聚集、細(xì)胞體積縮小及DNA斷裂等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。RT-PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)，隨著isatin濃度的不斷增加，p53、Bax mRNA和蛋白表達(dá)量也逐漸增加，而Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)下降；流式細(xì)胞儀結(jié)果提示不同藥物濃度作用的細(xì)胞膜電位出現(xiàn)不同程度的下降，caspase-9被激活。Western blot結(jié)果顯示isatin處理組細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)胞色素C含量明顯增加，相反線粒體中細(xì)胞色素C含量相應(yīng)降低。結(jié)論isatin具有明顯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的作用，其可能的作用機(jī)制是經(jīng)p53的線粒體凋亡通路被激活。

關(guān)鍵詞：吲哚醌; 乳腺癌細(xì)胞; 凋亡; p53; Bcl-2; Bax; 線粒體膜電位

隨著長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿等新型抗腫瘤藥物在臨床上的應(yīng)用，天然吲哚類化合物的抗腫瘤作用日益引起人們的關(guān)注，因其毒性低而迅速成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)。isatin，又名靛紅，系天然存在于自然界的吲哚類化合物[1]，是我國(guó)獨(dú)創(chuàng)I類天然抗癌新藥靛玉紅的單體結(jié)構(gòu)，存在于人體及多種生物體中，也存在于大青葉及清熱解毒抗癌中藥青黛中，具有廣泛的生物學(xué)活性[2]和生物學(xué)效應(yīng)[3]。1999年，Yue等[4]首次報(bào)告了isatin有抗氧自由基作用，能夠保護(hù)正常神經(jīng)細(xì)胞，并可減輕H2O2導(dǎo)致的多巴胺能細(xì)胞損傷。在之后的研究中，Cane等[5]報(bào)道用isatin和5-羥基吲哚處理N1E-115神經(jīng)母瘤細(xì)胞系，可抑制ERK-2的磷酸化，從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。isatin的這種既能抗腫瘤，又可通過抗氧自由基保護(hù)正常細(xì)胞的特性是目前大多數(shù)抗腫瘤藥所不具有的重要特征。isatin分子量小(Mr147)，能口服給藥，具有靶向抑制腫瘤細(xì)胞增殖并避免損傷正常細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，毒副作用低(已完成急性毒性實(shí)驗(yàn)和6個(gè)月的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)isatin有明顯毒性)，故認(rèn)為isatin是很有開發(fā)價(jià)值的天然的小分子化合物類藥物。

研究表明，isatin及其衍生物具有抗腫瘤活性，但這些研究大多限于現(xiàn)象描述，對(duì)抗腫瘤活性機(jī)制的研究報(bào)道較少，如isatin能明顯抑制人類急性骨髓性白血病(HL60)腫瘤細(xì)胞系的增殖。進(jìn)一步對(duì)isatin進(jìn)行研究評(píng)估，認(rèn)為isatin既可以預(yù)防氧自由基誘發(fā)腫瘤，又可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]；在體外用isatin處理中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)和人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)24 h后，能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]；課題組前期發(fā)表的文章也證實(shí)isatin對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y有明顯的抑制作用[8]。迄今為止，有關(guān)isatin抗乳腺癌的研究較少，劉娜等[9]的研究認(rèn)為isatin 對(duì)DMBA 誘發(fā)的大鼠乳腺癌有預(yù)防作用。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：isatin能明顯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡，并抑制其增殖；同時(shí)使Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)增加[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的是在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實(shí)isatin對(duì)MCF-7細(xì)胞的促凋亡作用，探究其可能的調(diào)控機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑

isatin購自上海元吉化工有限公司，使用少量DMSO將其溶解，母液濃度配制為5 mmol·L-1, 于4 ℃保存，備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)用無血清培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度(0、50、100、200 μmol·L-1)(DMSO濃度控制在<1 %); p53、Bcl-2、Bax和β-actin的抗體購自New England Biolabs公司; TRIzol RNA isolation kit購自Life Technologies公司；ECL發(fā)光試劑購于Amersham Biosciences公司; Hoechst33258、碘化丙啶(PI)染料購自美國(guó)Sigma公司。

