羅格列酮對糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞及膠原蛋白合成的影響

侯登立, 符　婷, 匡　霞, 張秀琴, 王素莉

(中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 天津, 300162)

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論著

羅格列酮對糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞及膠原蛋白合成的影響

侯登立, 符婷, 匡霞, 張秀琴, 王素莉

(中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 天津, 300162)

摘要:目的探討羅格列酮(RGZ)對糖基化終產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞(CFs)及膠原蛋白合成的影響。方法采用胰酶消化法和差速貼壁分離法獲取CFs，經(jīng)AGEs誘導(dǎo)，并給予不同濃度RGZ干預(yù)48 h, 收集培養(yǎng)上清液，應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測不同濃度RGZ對AGEs作用下的CFs增殖的影響；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測干預(yù)前后膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量。結(jié)果與AGEs 0 mg/L組比較，經(jīng)不同濃度AGEs誘導(dǎo)后，各組CFs OD490 nm值有所升高，且隨AGEs濃度的增加而呈遞增趨勢；與未干預(yù)組比較，各干預(yù)組OD490 nm值、膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量均顯著降低，且隨RGZ濃度的增加呈遞減趨勢(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論RGZ對AGEs誘導(dǎo)的CFs增殖及促進(jìn)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成作用具有明顯的抑制效應(yīng)，且抑制程度呈濃度依賴性，可有效改善心肌纖維化狀態(tài)。

關(guān)鍵詞:糖基化終產(chǎn)物; 心肌纖維化; 心肌成纖維細(xì)胞; 羅格列酮; 增殖; 膠原蛋白

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)膠原沉積及心肌纖維化[1-2]。心肌纖維化是指心肌正常組織中心肌成纖維細(xì)胞(CFs)膠原纖維大量積聚，或膠原成分改變，導(dǎo)致心肌室壁增厚、僵硬，心肌舒張功能障礙，并最終導(dǎo)致心力衰竭，是糖尿病的主要致死原因[3]。糖基化終產(chǎn)物(AGEs)與糖尿病心肌纖維化密切相關(guān)，糖尿病長期高血糖狀態(tài)促進(jìn)糖基化進(jìn)程，AGEs增多，繼而對心血管系統(tǒng)造成損害[4]。羅格列酮(RGZ)具有心血管系統(tǒng)效應(yīng)，可抑制多種器官組織纖維化，但其對于糖尿病心肌纖維化的研究較少[5-6]。本研究主要探討了RGZ對AGEs誘導(dǎo)的CFs增殖及和膠原蛋白合成的干預(yù)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料

清潔級SD大鼠乳鼠10只(1～4 d，雌雄不限)。實(shí)驗(yàn)材料包括胎牛血清(中國北京索來寶公司)，DMEM培養(yǎng)基(低糖型，Gibco公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，四氮唑藍(lán)(MTT，Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，AGEs(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所)，RGZ(美國Santa公司)，大鼠膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(上海生物科技有限公司)，恒溫振蕩器(THZ-C，中國江蘇太倉試驗(yàn)設(shè)備廠)和DV70紫外分光光度計(jì)(美國Beckman公司)等。

1.2方法

1.2.1新肌成纖維細(xì)胞的制備：于無菌條件下取新生大鼠乳鼠的心室組織，置于D-Hanks液中剪碎，加入0.06%胰蛋白酶于37℃水浴，并置于磁力攪拌器上(速率100 r/min)消化成單細(xì)胞懸液，由于CFs具有快速貼壁的特點(diǎn)，經(jīng)2次差速貼壁后，分離得到CFs。經(jīng)SABC免疫組化染色結(jié)果顯示，波形蛋白染色呈陽性，血管平滑肌肌動蛋白染色呈陰性，證實(shí)分離得到的細(xì)胞為CFs。采用體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清培養(yǎng)，至融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代，本實(shí)驗(yàn)采用2～4代的CFs。

