紫花苜蓿不同品種對擬枝孢鐮刀菌的抗性評價

潘龍其，張麗，田進(jìn)山，袁慶華*，王瑜，苗麗宏（.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 0093；.宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北 宜昌 443004）

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紫花苜蓿不同品種對擬枝孢鐮刀菌的抗性評價

潘龍其1，2，張麗1，田進(jìn)山2，袁慶華1*，王瑜1，苗麗宏1
（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北 宜昌 443004）

在溫室盆栽30個紫花苜蓿品種45 d后，將擬枝孢鐮刀菌接種于幼苗根部土壤中，10 d根據(jù)根部病情指數(shù)評定抗病性，篩選抗性后選擇抗病和感病品種再次接種，于4，8和12 h時測定與抗性相關(guān)酶的活性。結(jié)果表明，不同品種間抗性差異顯著，其中耐病品種為晉南苜蓿、馴鹿、P G塞特、蘇聯(lián)二號4個，占測定品種總數(shù)的13.3%；高感品種為新疆大葉、中苜一號、隴中苜蓿、北疆苜蓿、皇冠、甘肅苜蓿和薩蘭斯7個，占23.3%；其余的均為感病品種，占63.4%；未發(fā)現(xiàn)抗病和免疫品種。酶活性變化測定表明，對于接菌與未接菌的供試耐病和高感苜蓿品種，不同品種間C A T、S O D、P A L的活性存在一定差異；總體接菌植株的酶活性高于對照，且耐病品種的酶活性高于感病品種，酶活性在接菌后4～8 d呈上升趨勢，8～12 d呈下降趨勢；接菌植株C A T活性較對照增幅明顯，S O D、P A L活性較其對照增幅不明顯。

擬枝孢鐮刀菌；抗性評價；酶活測定

http://cyxb.lzu.edu.cn

潘龍其，張麗，田進(jìn)山，袁慶華，王瑜，苗麗宏.紫花苜蓿不同品種對擬枝孢鐮刀菌的抗性評價.草業(yè)學(xué)報，2016，25（5）：95-101.

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紫花苜蓿（Medicagosativa）是一次種植多年利用的豆科牧草，也是家畜的主要蛋白飼料［1］，素有“牧草之王”之稱［2］，同時對維持生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)的平衡和功能恢復(fù)發(fā)揮重要的作用［3］。隨著氣候的變化和紫花苜蓿種植面積的擴大，苜蓿病害的分布更廣泛，為害有加重的趨勢［4］，其中紫花苜蓿根腐病是主要的根部病害，在苜蓿種植區(qū)普遍發(fā)生，屬世界性病害［5］。不僅降低了苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)使其喪失利用的價值，而且制約著苜蓿的栽培和生產(chǎn)［6］。因此，該病害的研究對于其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展有重大意義。關(guān)于該病國內(nèi)外學(xué)者Corm ack［7］、H aw n［8］、T urner 和Alfew［9］與李敏權(quán)等［10］進(jìn)行了大量研究，一致認(rèn)為苜蓿根腐病病原較為復(fù)雜，但大多與鐮刀菌有關(guān)。

目前防治苜蓿根腐病的主要措施是篩選抗病品種。Michand和Bai［11］利用人工接種來篩選抗病苜蓿品種，利用雜交來提高苜蓿品種的抗病性。李敏權(quán)［12］利用試管苗人工接種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminaturn）和半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）對20個苜蓿品種進(jìn)行抗性測定，得知不同苜蓿品種對根腐病的抗性存在一定差異。鄧蓉等［13］利用活體接種成熟孢囊的苜蓿根腐病葉片對19個苜蓿品種進(jìn)行了抗病性測定，篩選出4個免疫品種和7個高抗品種。劉海波［14］利用病原菌毒素篩選出抗根腐病苜蓿品種。另外，鄧蓉等［15］對紫花苜蓿根腐病植株體內(nèi)的過氧化物酶（P O D）活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)接種后植株體內(nèi)P O D活性有所提高，并且抗病性差的品種P O D活性增幅最大。國內(nèi)外學(xué)者對于紫花苜蓿根腐病的研究重點在于病原，雖說在抗病苜蓿品種篩選、育種和對其的防治方面進(jìn)行了不少研究，但至今還未培育出抗病品種。另外，在田間苜蓿根腐病的防治上，采用化學(xué)防治無法達(dá)到預(yù)期效果，所以選育抗病品種來防治苜蓿根腐病是比較有效的方法。本研究采用溫室盆栽法對30個品種進(jìn)行根腐病的抗病性測定，耐病和高感苜蓿品種中C A T、S O D和P A L活性進(jìn)行測定，以期為栽培區(qū)的合理種植和種質(zhì)資源抗病性評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試苜蓿品種