1.2細(xì)胞株及其培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。細(xì)胞用H-DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)，含15%胎牛血清(杭州四季青生物公司)，5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3Hoechst 33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為每毫升5×104，接種于6孔板，并放入包被了多聚賴氨酸的蓋玻片。37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后更換新培養(yǎng)液，同時(shí)加入不同濃度isatin，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，用甲醇 ∶冰醋酸(3 ∶1)于4 ℃固定5 min, PBS漂洗2遍，終濃度為5 mg·L-1Hoechst 33258避光染色10 min，PBS清洗后封片，在熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4RT-PCR測(cè)定p53 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞收集于1.5 mL的Eppendorf管中，PBS洗滌3次后，利用TRIzol RNA isolation kit提取RNA，按試劑盒說明進(jìn)行RT-PCR。p53的引物序列為：5′-CTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCC-3′，5′-CTCATTCAGCT CTCGGAACATCTCGAAGCG-3′，370 bp；內(nèi)參照GAPDH的引物序列為：5′-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3′，5′-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′，512 bp。Bcl-2的引物序列為：5′-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3′，5′-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3′，120 bp；Bax的引物序列為：5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′，257 bp；內(nèi)參照GAPDH的引物序列為：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′, 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，452 bp。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)分子量檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。上海培清凝膠紫外攝像分析系統(tǒng)照相后對(duì)條帶進(jìn)行光密度(A)掃描，分別檢測(cè)各組PCR產(chǎn)物與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、p53 蛋白表達(dá)

4 ℃條件下收集不同處理組細(xì)胞，PBS 洗滌2次后，每管加入150 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min后，收集上清液，考馬斯亮藍(lán)法確定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品與樣品Buffer按4 ∶1的比例混勻，煮沸3 min。每孔加樣40 μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品。室溫恒流(40 mA)1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液(5%脫脂奶粉，溶于TBS)室溫封閉2 h后，將膜與含一抗稀釋液(1%脫脂奶粉，溶于TBS中)的一抗(兔抗人β-actin 抗體1 ∶1 000，兔抗人p53抗體1 ∶1 000，兔抗人Bcl-2 抗體1 ∶1 000，兔抗人Bax 抗體1 ∶1 000)封于塑膠袋中，4 ℃過夜，再室溫孵育2 h，TBS洗15 min×3次，將膜與含有第二抗體的稀釋液(1%脫脂奶粉，溶于TBS中) 室溫孵育3 h，TBST洗15 min×3次，將膜包在保鮮膜中，加入ECL發(fā)光試劑，在暗室曝光，顯影，定影。X光底片經(jīng)掃描后，永久保存并對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜電位

收集對(duì)照組及不同濃度isatin處理組細(xì)胞，PBS洗滌2次后，與含5 μmol·L-1Rhodamine 123的PBS室溫避光孵育30 min，PBS清洗2次，離心棄PBS，PBS 重懸, 用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)(CantoⅡ, Becton Dickinson, USA)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7Western blot分別檢測(cè)胞質(zhì)和線粒體Cyto-chrome C蛋白表達(dá)

