尖孢鐮刀菌分子檢測技術(shù)的建立與應用

伍文憲，劉勇*，黃小琴，張蕾，周西全，劉紅雨（.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，四川 成都 60066；2.農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川 成都 60066）

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尖孢鐮刀菌分子檢測技術(shù)的建立與應用

伍文憲1，2，劉勇1，2*，黃小琴1，2，張蕾1，2，周西全1，2，劉紅雨1
（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，四川 成都 610066；2.農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川 成都 610066）

尖孢鐮刀菌從形態(tài)學和分子生物學上與屬內(nèi)多種菌難于區(qū)分，為準確鑒定豆科牧草上的尖孢鐮刀菌，本研究基于尖孢鐮刀菌與其他鐮刀菌的核糖體D N A基因間間隔區(qū)IG S（intergenic spacer）序列間的差異，設(shè)計了一對特異性引物P1/P2，檢測體系可以特異地從尖孢鐮刀菌中擴增出一條1081 bp的條帶；引物P1/P2對尖孢鐮刀菌基因組D N A的檢測閾值為100 pg，對土壤中尖孢鐮刀菌分生孢子的檢測靈敏度為100個孢子/g土；同時，引物P1/P2也可以對發(fā)病牧草根部組織中尖孢鐮刀菌的存在進行特異性檢測。檢測體系可不經(jīng)過室內(nèi)病原菌的分離純化即可有效的從土壤和病株中提取的D N A進行PC R檢測鑒定，是一種快速有效的豆科牧草根腐病病原菌分子檢測技術(shù)。

根腐?。患怄哏牭毒?；基因間隔區(qū)；分子檢測

http://cyxb.lzu.edu.cn

伍文憲，劉勇，黃小琴，張蕾，周西全，劉紅雨.尖孢鐮刀菌分子檢測技術(shù)的建立與應用.草業(yè)學報，2016，25（5）：109-115.

W U W en-Xian，LIU Yong，H U A N G Xiao-Qin，Z H A N G Lei，Z H O U Xi-Q uan，LIU H ong-Y u.Establish m ent and application of rapid m olecular detection for Fusarium oxysporum.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（5）：109-115.

豆科牧草根腐病在世界各地均不同程度地發(fā)生，嚴重時往往成為牧草生產(chǎn)的限制因素［1］。由鐮刀菌引起的根腐病在我國各牧草產(chǎn)區(qū)均普遍發(fā)生，其中，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、半裸鐮刀菌（F.semitectum）等鐮刀菌更是豆科牧草根腐病的優(yōu)勢種［2-3］，這些根腐病優(yōu)勢種在土壤和病殘體上可長期存活造成危害，因此，如何及時有效地對發(fā)病初期的牧草和帶菌土壤進行快速診斷、如何快速準確地鑒定出致病鐮刀菌種類，對牧草根腐病防治至關(guān)重要［4］。

傳統(tǒng)的病原菌形態(tài)學鑒定主要是通過病菌分離、純化、回接和再分離途徑來完成，耗時費力，已經(jīng)不能滿足對植物病原鑒定的要求，而近年來隨著P C R技術(shù)和測序技術(shù)的發(fā)展，分子生物學技術(shù)為植物病原真菌的檢測、鑒定和量化提供了新的方法和手段［5］，牧草上病害的診斷和鑒定方法也正在從傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法發(fā)展到分子診斷水平。核糖體D N A（rD N A）的編碼區(qū)序列具有保守性而非編碼區(qū)變異豐富，因此，分析真菌核糖體基因是進行真菌分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的有效方法［6-7］，核糖體的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)IT S（internal transcribed spacer）已廣泛用于真菌種屬的分類鑒定研究中［8］，同時在病原菌的分子檢測技術(shù)中，大多也都是基于特異性擴增核糖體D N A內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rD N A-IT S）片段而建立的［9-10］，然而在植物病原菌分子檢測中，有些真菌rD N A-IT S序列在種間表現(xiàn)的差異性較小，導致以rD N A-IT S序列為靶標，并不能有效地對病原菌加以鑒定［11］，如小麥矮化腥黑穗病菌（Tilletiacontroversa）、小麥光腥黑粉菌（T.foetida）和小麥網(wǎng)腥黑粉菌（T.caries）之間相差不到10個堿基序列［12］，小麥印度腥黑穗病（T.indica）和黑麥草腥黑穗病菌（T.walkeri）的rD N A-IT S序列只有1個堿基的區(qū)別，西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和菜豆炭疽?。–.lindemuthianum）的rD N A-IT S序列也僅僅相差7個堿基［13-14］，筆者在豆科牧草鐮刀菌根腐病病原鑒定時也發(fā)現(xiàn)，IT S序列分析難以區(qū)分層生鐮刀菌（F.proliferatum）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），黃色鐮刀菌（F.culmorum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti）等，顯然無法通過rD N A-IT S序列設(shè)計特異性引物對這些病原菌加以區(qū)分鑒定，需要從其他途徑尋找分子檢測的靶標。