30個紫花苜蓿品種種子及來源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源室提供（表1）。

1.2 供試病原菌

供試菌株為擬枝孢鐮刀菌［16］（Fusarium sporotrichioides）B Y E27-2-5，該菌株2013年從內(nèi)蒙古阿魯科爾沁旗巴雅爾草業(yè)基地苜蓿上分離得到，菌株純化于PS A平板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抗病性測定方法

1.3.1 育苗 種子用0.1%升汞消毒后置于無菌的培養(yǎng)皿中2 d，萌發(fā)后移栽至裝有無菌的沙壤土和草炭（比例2∶1）的塑料花盆（直徑為15 c m）中，每處理3盆，每盆10株。溫室育苗45 d后進(jìn)行接菌。

1.3.2 接種 將擬枝孢鐮刀菌的孢子懸浮液（無菌水配制濃度為1×106個/m L）制成米粒接種體［16］，25℃黑暗培養(yǎng)4 d，室溫條件下，用無菌解剖刀垂直插入花盆中苜蓿幼苗周圍1 c m處的滅菌土壤，制造出寬0.5 c m左右的空隙，將米粒接種體均勻的分散于其中（10粒/株），覆滅菌土壤5 m m，每品種3次重復(fù)。10 d后，對根部進(jìn)行病情分級調(diào)查并劃分反應(yīng)型。

1.3.3 根部病情分級及反應(yīng)型劃分標(biāo)準(zhǔn) 根部病情共分5級（圖1），分級標(biāo)準(zhǔn)為，0級：健康無病；1級：1/3初生根尖出現(xiàn)壞死斑點，不腐軟；2級：1/3～1/2初生根尖出現(xiàn)變色腐爛，不腐軟；3級：1/2～3/4根尖出現(xiàn)腐爛和變軟；4級：3/4以上根部腐爛和變軟。

圖1 苜蓿根腐病病情分級標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Classification standard of alfalfa root rot

根部病情反應(yīng)型劃分標(biāo)準(zhǔn)為，免疫（I）：病情指數(shù)＝0；抗?。≧）：病情指數(shù)＝0.1～20.0；耐病（T）：病情指數(shù)＝20.1～40.0；感病（S）：病情指數(shù)＝40.1～60.0；高感（S H）：病情指數(shù)＞60.0。

1.4 酶活性測定方法

1.4.1 育苗與接種 在1.3抗病測定的基礎(chǔ)上篩選出3個高感品種和3個耐病品種按1.3.1溫室育苗15 d后按1.3.2進(jìn)行病原菌的接種，每處理3次重復(fù)。

1.4.2 采樣 分別于接種后的4，8，12 d，拔出苜蓿幼苗，用無菌水將根莖部沖洗干凈，濾紙吸干，每處理稱取根莖部0.5 g，3次重復(fù)，裝入塑料袋，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 過氧化氫酶（catalase form micrococous lysodeikticus，C A T）活性測定 C A T活性測定參照王學(xué)奎［17］的方法。

1.4.4 超氧化物歧化酶（superoxide dis m utase，S O D）活性測定 酶液提取參考王學(xué)奎［17］的方法。

反應(yīng)體系（3 m L）：粗酶液0.05 m L；130 m m ol/L甲硫氨酸（M et）溶液0.3 m L；0.05 m ol/L磷酸緩沖液1.5 m L；750μm ol/L氮藍(lán)四唑（N B T）溶液0.3 m L；100μm ol/L E D T A-Na2溶液0.3 m L，20μm ol/L核黃素0.3 m L；蒸餾水0.25 m L。處理置于4000 lx日光條件下反應(yīng)20 min，以緩沖液代替酶液置于暗處為對照。分別測定其在560 n m處的吸光度。以抑制N B T光化還原的50%為一個酶活性單位（U/g），按如下公式計算酶活性。

式中，AC K為對照的吸光值，AE為待測樣品的吸光值，V為樣液總體積（m L），Vt為測定樣品的體積（m L），W為樣品鮮重（g）。

1.4.5 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin a m m o-nialyase，P A L）活性測定 P A L活性測定參照陳建隕和王曉峰［18］的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

使用Excel 2010、D PS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同苜蓿品種對擬枝孢鐮刀菌的抗性比較