收集對(duì)照組及不同濃度isatin處理組細(xì)胞，冰冷的PBS洗兩次，將細(xì)胞重懸于Buffer A(250 mmol·L-1sucrose, 1 mmol·L-1EDTA, 50 mmol·L-1Tris-HCl, 1 mmol·L-1DTT, 1 mmol·L-1PMSF, 1 mmol·L-1Benzamidine, 280 u·L-1apotinin, 50 mg·L-1leupeptin, and 7 mg·L-1pepstainA, pH 7.4)中，轉(zhuǎn)移至1 mL玻璃勻漿器，放至冰浴中，上下抽拉30次后離心(1 000g×10 min，4 ℃)，棄沉淀，將上清移至一新EP管中,再離心(10 000g×20 min，4 ℃)，所得上清和沉淀分別為胞質(zhì)、線粒體粗品。為排除溶酶體和過氧化物體污染，需做進(jìn)一步處理，將胞質(zhì)部分轉(zhuǎn)移至超離管中，離心(100 000×g,1 h，4 ℃)，所得上清為純化的胞質(zhì)蛋白；將線粒體沉淀部分重懸于Buffer B(250 mmol·L-1sucrose, 1 mmol·L-1EGTA, 10 mmol·L-1Tris-HCl, 1 mmol·L-1DTT, 1 mmol·L-1PMSF, 1 mmol·L-1Benzamidine, 280 u·L-1apotinin, 50 mg·L-1leupeptin, and 7 mg·L-1pepstain A, pH 7.4)中，離心(10 000×g， 10 min，4℃)，重復(fù)3次，所得線粒體沉淀于細(xì)胞裂解液中裂解(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5；150 mmol·L-1NaCl；5 mmol·L-1EDTA；1% Triton X-100；1%去氧膽酸鈉；1% SDS；1 mmol·L-1PMSF；280 u·L-1Aprotinin；50 mg·L-1leupeptin；7 mg·L-1Pepstatin A),分裝以上蛋白溶液備用。Western blot步驟同“1.5”中所述。

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)caspase-9的活化

收集對(duì)照組及不同濃度isatin處理組細(xì)胞，PBS清洗2次后，與FITC-LEHD-FMK(a specific inhibitor of caspase-9)(eBioscience, 1 ∶300)室溫避光孵育30 min，PBS清洗2次，離心棄PBS，再用PBS 重懸, 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)(CantoⅡ, Becton Dickinson, USA)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1isatin處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

如Fig 1所示，MCF-7細(xì)胞與不同濃度isatin共同孵育48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞胞體縮小、胞質(zhì)發(fā)生濃縮、核染色質(zhì)聚集，并有凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。而對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光。

Fig 1　Apoptosis induction after 48h treatment with isatin in MCF-7 cells

Morphology of MCF-7 cells observed under fluorescence microscope(Hoechst33258×400). DNA fragment and chromatin condensation were observed in isatin-treated cells(B： 50 μmol·L-1isatin, C： 100 μmol·L-1isatin, D： 200 μmol·L-1isatin), but few in untreated cells(A： Control).

2.2p53、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)50、 100、 200 μmol·L-1isatin處理的各組MCF-7細(xì)胞，隨著isatin濃度的不斷增加，p53 mRNA、蛋白表達(dá)量相應(yīng)增加，差異具有顯著性(P<0.05)；對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)一定量的Bcl-2 mRNA、蛋白，不同濃度isatin處理組細(xì)胞Bcl-2 mRNA、蛋白表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度下降(P<0.05)，而Bax mRNA、蛋白在各組之間的差異沒有明顯改變，Bcl-2/Bax 逐漸下降(P<0.05), 見Fig 2、3。

Fig 2　RT-PCR of p53(Ap53/AGAPDH),Bcl-2(ABcl-2/AGAPDH) and Bax(ABax/AGAPDH) mRNA relative expression in MCF-7 cells after 48 h of culture with isatin

2.3細(xì)胞膜電位的變化

細(xì)胞膜電位下降是細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)特征，利用特征性探針Rhodamine 123與各組細(xì)胞孵育，細(xì)胞結(jié)合熒光染料的強(qiáng)度與線粒體膜的極化狀態(tài)直接相關(guān)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果是不同濃度(50、100、200 μmol·L-1)isatin處理組細(xì)胞線粒體膜電位分別為(77.00±2.27)%、(71.47±2.12)%、 (63.67±4.40)%，明顯低于對(duì)照組細(xì)胞的電位(88.40±6.15)%(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 3　Expression of p53, Bcl-2 and Bax proteins in MCF-7 cells after 48 h of treatment with isatin detected by Western blot