rD N A基因間間隔區(qū)IG S（intergenic spacer）具有豐度高、變異較快、在種內(nèi)不同菌株間高度保守，種間存在豐富變化等特點［15-16］，正日漸用于同屬真菌不同種間和種內(nèi)不同群體間的比較［17-19］。有關(guān)豆科牧草根腐病原菌的分子快速鑒定方法的研究并不多見，因此，本研究以不同?；图怄哏牭毒N群及其他不同種屬鐮刀菌為研究對象，采用IG S序列對比分析方法，以期通過尋找新的分子靶標IG S特殊序列實現(xiàn)對尖孢鐮刀菌進行特異性分子標記，最終建立其準確和快速的分子檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株培養(yǎng)及基因組D N A提取

供試菌株見表1，部分菌株為從四川三州、成都、新津、眉山等豆科牧草種植區(qū)分離鑒定得到，其他菌株源自實驗室保存。將供試菌株置于鋪有玻璃紙的P D A培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)4 d，小心刮取菌絲，采用E.Z.N.A..Fungal D N A Mini Kit（O M E G A真菌基因組D N A提取試劑盒）提取供試菌株的基因組D N A。

1.2 土壤中尖孢鐮刀菌D N A的提取

完全液體培養(yǎng)基培養(yǎng)尖孢鐮刀菌，待產(chǎn)孢后，將經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)后的5×107個分生孢子與1 g滅菌后的營養(yǎng)土混合，用E.Z.N.A..Soil D N A Kit（O M E G A土壤基因組D N A提取試劑盒）提取含尖孢鐮刀菌分生孢子的土壤基因組D N A，終產(chǎn)物以50μL Elution Buffer溶解（相當于濃度為106個孢子的D N A）［20］，未接孢子的滅菌營養(yǎng)土D N A作為空白對照。

1.3 發(fā)病牧草組織D N A的提取

將消毒后的由尖孢鐮刀菌引起的根腐苜蓿（Medicagosativa）病株置于液氮預冷的研缽中，研磨成粉狀后轉(zhuǎn)移至2.0 m L的Eppendorf管中，用E.Z.N.A..Plant D N A Kit（O M E G A植物組織基因組D N A提取試劑盒）提取植物病株基因組D N A，用本方法提取健康苜蓿植株組織D N A作為空白對照，而以接種銳頂鐮刀菌引起的根腐苜蓿病株作為負對照。

1.4 尖孢鐮刀菌特異性引物設(shè)計及PCR擴增

于2014年10－12月，對GenBank（http://w w w.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）及Fusarium-ID（http://isolate.fusariu m db.org/wizard.php？a＝db2）中不同專化型的尖孢鐮刀菌種群及其他不同種屬鐮刀菌共計76株菌株的IG S序列經(jīng)D N A M A N及M E G A6軟件進行對比分析，使用Prim er 5設(shè)計了一對特異性引物P1/P2：P1，5′-C A G G G T A G G C A G C T T A G A T T T G G-3′，P2，5′-G A C G G A T T T G G C G A A C C T A C C C T-3′，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，并于2015年1月至3月對該特異性引物進行驗證分析，重復試驗共計7次。

P C R反應體系總體積為20μL：10μL 2×supermix（購自北京全式金生物技術(shù)公司），引物P1/P2（10 μm ol/L）各0.5μL，1μL模板D N A（50 ng/μL），滅菌水補足到總體積，在BIO-R A D T100T MP C R擴增儀進行擴增反應，其反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。取全部擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀上檢測。

