補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方成分的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究

劉芳 楊巖濤 賀福元 劉林 吳雙 王宇紅 蔡光先

摘要：目的 比較補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方（補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片）中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。方法 將補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方灌胃頸靜脈插管大鼠，采用HPLC-DAD法同時(shí)檢測(cè)3種成分在不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，經(jīng)DAS2.0計(jì)算得單成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，再采用總量統(tǒng)計(jì)矩（相似度）法整合成整體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并進(jìn)行比較。結(jié)果 3種成分在體內(nèi)的總量統(tǒng)計(jì)參數(shù)相差甚遠(yuǎn)，而3種成分總和的統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)卻比較接近，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片在大鼠體內(nèi)AUC分別為240.6和133.0，MRT分別為3.192 min和3.259 min，VRT分別為21.59 min2和19.75 min2；補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片中3種成分總量的相似度達(dá)到0.977 8。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片在體內(nèi)代謝過(guò)程具有相似性，中藥復(fù)方發(fā)揮功效依賴于多成分的整體貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞：藥代動(dòng)力學(xué)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯；腦健片；阿魏酸；洋川芎內(nèi)酯A；藁本內(nèi)酯

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.021

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）07-0082-05

Comparative Study on Pharmacokinetics of Components of Buyang Huanwu Associated Prescriptions LIU Fang1， YANG Yan-tao1， HE Fu-yuan1， LIU Lin2， WU Shuang1， WANG Yu-hong2， 3， CAI Guang-xian3 （1. Pharmacy School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， 410007 China； 3. National Key Laboratory Co-built by Departments of Herbal Powder and New Drugs of Hunan Province， Traditional Chinese Medicine Powder Technology and Equipment of National and Local Joint Engineering Laboratory， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To study the pharmacokinetic features of ferulaic acid， senkyunolide A and ligustilide in Buyang Huanwu associated prescriptions （Buyang Huanwu Decoction and Naojian Tablets）. Methods HPLC-DAD was applied for simultaneous determination plasma concentration of three ingredients with jugular venous cannula rats after intragastric administration of Buyang Huanwu associated prescriptions. The pharmacolinetic parameters of each ingredient was calculated by DAS2.0， and then the total quantum statistical moment （TQSM） standard similarity was used to measure the overall pharmacokinetics behaviors. Results There were great differences in the three ingredients after the administration of two prescriptions， while the total quantum statistical parameters were very closely. The TQSM pharmacokinetic parameters of the three components in Buyang Huanwu Decoction and Naojian Tablets showed that AUC， MRT， VRT were 240.6 and 133.0， 3.192 min and 3.259 min， 21.59 min2 and 19.75 min2， respectively. The similarity was up to 0.977 8. Conclusion The metabolic processes in vivo of Buyang Huanwu Decoction and Naojian Tablets have similarities. The efficacy of Chinese herbal compounds mostly depends on the multi-components overall contributions.

Key words： pharmacokinetics； Buyang Huanwu Decoction； Naojian Tablets； ferulaic acid； senkyunolide A； ligustilide

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2012CB723503）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2014135）；湖南省“十二五”中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（2011年）

通訊作者：賀福元，E-mail：pharmsharking@tom.com；蔡光先，E-mail：366620183@qq.com

補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方包括補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其精簡(jiǎn)方（腦健片）。補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)·癱痿論》，由黃芪、川芎、當(dāng)歸等7味中藥組成，系清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立的治療半身不遂辨證屬氣虛血瘀證的經(jīng)典名方。腦健片處方是遵循補(bǔ)陽(yáng)還五湯之方義，秉承“益氣祛瘀生新法”，將補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)為黃芪、川芎和地龍，經(jīng)過(guò)二次開(kāi)發(fā)而成的新型制劑。本課題組前期研究表明，腦健片治療腦缺血療效顯著[1-2]，現(xiàn)進(jìn)一步對(duì)其代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，選擇補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方均含有的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯3種入血成分為檢測(cè)指標(biāo)，研究大鼠灌胃后體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化，旨在探討精簡(jiǎn)方配伍變化后其同類成分的藥物動(dòng)力學(xué)變化行為。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

補(bǔ)陽(yáng)還五湯干浸膏（黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g）和腦健片干浸膏（黃芪30 g，川芎9 g，地龍6 g）均由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥所張水寒教授提供，所有藥材質(zhì)量均符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯按傳統(tǒng)水煎法濃縮干燥后制備成干浸膏，相當(dāng)于原藥材4.5 g/g。腦健片按新工藝制備，其中川芎以揮發(fā)油量為考察指標(biāo)，對(duì)川芎粗粉進(jìn)行SFE-CO2萃取，不加夾帶劑，提取1.5 h；地龍以醇浸膏得率及氮含量為指標(biāo)，溫浸2次，第1次加5倍量50%乙醇溫浸48 h，第2次加4倍量50%乙醇溫浸48 h；再合并藥渣，與黃芪藥粉一同水煎，所有藥液濃縮干燥后即得干浸膏，相當(dāng)于原藥材4.7 g/g。

阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)MUST-12112204）、洋川芎內(nèi)酯A對(duì)照品（批號(hào)MUST-12121202）、藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)MUST- 12082702），北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；乙腈，美國(guó)Tedia公司，色譜純；甲醇，美國(guó)Tedia公司，色譜純；怡寶純凈水（華潤(rùn)怡寶飲料有限公司），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Instech自動(dòng)采血系統(tǒng)（Instech Solomon公司），離心濃縮儀（Centri Vap，LABCONCO），Agilent-1260型高效液相色譜儀，配有自動(dòng)進(jìn)樣器，四元梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，柱溫箱和二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；超聲波清洗儀（SB-3200D，寧波新其生物科技股份有限公司），分析天平（JA-3003，上海恒平科學(xué)儀器有限公司），Elipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 ?m，安捷倫公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，9～10周齡，體質(zhì)量260～300 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。室溫?zé)o菌喂養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.4 分組、給藥及處理

建立大鼠實(shí)時(shí)活體采血方法。將SD大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，切開(kāi)頸下靜脈，分離頸靜脈，埋線，待血液充盈時(shí)用眼科剪將頸靜脈剪開(kāi)一小口，插入特制PU軟管約20 mm深并固定，縫合傷口。灌胃后將插管大鼠與Instech自動(dòng)采血系統(tǒng)連接。將頸靜脈插管的健康SD大鼠分為補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和腦健片組，每組5只。二方均以4倍于人體劑量的原藥材給藥[3]，折算成干浸膏量分別為12.04 g/kg體質(zhì)量和9.64 g/kg體質(zhì)量。灌胃前采血作為空白血漿，再分別于5、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360、480 min采血0.5 mL，并取上層血漿，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 供試品溶液的制備

取藥物血漿100 μL，加0.1 mol/L鹽酸50 μL，混勻后加800 μL乙酸乙酯，渦旋震蕩5 min，8000 r/min離心10 min，取上清液；重復(fù)上述操作，合并上清液，離心濃縮儀揮干溶劑后殘?jiān)?0 μL甲醇復(fù)溶。

1.6 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱量阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對(duì)照品，用甲醇溶液制成濃度分別為0.125、0.1、2.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中阿魏酸對(duì)照品溶液中含5%乙酸，4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆茫槐緝?nèi)酯-20 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 色譜條件

本研究采用HPLC-DAD法與腦健片體外成分測(cè)定建立的方法[4]一致。色譜條件：Elipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），柱溫30 ℃；以0.3%乙酸水（A）和乙腈（C）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，15% C；5～30 min，15%～31% C；30～32 min，31%～36% C；32～82 min，36%～72% C；82～90 min，72%～95% C），流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為阿魏酸325 nm、洋川芎內(nèi)酯A 280 nm、藁本內(nèi)酯328 nm。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用DAS2.0軟件，分別獲得阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯3種成分的經(jīng)典藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，參照文獻(xiàn)[5-6]按總量統(tǒng)計(jì)矩（相似度）法計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，并進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性與專屬性考察

分別取空白血漿，加入阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液的空白血漿，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片給藥后30 min的藥物血漿樣本，處理后上樣分析，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，該方法專屬性良好。根據(jù)前期研究結(jié)果，由保留時(shí)間和紫外光譜圖確定1號(hào)峰為阿魏酸，2號(hào)峰為洋川芎內(nèi)酯A，3號(hào)峰為藁本內(nèi)酯[4]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及線性關(guān)系考察

取空白血漿100 μL，依次加入“1.6”項(xiàng)下3種對(duì)照品各20 μL，處理后上樣分析，采用程序進(jìn)樣，設(shè)定進(jìn)樣體積依次為0.05、0.1、0.2、1.0、2.5、5、15、20 μL。記錄各成分最大吸收波長(zhǎng)下的峰面積，以進(jìn)樣的絕對(duì)質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 精密度和重復(fù)性考察

將“2.2”項(xiàng)下藥物血漿連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄峰面積值，計(jì)算RSD值。結(jié)果所得血漿中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為0.85%、0.84%、1.79%，表明本法精密度良好。取5份空白血漿100 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法平行加入3種對(duì)照品溶液，處理后分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積值，計(jì)算RSD。結(jié)果表明，5份空白血漿中加入3種藥效成分，測(cè)得阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為1.50%、2.91%、3.32%，表明本法用于體內(nèi)藥物血漿測(cè)定重復(fù)性良好。

2.4 體內(nèi)加樣回收率試驗(yàn)