2.4Cytochrome C的釋放情況

Cytochrome C的釋放是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵的一步，因?yàn)樗梢约せ钕掠蔚腸aspase，如Fig 5結(jié)果所示與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)不同濃度(50、100、200 μmol·L-1)isatin處理的MCF-7細(xì)胞胞質(zhì)Cytochrome C含量明顯增加，相反線粒體Cytochrome C表達(dá)明顯下降(P<0.05)。

2.5caspase-9的活

眾所周知像Cytochrome C這類的促凋亡蛋白釋放后，會(huì)激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與不同濃度isatin(50、100、200 μmol·L-1) 孵育48 h后的MCF-7細(xì)胞中caspase-9的活化情況，如Fig 6所示，相比較對(duì)照組細(xì)胞的(13.07±2.81)%，isatin處理的各組細(xì)胞活化caspase-9蛋白水平均有不同程度的增加[(21.17±2.63)%、(31.77±3.56)%、(38.73±4.30%)]，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 4　Isatin-induced Dym depolarization in MCF-7 cells(representative experiment).

Cells treated with isatin for 48 h were stained with rhodamine 123 for 30 min and then measured by flow cytometry (representative experiment).

Fig 5　Expression of cytochrome C proteins in MCF-7 cells after 48 h of treatment with isatin detected by western blot

Fig 6　Effect of isatin on caspase-9 activity in MCF-7 Cells(representative experiment)

Cells treated with isatin for 48 h were incubated with FITC-LEHD-FMK for 30 min and then measured by flow cytometry (representative experiment).

3討論

乳腺癌是目前女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是導(dǎo)致女性死亡的主要原因之一[11]。到目前為止，盡管系統(tǒng)的化療方案已常規(guī)用于臨床治療，但化療耐藥及化療所帶來的副作用仍是困擾乳腺癌治療的嚴(yán)峻問題[12]。而天然化合物毒副作用小，具有靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。isatin作為一種天然活性物質(zhì)，已經(jīng)被證實(shí)具有明顯的抗腫瘤作用。課題組前期的研究認(rèn)為isatin能明顯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡，同時(shí)明顯降低Bcl-2/Bax比值[10]，但對(duì)具體的調(diào)控機(jī)制未做進(jìn)一步研究。isatin是如何調(diào)控Bcl-2/Bax的，Bcl-2/Bax又是通過什么樣的途徑誘發(fā)凋亡的？腫瘤的生成是細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控失衡的結(jié)果，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來殺死腫瘤細(xì)胞已成為一種有效的腫瘤治療途徑。因此抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來完成。本研究通過細(xì)胞熒光染色進(jìn)一步證實(shí)不同濃度的isatin能明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察到isatin處理組細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：胞體縮小、胞質(zhì)濃縮、核染色質(zhì)聚集，并有DNA碎片。而對(duì)照組細(xì)胞無變化。

作為腫瘤抑制基因，p53主要通過激活其下游靶基因進(jìn)一步控制細(xì)胞的生長(zhǎng)與死亡[13]，其次是在細(xì)胞周期的G期監(jiān)視DNA的完整性。在依賴p53蛋白的凋亡中，p53蛋白能特異地抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，但對(duì)Bax蛋白的表達(dá)有明顯促進(jìn)作用，在這類細(xì)胞中p53蛋白的積累和活化引起了線粒體膜的去極化，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究表明，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7表達(dá)wild-p53蛋白，且通過一些抗腫瘤藥物的誘導(dǎo)，能明顯增強(qiáng)其表達(dá)量，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14,15]。課題組前期的研究認(rèn)為，Bcl-2家族蛋白中Bcl-2、Bax蛋白在isatin的抗腫瘤作用中不可或缺。isatin作用后可以導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)增加。因此推測(cè)p53可能是isatin作用Bcl-2的上游靶分子之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明isatin作用后，p53mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加。