1.5 PCR擴增靈敏度檢測

將尖孢鐮刀菌D N A濃度從50 ng/μL依次稀釋為25 ng/μL，10 ng/μL，5 ng/μL，1 ng/μL，500 pg/μL，100 pg/μL和50 pg/μL共8個梯度，分別取1μL為模板進行P C R反應，反應體系及程序與1.4所述一致。

1.6 土壤中尖孢鐮刀菌檢測閾值的確定

將土壤中尖孢鐮刀菌D N A濃度從106個孢子/μL依次梯度稀釋10倍至1個孢子/μL，分別取1μL為模板進行P C R反應，反應體系和擴增程序如1.4所述。

1.7 發(fā)病植株組織的快速檢測

以接種尖鐮孢菌、銳頂鐮刀菌的發(fā)病組織和健康植株組織中提取的基因組D N A為模板進行常規(guī)P C R反應，反應體系和擴增程序如1.4所述，終產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后成像檢測。

表1 特異性引物P1/P2對供試菌株的驗證Table 1 Isolate of different fungi used to screen the primer specificity in the study

2 結(jié)果與分析

對GenBank和Fusarium-ID中不同?；偷募怄哏牭毒N群及其他不同種屬鐮刀菌的IG S序列對比分析，發(fā)現(xiàn)下游有一處約1100 bp左右區(qū)段的序列在不同?；偷募怄哏牭毒叨缺Ｊ兀谄渌牭毒N群間則保守型較差（圖1），根據(jù)該段特異性堿基序列設(shè)計了一對引物P1/P2，對供試病原菌共23個菌株的基因組D N A進行了P C R擴增，結(jié)果顯示該對引物只能從尖孢鐮刀菌中特異性地擴增出一條1081 bp左右的條帶，而其他供試菌株及空白對照均無擴增條帶（圖2），表明該引物是尖孢鐮刀菌種群特異性引物，可用于尖孢鐮刀菌的分子鑒定及分子檢測。

圖1 不同?；图怄哏牭毒g及與其他部分鐮刀菌IGS序列對比情況Fig.1 Sequence align ment of different biotypes F.oxysporum and some of other Fusarium spp.IGS sequences

圖2 特異性引物P1/P2PC R擴增供試菌株基因組D N A瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PC R amplified products with the specific primers P1/P2

2.2 P1/P2對尖孢鐮刀菌靈敏度檢測

常規(guī)P C R結(jié)果顯示，特異性引物P1/P2可穩(wěn)定的從100 pg/μL的尖孢鐮刀菌基因組D N A模板中擴增得到一條1081 bp左右的條帶，而對土壤中病原菌的檢測實驗為，在孢子濃度為100個孢子/g土時，能清晰得到特異性條帶（圖3）。以上結(jié)果表明，引物P1/P2對尖孢鐮刀菌基因組D N A的檢測靈敏度為100 pg/μL，對土壤中病菌孢子的檢出閾值為100個孢子/g土。

2.3 發(fā)病植物組織的快速檢測

對接種F.oxysporum后發(fā)病的苜蓿根部組織的基因組D N A進行常規(guī)P C R擴增，該樣品能擴增出1081 bp的特異性條帶，而接種F.acuminatum發(fā)病的苜蓿根組織及健康苜蓿植株基因組D N A均不能擴增得到該條帶（圖4），說明P1/P2能用于尖孢鐮刀菌引起的病害進行快速分子檢測。

圖3 引物P1/P2對尖孢鐮刀菌基因組D N A及孢子靈敏度檢測的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Sensitivity detection of PC R amplified F.oxysporum genome D N A with the specific primers P1/P2

圖4 應用P1/P2引物對發(fā)病及健康苜蓿根組織基因組D N A擴增的凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PC R amplified products provided by diseased alfalfa DNA with specific primers P1/P2