從表1中可以看出，不同紫花苜蓿品種對擬枝孢鐮刀菌的抗性存在較大差異（P＜0.05）。供試的30個品種的病情指數(shù)在30.67～64.67范圍內(nèi)。4個品種的病情指數(shù)＜40.0，占試驗總數(shù)的13.3%；26個品種病情指數(shù)＞40.0，占試驗總數(shù)的86.7%。30個紫花苜蓿品種根據(jù)病情反應(yīng)型可以劃分為5個抗病類型，其中耐病品種（T）4個：晉南苜蓿、馴鹿、P G塞特和蘇聯(lián)二號；感病品種（S）19個，主要有敖漢苜蓿、游客、普羅旺斯、維多利亞、青海苜蓿和察南苜蓿等；高感品種（S H）7個，新疆大葉、中苜一號、隴中苜蓿、北疆苜蓿、皇冠、甘肅苜蓿和薩蘭斯，未發(fā)現(xiàn)抗病和免疫品種。其中蘇聯(lián)二號和P G塞特的病情指數(shù)相對較低，分別為30.67和32.67，這兩個品種可作為紫花苜?？垢〉闹饕N材料，而新疆大葉病情指數(shù)最高，為典型的感病材料，不建議該品種在紫花苜蓿根腐病的高發(fā)地區(qū)種植（表1）。

2.2 過氧化氫酶活性的變化

由表2可知，6個品種間C A T的活性在接菌后4～8 d呈上升趨勢，8～12 d呈下降趨勢。在整個采樣時間內(nèi)接種植株的酶活性較對照增幅較為明顯，4 d后不同品種苜蓿C A T活性較對照的增幅在45.67%～111.08%之間；8 d后較對照的增幅在34.54%～120.33%之間；12 d后較對照的增幅在52.29%～99.87%之間，其中耐病品種蘇聯(lián)二號苜蓿接菌后8 d增幅最大，為120.33%。該結(jié)果表明，接種與未接種擬枝孢鐮刀菌的供試苜蓿品種，不同品種之間的C A T活性存在一定的差異?？傮w來看，抗病品種的C A T活性高于感病品種，處理組苜蓿植株體內(nèi)的C A T活性高于對照組。

表1 30個苜蓿品種對擬枝孢鐮刀菌根腐病的抗性評價Table 1 Evaluation of thirty alfalfa cultivars resistance to alfalfa root rot of F.sporotrichioides

2.3 超氧化物歧化酶活性的變化

由表3可以看出，各品種S O D活性在接菌后4～8 d呈緩慢上升趨勢，8～12 d呈緩慢下降趨勢。在整個采樣時間內(nèi)各接菌組較對照增幅不明顯，4 d后不同品種苜蓿S O D活性較對照的增幅在6.06%～48.38%之間；8 d后較對照增幅在－2.17%～40.48%之間；12 d后較對照增幅在6.45%～33.34%之間，其中感病品種隴中苜蓿接菌處理4 d后增幅最大，為48.38%。該結(jié)果說明，接菌與未接菌的苜蓿品種之間S O D活性存在顯著的差異，且抗病苜蓿品種的S O D活性高于感病品種，接菌苜蓿植株體內(nèi)的S O D活性高于對照組。

2.4 苯丙氨酸解氨酶活性的變化

從表4中可知，在整個采樣時間內(nèi)接菌苜蓿植株體內(nèi)P A L活性高于對照組，但接菌處理較對照增幅不明顯，4 d后不同品種苜蓿P A L活性較對照增幅在13.61%～31.20%之間；8 d后較對照增幅在7.90%～28.77%之間；12 d后較對照增幅在1.46%～37.45%之間，其中耐病品種P G塞特接種擬枝孢鐮刀菌12 d后增幅最大，為31.20%。供試品種接菌與未接菌的P A L活性存在一定差異，但不同品種之間P A L活性的差異不明顯。綜合來看，抗病苜蓿品種體內(nèi)的P A L活性高于感病品種，各品種間P A L的活性在接菌后4～8 d呈緩慢上升趨勢，8～12 d呈緩慢下降趨勢。

表2 接種擬枝孢鐮刀菌后不同時間C A T活性變化Table 2 Change of C A T activity in different times after inoculated with F.sporotrichioides　U/（g·min）

表3 接種擬枝孢鐮刀菌后不同時間SO D活性變化Table 3 Change of SO D activity in different times after inoculated with F.sporotrichioides　U/g

表4 接種擬枝孢鐮刀菌后不同時間P A L活性變化Table 4 Change of P A L activity in different times after inoculated with F.sporotrichioides　U/g