眾所周知，Bcl-2家族蛋白存在于線粒體膜上，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。該家族蛋白的表達(dá)情況可能會(huì)影響到細(xì)胞膜電位的變化。本研究利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度isatin處理組細(xì)胞膜電位，結(jié)果顯示除對(duì)照組細(xì)胞外，其他各組細(xì)胞膜電位均出現(xiàn)不同程度下降。線粒體膜電位改變是細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期特征，在膜電位發(fā)生改變后通常會(huì)釋放一些促凋亡蛋白，像Cytochrome C，smac等。Western blot的結(jié)果顯示isatin作用后線粒體Cytochrome C表達(dá)下降，而胞質(zhì)中濃度增加。Cytochrome C等促凋亡蛋白會(huì)進(jìn)一步作用，激活下游的caspase家族，引發(fā)凋亡。依照上述的結(jié)果，我們推測(cè)caspase家族中的caspase-9會(huì)被順序激活，因此我們利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了不同組別細(xì)胞caspase-9的活化情況，結(jié)果與預(yù)想的一致，經(jīng)isatin作用后，活化的caspase-9表達(dá)增加。綜上所述，有充分的理由認(rèn)為isatin誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡可能是通過p53介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)是在青島市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科及青島大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室完成。感謝馬中良、遲曉偉及陳艷萍在實(shí)驗(yàn)過程中的協(xié)助)。

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The endogenous oxindole isatin induces apoptosis of MCF-7 breast cancer cells through a p53-mediated mitochondrial pathway

SONG Jin-lian1, MA Zhong-liang2, CHI Xiao-wei3, CHEN Yan-ping1, HOU Lin4

(1.DeptofLaboratory,theAffiliatedWomenandChildren’sHospitalofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266034,China;2.DeptofBreastSurgery,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266000,China;3.DeptofLaboratory,WomenandChildren′sCareCenterofJimo,JimoShandong266012,China;4.DeptofBiochemistry,MedicalCollege,QingdaoUniversity,QingdaoShandong266021,China)

Abstract:AimTo investigate the inducement effect of isatin on apoptosis of breast cancer cell line MCF-7, and explore its detailed mechanism. MethodsMCF-7 cell lines were exposed to isatin at different concentrations(0, 50, 100, 200 μmol·L-1) for 48 h. Apoptotic features were demonstrated by nuclei staining with Hoechst 33258. Bcl-2, Bax and p53 mRNA were analyzed by RT-PCR. Caspase-9 activation and mitochondrial depolarization were assayed by flow cytometry. Bcl-2, Bax, p53 and cytochrome c proteins were analyzed by Western blot.ResultsIsatin induces apoptosis of MCF-7 cells. Furthermore, Bcl-2 expression was decreased and the ratio of Bcl-2 to Bax was significantly decreased by isatin. While, p53 expression relatively decreased. The mitochondrial transmembrane potential was markedly reduced and the release of cytochrome c into the cytosol was increased after treatment with isatin. Simultaneously, caspase-9 was activated.ConclusionsIsatin significantly induced the apoptosis of MCF-7 cellsinvitro. These results strongly suggest that the p53 dependent mitochondrial pathway is involved in apoptosis.

Key words:isatin; human breast cancer cell; apoptosis; p53; Bcl-2; Bax; mitochondrial membrane potential

收稿日期:2016-01-02,修回日期:2016-03-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 81472542)；青島市衛(wèi)生局項(xiàng)目(No 2014WJZD135 )；青島市科技局項(xiàng)目(No 13-1-3-67-nsh)

作者簡(jiǎn)介：宋金蓮(1981-)，女，博士生，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail:songjinlian@126.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.008

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0773-06

中國(guó)圖書分類號(hào)：R329.25；R737.9；R979.1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.016.html

◇論著◇

侯琳(1962-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，通訊作者，E-mail:qdhoulin@ yahoo. com