3 討論與結(jié)論

核糖體D N A（rD N A）基因間間隔區(qū)（IG S）位于rD N A基因18S、5.8S、26S rD N A基因相鄰的兩個重復單元之間［21］。IG S序列是目前研究報道中進化速率最快的序列，已有的報道表明IG S序列的進化速率比IT S序列要快，在研究系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中，IG S序列提供的信息位點是最多的，比IT S多30%以上［22-26］，這就為將IG S序列分析應用于微生物種類鑒定與群落分析提供了理論基礎(chǔ)。梁宏等［16］利用rD N A-IG S在屬內(nèi)種間序列差異將腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌加以鑒定，王永強等［15］甚至利用rD N A-IG S序列對中國不同地理來源的稻曲病菌加以區(qū)分歸類。本研究以IG S序列為分子靶標，對不同?；偷募怄哏牭毒推渌鹉敛莞〉溺牭毒腎G S序列進行了比較分析，設(shè)計了對尖孢鐮刀菌基因組D N A具有高度特異性的引物P1/P2，建立了一套高效、快速、穩(wěn)定的檢測尖鐮孢根腐病的分子檢測體系，該體系對不同專化型的尖孢鐮刀菌的菌株均能擴增出特異性條帶，而屬內(nèi)其他鐮刀菌無條帶或無特異性條帶。本研究建立的檢測體系適用范圍廣，適用于尖孢鐮刀菌不同?；偷奶禺愋詸z測以及尖孢鐮刀菌與其他鐮刀菌的區(qū)別鑒定，同時，基于IG S序列建立的檢測體系對于發(fā)掘其他病原菌檢測新靶標提供新思路。

王健生等［4］基于甾醇14α-去甲基化酶基因（C Y P51 C）也設(shè)計了一對特異性鑒定尖孢鐮刀菌的引物，但本研究相較他們的優(yōu)點在于，rD N A-IG S在基因組中的豐度高，意味著其檢測閾值較低，本研究表明檢測體系對尖孢鐮刀菌基因組D N A檢測的靈敏度為100 pg/μL，同時操作非常簡單，僅需要一次常規(guī)的P C R就能得到穩(wěn)定的實驗效果，這為根腐病尖孢鐮刀菌的快速診斷并為之進行應急防控提供了可能。

由于該引物P1/P2還能針對土壤和發(fā)病植株特異性的鑒定出尖孢鐮刀菌，因此本研究可以不經(jīng)過室內(nèi)病原菌的分離純化即可快速有效的從土壤和病株中提取的D N A進行P C R檢測鑒定，這對豆科牧草根腐病尖孢鐮刀菌的實時監(jiān)測和前期預警具有重要作用。

在海上人命救助中，對人命進行救助的主體并不單單是海上搜救責任區(qū)的締約國，還有可能來自于參與救助的人道主義救援國。當人道主義救援國進入到其他國家之間所形成的搜救責任區(qū)時，責任區(qū)域內(nèi)的締約國會對人道主義救援國的救助行為進行統(tǒng)一的指揮與協(xié)調(diào)，以保障其救助活動能夠助力于搜救責任區(qū)內(nèi)的締約國。在這種情形下，協(xié)調(diào)權(quán)就會存在于海上搜救責任區(qū)的締約國與人道主義救援國之間，從而使道義論成為協(xié)調(diào)權(quán)的權(quán)源。在現(xiàn)代海上救助活動中，不宜苛求或死板地按照公約或協(xié)定作為協(xié)調(diào)權(quán)行使的唯一來源，這種基于道義而產(chǎn)生協(xié)調(diào)關(guān)系在海上救助活動中應該給予相應的支持和鼓勵。

References：

［1］Nan Z B.Legu minous forage root rot.Grassland and Turf，1991，（2）：5-11.

［2］Li M Q.Studies on Pathogens and Resistance to Crow n and Root Rotin Alfalfa［D］.Lanzhou：Gansu A gricultural U niversity，2002.

［3］Li X L，Li Y Z.Research advances in biological control of soil-borne disease.Acta Prataculturae Sinica，2015，24（3）：204-212.

［4］W ang J S，W ang J M，Li X，etal.Rapid m olecular detection of Fusarium oxysporum by PC R.Acta Phytopathologica Sinica，2013，43（3）：318-322.

［5］Zhang S M，Li J，W ang Y X，etal.A dvances in m olecular diagnosis of plant fungal pathogens.Journal of A nhui A gricultural Science，2010，38（2）：597-599.

［6］Bruns T D，Taylor J W.Fungal m olecular Syste m atics.A nnual Review of Ecology & Syste m atics，2003，22（1）：525-564.