1.2.2AGEs誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期CFs，加入25 g/L胰酶，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)CFs密度至2.5×107/L，加入96孔板中，200 μL/孔，靜置培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁、伸展。分別采用不同濃度AGEs(0、50、100和200 mg/L)共同孵育48 h，收集各組細(xì)胞和上清，重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)：干預(yù)組中加入200 mg/L AGEs誘導(dǎo)，同時(shí)加入不同濃度RGZ(0.1、1、10 mmol/L)進(jìn)行干預(yù)；未干預(yù)組以200 mg/L AGEs誘導(dǎo)，但不加RGZ干預(yù)；另設(shè)對照組，既不加AGEs誘導(dǎo)，也不加RGZ干預(yù); 48 h后，收集各組細(xì)胞和上清，重復(fù)3次。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞數(shù)量：各干預(yù)組及對照組CFs培養(yǎng)48 h后，每孔均加入10 μL MTT溶液(5 g/L), 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜，150 μL/孔，振蕩混勻后檢測OD490 nm。

1.2.5ELISA法檢測CFs培養(yǎng)液中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的含量：向已包被抗大鼠Ⅰ型膠原的96孔酶標(biāo)板中分別加入100 μL膠原蛋白Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)液或100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清，混勻，于37 ℃孵育2 h, 棄去板內(nèi)液體，洗滌5次。每孔加100 μL一抗工作液，置于37 ℃孵育1 h，棄去板內(nèi)液體，洗滌5次。每孔加100 μL酶標(biāo)二抗工作液，置于37 ℃孵育1 h, 棄去板內(nèi)液體，洗滌5次。每孔加100 μL顯色液，37 ℃避光孵育10 min，每孔加100 μL終止液終止顯色，采用酶標(biāo)儀檢測OD492 nm。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各個(gè)樣本濃度。按照同樣的方法檢測膠原蛋白Ⅲ的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1RGZ對AGEs誘導(dǎo)CFs增殖的影響

與AGEs 0 mg/L組比較，經(jīng)不同濃度AGEs誘導(dǎo)后，各組CFs OD490 nm值有所升高，且隨AGEs濃度的增加而呈遞增趨勢。見表1。與未干預(yù)組比較，各干預(yù)組OD490 nm值顯著降低，且隨RGZ濃度的增加呈遞減趨勢(P<0.05或P<0.01)。見表2。

與AGEs 0 mg/L組比較, **P<0.01;

與AGEs 50 mg/L組比較, ##P<0.01;

與AGEs 100 mg/L組比較, △△P<0.01。

與對照組比較, **P<0.01; 與AGEs 200 mg/L組比較, ##P<0.01;

與AGEs+RGZ 0.1 μmol/L組比較, △P<0.05, △△P<0.01;

與AGEs+RGZ 1 μmol/L組比較, ▲▲P<0.01。

2.2RGZ對AGEs誘導(dǎo)CFs膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成的影響

與對照組比較，未干預(yù)組及各干預(yù)組CFs培養(yǎng)上清中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量顯著升高(P<0.01)；與未干預(yù)組比較，各干預(yù)組中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量顯著降低，且隨著RGZ濃度的增大而呈遞減趨勢(P<0.05或P<0.01)。見表3。

與對照組比較, **P<0.01; 與AGEs 200 mg/L組比較, #P<0.05, ##P<0.01;

與AGEs+RGZ 0.1 μmol/L組比較, △P<0.05, △△P<0.01; 與AGEs+RGZ 1 μmol/L組比較, ▲▲P<0.01。

3討論

CFs是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，占心臟細(xì)胞的60%，是心臟的支持細(xì)胞，并可合成和分泌多種生物學(xué)活性物質(zhì)[7]。心臟中主要含有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，兩者不斷更新，其生成和降解保持動態(tài)平衡[8]。CFs過度增殖引起膠原合蛋白合成增多，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ比例失調(diào)及排列紊亂，是心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。