3 結(jié)論與討論

本試驗對30個不同苜蓿品種在溫室條件下通過人工接種擬枝孢鐮刀菌進(jìn)行了苗期抗病性測定，結(jié)果表明不同苜蓿品種間抗病性差異顯著。蘇聯(lián)二號和P G塞特具有較低的病情指數(shù)，可作為抗根腐病的主要育種材料，而新疆大葉為典型的感病材料，不建議在該病的高發(fā)地區(qū)種植。到目前為止，我國還沒有培育出抗苜蓿根腐病的品種，通常都是從已有的苜蓿品種中篩選出抗病性較強的品種［19］。本試驗是在溫室條件下對不同品種苜蓿幼苗人工接種擬枝孢鐮刀菌進(jìn)行抗病性研究。雖然筆者盡可能提供了與自然發(fā)病相一致的環(huán)境條件，但溫室條件、人工接種更宜于發(fā)病，且米粒接種體的帶菌量較大，使得各品種的病情指數(shù)均偏高，因而使得在大田生產(chǎn)上抗病較好的苜蓿品種在試驗中抗病效果并不理想。試驗條件下感病的品種，在自然條件下可能為抗病品種，該結(jié)論與丁守彥［20］研究所得出的結(jié)論相一致。

酶活性測定試驗表明，供試的3個耐病和3個高感苜蓿品種在人工接種擬枝孢鐮刀菌后，植株體內(nèi)的C A T、S O D、P A L活性存在一定的差異。C A T活性接菌處理較其對照增幅較為明顯，S O D、P A L的酶活性接菌處理較其對照增幅變化不大。C A T在植物代謝過程中能清除活性自由基（A O S），試驗表明，接種擬枝孢鐮刀菌的苜蓿體內(nèi)C A T活性上升，清除其體細(xì)胞內(nèi)的活性氧，使植株保持正常水平，植物免受侵害。另外，植株體內(nèi)S O D活性增強利于其形成抗體，試驗表明，接種擬枝孢鐮刀菌的植株體內(nèi)S O D活性大幅提升，增加植株的抗逆性。目前通過測定苜蓿體內(nèi)的P A L活性來確定其抗病性的研究甚少，尤其由鐮刀菌引起的根腐病，本試驗得知苜蓿根部的P A L活性在接種后與未接種之間存在差異，品種間也存在一定的差異，這一結(jié)論與李敏權(quán)［21］的研究結(jié)果相同。

近年來，國內(nèi)許多學(xué)者嘗試通過苜蓿體內(nèi)P A L［22］、S O D、P O D、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和多酚氧化酶（PP O）的活性來測定其抗根腐病的能力［16，23］，但其實用性和可靠性有待進(jìn)一步研究。王敬文和薛應(yīng)龍［24］分別研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯（Solanum tuberosum）、玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、黃瓜（Cucumissativus）和水稻（Oryzasativa）等作物感染病原菌后幾種酶活力升高都表現(xiàn)出有規(guī)律的動態(tài)變化，且致病菌對酶活性升高的刺激作用大于非致病菌。但也有完全相反的結(jié)論［25］。關(guān)于以上3種酶活性在苜蓿接種擬枝孢鐮刀菌菌株后的變化情況有待進(jìn)一步試驗校正。

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Resistance evaluation of different alfalfa varieties to Fusarium sporotrichioides

P A N Long-Qi1，2，Z H A N G Li1，TIA N Jin-Shan2，Y U A N Qing-H ua1*，W A N G Y u1，M IA O Li-H ong1
1.Institute of Animal Science of CA AS，Beijing 100193，China；2.Yichang Academy of Agricultural Sciences，Yichang 443004，China

T he present study evaluated the resistance of 30 alfalfa varieties to Fusarium sporotrichioides by inoculation of 45 d old seedlings in a greenhouse.Resistant and susceptible varieties were selected based on the root disease index after 10 days of inoculation and were further evaluated by inoculation pathogen and m easuring enzy m es activities after 4，8 and 12 hours inoculation.T he results showed that there were four resistant varieties：Jinnan，Xunlu，P G Saite and Sulian N o.2，w hich together accounted for 13.3%.T here were seven highly sensitive varieties：Xinjiangdaye，Zhong m u N o.1，Longzhong，Beijiang，H uangguan，Gansu and Salansi，w hich together accounted for 23.3%.T he re m aining varieties were all sensitive and together accounted for 63.4%.T here were no resistant or im m une varieties.M easure m ent of enzy m e activities showed highly significant variations in C A T，S O D and P A L activities a m ong the different varieties，for both the inoculated sa m ples and for the controls without inoculation.Enzy m e activities in inoculated plants were higher than those of control plants and enzy m e activities in the resistant varieties were higher than those of susceptible varieties.Enzy m e activity increased after 4－8 d inoculation and decreased after 8－12 d inoculation.C A T activity of the inoculated plants significantly increased co m pared to the control，w hile S O D and P A L activities did not signifi-cantly increase.

Fusarium sporotrichioides；resistance evaluation；chitinase activity

.E-m ail：yuanqinghua＠iascaas.net.cn

10.11686/cyxb2015331

2015-06-30；改回日期：2015-09-30

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項項目（201303057）資助。

潘龍其（1988-），男，甘肅天水人，在讀碩士。E-m ail：gsaupanlongqi＠126.com