［7］Jacques G，Jacqueline J，Jean F L，et al.Phylogeny of so m e Fusarium species，as determined by large-subunit rR N A sequence co m parison.M olecular Biology & Evolution，1989，6（3）：227-242.

［8］Bai L Y.Study on Pathogen Identification and M olecular Detection Technology of Soybean Root Rot［D］.Uru m qi：Xinjiang A gricultural U niversity，2009.

［9］Zhao J.A pplication of rD N A IT S sequences in m olecular detection plant fungous disease.Journal of Shanxi A gricultural Science，2004，（4）：35-37.

［10］Innis M A.PC R Protocols：a Guide to M ethods and A pplications［M］.PC R Protocols：A Guide to M ethods & A pplications.Acade mic Press，1990.

［11］Tooley P W，Carras M M，F(xiàn)alkenstein K F.Relationships a m ong group IV phytophthora species inferred by restriction analysis of the IT S2 region.Journal of Phytopathology，1996，144（7-8）：363-369.

［12］Liang H，Zhang G Z，Chen W Q，etal.Sequence analysis of rD N A-IT S of Tilletiacontroversa and its related species.Acta Phytopathologica Sinica，2005，35（6）：181-183.

［13］Tang J H，W ang W，W ang Y C.M olecular detection of Colletotrichum orbiculare.Scientia Agricultura Sinica，2006，39（10）：2028-2035.

［14］Yi J P，Peng J H.The advances in research m ethods of Tilletiaindica Mitra.Plant Q uarantine，2002，16（2）：95-97.

［15］W ang Y Q，F(xiàn)an R H，Liu B，etal.Preliminary analysis of rD N A-IG S of Ustilaginoidea virens isolates fro m different geographical regions in China.Acta Phytopathologica Sinica，2010，40（2）：214-216.

［16］Liang H，Peng Y L，Zhang G Z，etal.A m plification and sequence analysis of the rD N A intergenic spacer（rD N A-IG S）fro m three Tilletia species.Acta Phytopathologica Sinica，2006，36（5）：407-412.

［17］Mitchell J I，Roberts P J，M oss S T.Sequence or structure？A short review on the application of nucleic acid sequence inform ation to fungal taxono m y.M ycologist，1995，9：67-75.

［18］Sugita T，Ikeda R，Shinoda T.Diversity a m ong strains of Cryptococcusneoformans var.gattii as revealed by a sequence analysis of m ultiple genes and a che m otype analysis of capsular polysaccharide.Microbiology & Im m unology，2001，45（11）：757-768.

［19］Takeshi S，Norio T，Takao S.Characterization of subrepeat regions within rD N A intergenic spacers of the edible basidio m ycete Lentinula edodes.Bioscience Biotechnology & Bioche mistry，2002，66（10）：2125-2133.

［20］W ang J S.Rapid M olecular Detection and Genetic Diversity of Fusarium oxysporum and Identification of Resistance to Soybean Fusarium Wilt［D］.Nanjing：Nanjing A gricultural U niversity，2012.

［21］W ang C Y，Guo B L.The characteristics of the frequently used nuclear riboso m e gene spacers and their utilization in phylogenetic study of plants.Journal of W uhan Botanical Research，2008，26（4）：417-423.

［22］Vander S J，M arant S，Volckaert G.M olecular characterization and phylogenetic utility of the rD N A external transcribed spacer region in Stylosanthes（Fabaceae）.Theoretical & A pplied Genetics，2003，107（2）：291-298.

［23］Acevedo-Rosas R，Ca m eron K，Sosa V，etal.A m olecular phylogenetic study of Graptopetalum（Crassulaceae）based on E T S，IT S，R PL16，and T R N L-F nucleotide sequences.A m erican Journal of Botany，2004，91（7）：1099-1104.

［24］M arkos S，Bald win B G.Higher-level relationships and m ajor lineages of Lessingia（Co m positae，Astereae）based on nuclear rD N A internal and external transcribed Spacer（IT S and E T S）sequences.Willdenowia，2009，26（1）：168-183.

［25］H oggard G D，Kores P J，M olvray M，etal.The phylogeny of Gaura（O nagraceae）based on IT S，E T S，and trnL-F se-quence data.A m erican Journal of Botany，2004，91（1）：139-148.