AGEs是一組在蛋白質(zhì)氨基與糖的醛基間非酶性糖基化反應(yīng)終產(chǎn)物的總稱，是引起血管重建的重要機(jī)制，與糖尿病心肌纖維化密切相關(guān)。持續(xù)高糖可促進(jìn)心肌間質(zhì)、微血管壁膠原蛋白發(fā)生非酶糖化，形成AGEs，AGEs積聚降低膠原蛋白降解，引起膠原蛋白交聯(lián)、沉積，微血管基底膜增厚，進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化[4]。本研究結(jié)果顯示, AGEs可誘導(dǎo)CFs增殖并促進(jìn)CFs膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成，且隨AGEs濃度的增加，其誘導(dǎo)增殖的作用逐漸增強(qiáng)，與楊蓉等[10]研究結(jié)果一致。

RGZ屬于胰島素增敏劑藥物，是人工合成的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的配體，除降糖、降壓外，還具有抗炎、抗組織器官纖維化、影響細(xì)胞增殖與分化等作用，已廣泛應(yīng)用于治療糖尿病心肌病[11-12]。RGZ與PPAR-γ結(jié)合后通過調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)抑制其下游靶基因(如轉(zhuǎn)化生長因子β、結(jié)締組織生長因子等)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗纖維化作用[13]。此外，RGZ通過降低血管緊張肽受體-1的表達(dá)，可阻斷部分血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(AgnⅡ)的促纖維化作用，從而減輕膠原聚集[14]。本研究結(jié)果顯示，RGZ對AGEs誘導(dǎo)的CFs增殖及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成具有明顯的抑制作用，且抑制作用具有濃度依賴性，與李潔等[15]報(bào)道一致。本研究中干預(yù)組CFs膠原合成雖較未干預(yù)組明顯降低，但仍顯著高于對照組，提示RGZ只能部分抑制AGE對CFs膠原蛋白合成的誘導(dǎo)作用，而并非完全阻斷，這可能與糖尿病心肌纖維化的發(fā)病原因復(fù)雜和參與因素眾多相關(guān)，需進(jìn)一步研究[16]。

綜上所述, RGZ對于AGEs誘導(dǎo)大鼠CFs增殖及促進(jìn)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成具有顯著的抑制作用，從而有效逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，保護(hù)心臟的收縮和舒張功能，延緩和阻斷心臟重構(gòu)，為防治糖尿病心肌纖維化提供了新的思路及理論依據(jù)。

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Effect of rosiglitazone on the myocardial fibroblasts and collagen synthesis in rats induced by advanced glycation end products

HOU Dengli, FU Ting, KUANG Xia, ZHANG Xiuqin, WANG Suli

(DepartmentofEndocrinology,TheAffiliatedHospitalofLogisticalCollegeofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Tianjin, 300162)

KEYWORDS:advanced glycation end products; myocardial fibrosis; myocardial fibroblasts; rosiglitazone; proliferation; collagen

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of rosiglitazone (RGZ) on the myocardial fibroblasts (CFs) and collagen synthesis in rats induced by advanced glycation end products (AGEs). MethodsCFs were obtained by using trypsin enzyme-digesting method and differential adhesion. After induction by AGEs, different concentrations of RGZ were used to intervene 48 h, and the supernate was collected and cultured. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was applied to detect the impact of different concentrations of RGZ on the proliferation of CFs under the action of AGEs, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of collagen Ⅰ and Ⅲ before and after intervention. ResultsCompared with AGEs 0 mg/L group, the value of CFs OD490 nmin each group increased, and increased gradually with the concentration of AGEs elevation after induction by different concentrations of AGEs. Compared with non-intervention group, the value of OD490 nmand contents of collagen Ⅰ and Ⅲ in each intervention group decreased significantly, and tended to reduce with the concentration of RGZ elevation (P<0.05 orP<0.01). ConclusionRGZ exerts significantly-inhibitory effects on the proliferation of CFs induced by AGEs and promotion of collagen Ⅰ and Ⅲ synthesis, and this inhibitory degree is concentration-dependent, which can effectively ameliorate the status of myocardial fibrosis.

收稿日期:2015-12-16

通信作者:王素莉, E-mail: wangslwsl@sina. com

中圖分類號:R 542.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)11-001-03

DOI:10.7619/jcmp.201611001