按高、中、低3個(gè)濃度進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)。分別取大鼠空白血漿100 μL，加入一定量的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液，配制高、中、低3個(gè)不同濃度的樣品，處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯A均具有較高的回收率，遠(yuǎn)高于生物樣品藥物回收率至少為80%的要求，說(shuō)明本研究采用離心濃縮儀揮干血漿樣品能有效避免化學(xué)成分的丟失，此法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的吹氮法。其中藁本內(nèi)酯的加樣回收率略有偏高，這可能與藁本內(nèi)酯自身化學(xué)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相關(guān)。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定

將各組血漿樣品預(yù)處理后進(jìn)樣分析，分別計(jì)算補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片給藥后阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，得各成分量-時(shí)曲線，見(jiàn)圖2。采用DAS2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理得出3種成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿魏酸在補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方灌胃大鼠后藥代動(dòng)力學(xué)行為較相似，Cmax持平，且AUC值也基本相同，但是洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征相差較大。采用總量統(tǒng)計(jì)矩法對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方中3種成分在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)繼續(xù)深入分析，計(jì)算單成分及3種成分總和的統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，見(jiàn)表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方灌胃大鼠后，3種成分在體內(nèi)的零階矩、一階矩、二階矩參數(shù)均相差較大。但是，3種成分總和的統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)卻比較接近，特別是總量的一階矩和二階矩參數(shù)非常接近，MRT值分別為3.192 min和3.259 min，VRT值分別為21.59 min2和19.75 min2，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方在體內(nèi)的代謝過(guò)程較為相似，體現(xiàn)了中藥復(fù)方發(fā)揮功效確實(shí)依賴于多成分的整體貢獻(xiàn)。

2.6 補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方單成分及總量?jī)蓛砷g藥物動(dòng)力學(xué)相似度分析

依據(jù)文獻(xiàn)[7]方法對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方中單成分及3個(gè)總成分的總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)進(jìn)行相似度分析，見(jiàn)表5。從單成分看，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片灌胃大鼠后，阿魏酸在體內(nèi)的代謝相似度僅為0.506 9，洋川芎內(nèi)酯A相似度為0.804 1，藁本內(nèi)酯為0.347 8，證實(shí)僅對(duì)1種成分進(jìn)行分析不能代表中藥復(fù)方多成分在體內(nèi)的整體代謝過(guò)程。而對(duì)3種成分總量分析則發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片在體內(nèi)代謝過(guò)程相似度達(dá)到0.977 8，說(shuō)明二方的總體功效相似。

3 討論

中藥發(fā)揮藥效往往取決于多種藥效成分的協(xié)同作用，講究君臣佐使配伍原則。采用傳統(tǒng)西藥藥代動(dòng)力學(xué)模型對(duì)中藥復(fù)方藥代參數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)同一藥效成分在不同藥效部位、不同藥材及不同配伍復(fù)方中的藥代動(dòng)力學(xué)特征均不盡相同[8-10]。本研究表明，采用房室模型對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方中單個(gè)成分分析，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征均存在較大差異，說(shuō)明處方的精簡(jiǎn)較大程度改變洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的代謝過(guò)程，這可能是由于補(bǔ)陽(yáng)還五湯與腦健片處方中其他單味藥的差異引起各有效成分相互作用而產(chǎn)生不同結(jié)果。但是，采用總量統(tǒng)計(jì)矩法對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方中3種成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)深入分析，發(fā)現(xiàn)3種成分總和統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)差異較小；進(jìn)一步對(duì)3種成分總量分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦健片在體內(nèi)代謝過(guò)程的相似度達(dá)到0.977 8，體現(xiàn)了中藥復(fù)方發(fā)揮功效依賴于多成分的整體貢獻(xiàn)。而我們前期研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方均能發(fā)揮抗腦缺血損傷功效[1-2]，且總體功效相當(dāng)，提示兩方在一定程度上有相似的代謝過(guò)程，這是否暗示兩方基本藥效物質(zhì)基礎(chǔ)類似？后續(xù)將展開(kāi)相關(guān)研究。

采用傳統(tǒng)西藥單一成分藥代動(dòng)力學(xué)模型對(duì)中藥多成分在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行評(píng)價(jià)存在一定的局限性[11]，不能充分體現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方整體成分在體內(nèi)的真實(shí)代謝過(guò)程。本研究采用總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)對(duì)經(jīng)典房室模型的藥動(dòng)參數(shù)繼續(xù)深入分析，既能反映總量藥物濃度的動(dòng)力學(xué)行為，又能與單個(gè)成分的統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)關(guān)聯(lián)，是整合多成分藥物動(dòng)力學(xué)較宜的數(shù)學(xué)處理方法，同時(shí)更能體現(xiàn)出中藥多種化學(xué)成分多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)進(jìn)行整合調(diào)節(jié)的優(yōu)越性。

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（收稿日期：2016-01-08）

（修回日期：2016-01-28；編輯：華強(qiáng)）