［26］Linder C R.The co m plete external transcribed spacer of 18S-26S rD N A：a m plification and phylogenetic utility at low taxono mic levels in asteraceae and closely allied fa milies.M olecular Phylogenetics & Evolution，2000，14（2）：285-303.

［1］南志標.豆科牧草根腐病.國外畜牧學－草原與草坪，1991，（2）：5-11.

［2］李敏權(quán).苜蓿根和根頸腐爛病的病原及種質(zhì)抗病性研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2002.

［3］李興龍，李彥忠.土傳病害生物防治研究進展.草業(yè)學報，2015，24（3）：204-212.

［4］王健生，王佳妹，李瀟，等.尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）的快速分子檢測.植物病理學報，2013，43（3）：318-322.

［5］張淑梅，李晶，王玉霞，等.植物病原真菌分子診斷技術(shù)研究進展.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（2）：597-599.

［8］白麗艷.大豆根腐病病原種類鑒定及分子檢測技術(shù)研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2009.

［9］趙杰.IT S序列分析及其在植物真菌病害分子檢測中的應用.陜西農(nóng)業(yè)科學，2004，（4）：35-37.

［12］梁宏，張國珍，陳萬權(quán)，等.小麥矮腥黑穗病菌與其近緣種的rD N A-IT S序列分析.植物病理學報，2005，35（6）：181-183.

［13］唐建輝，王偉，王源超.西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子檢測.中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39（10）：2028-2035.

［14］易建平，彭金火.小麥印度腥黑穗病菌鑒定方法的新進展.植物檢疫，2002，16（2）：95-97.

［15］王永強，樊榮輝，劉兵，等.中國不同地理來源稻曲病菌rD N A-IG S的初步分析.植物病理學報，2010，40（2）：214-216.

［16］梁宏，彭友良，張國珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rD N A-IG S區(qū)的擴增及其序列分析.植物病理學報，2006，36（5）：407-412.

［20］王健生.大豆尖鐮孢菌的快速分子檢測與遺傳多樣性分析及品種抗性研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2012.

［21］王川易，郭寶林.植物核基因組核糖體基因間隔區(qū)序列的結(jié)構(gòu)特點及其在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應用.武漢植物學研究，2008，26（4）：417-423.

Establish ment and application of rapid molecular detection for Fusarium oxysporum

W U W en-Xian1，2，LIU Y ong1，2*，H U A N G Xiao-Qin1，2，Z H A N G Lei1，2，Z H O U Xi-Q uan1，2，LIU H ong-Y u1
1.Instituteof Plant Protection，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2.Key Laboratory of Integrated Pest Managementin Southwest Agriculture Crops of Ministry of Agriculture，Chengdu 610066，China

It is difficult to distinguish Fusarium oxysporum fro m other Fusarium species using traditional m orphological observations or m olecular analysis based on rD N A－IT S sequencing.In order to accurately identify F.oxysporumin legu m es，a pair of prim ers na m ed P1/P2was designed based on differences in riboso m al D N A intergenic spacer（rD N A－IG S）sequences of the Fusarium genus，w hich can be used to a m plify D N A fro m F.oxysporum by conventional P C R.M ore than 23 species of root rot pathogens were used to verify the specificity of the prim ers.P1/P2could a m plify a unique 1081 bp sequence fro m different biotypes of F.oxysporum w hile it could not a m plify fro m other root rot pathogens.T he sensitivity of P1/P2was 100 pg for geno mic D N A and 100 conidia/g soil for the root rot pathogens.Furtherm ore，this pair of prim ers could directly a m plify sequences fro m the geno mic D N A of F.oxysporum diseased plant sa m ples without pathogen isolation，indicating that this is a rapid and effective legu m e root rot pathogen detection technology.

root rot；Fusarium oxysporum；riboso m al D N A intergenic spacer；m olecular detection

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10.11686/cyxb2015335

2015-07-07；改回日期：2015-09-30

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)計劃和草地病害防治技術(shù)研究與示范（201303057）資助。

伍文憲（1988-），男，江西安福人，研究實習員，碩士。E-m ail：w u wenxian07640134＠163.com