印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿生長及抗旱性的影響

武美燕，蒿若超，張文英（長江大學作物抗逆技術(shù)研究中心，作物學重點實驗室，湖北 荊州 434025）

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印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿生長及抗旱性的影響

武美燕，蒿若超，張文英*
（長江大學作物抗逆技術(shù)研究中心，作物學重點實驗室，湖北 荊州 434025）

以紫花苜蓿為材料，通過盆栽砂培的方法，設置接種（40 m L含有印度梨形孢菌絲體的菌劑）+干旱（土壤含水量為田間最大持水量的15%～20%）、未接種（40 m L無菌水）+干旱、接種+正常供水（土壤含水量保持在田間持水量的75%～80%）、未接種+正常供水4個處理，研究印度梨形孢真菌與紫花苜蓿共生對干旱脅迫下紫花苜蓿生長及抗旱性的影響。結(jié)果表明，印度梨形孢真菌在紫花苜蓿根部定殖率較高，達87.4%；與未接種+干旱處理相比，接種印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿地上部和根系有明顯影響，其中，地上部鮮重、干重、葉綠素含量、葉片相對含水量及葉片數(shù)分別比未接種處理顯著增加了63.4%，69.2%，12.5%，17.1%和5.7片，根系鮮重、干重、主根長及側(cè)根數(shù)分別增加了33.3%，57.1%，5.1 c m和5條（P＜0.05）；與未接種+干旱處理相比，接種后的紫花苜蓿葉片超氧化物歧化酶（S O D）、過氧化物酶（P O D）、過氧化氫酶（C A T）、脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量明顯增強，分別是未接種處理的1.71，1.27，1.22，1.49和1.48倍（P＜0.05），而超氧陰離子（O2－）與丙二醛（M D A）含量大幅度降低。因此，印度梨形孢真菌與紫花苜蓿共生可以促進干旱脅迫下紫花苜蓿生長，主要是通過刺激抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積來抵抗干旱逆境。而在正常供水條件下，接種印度梨形孢沒有明顯的促進生長的作用。

紫花苜蓿；苗期；印度梨形孢；促進生長；抗旱

http://cyxb.lzu.edu.cn

武美燕，蒿若超，張文英.印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿生長及抗旱性的影響.草業(yè)學報，2016，25（5）：78-86.

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隨著溫室效應的加劇，旱災將進一步加重。目前，全球有1/3的土地處于干旱、半干旱狀態(tài)，我國近50%的耕地處于干旱、半干旱地區(qū)［1］。干旱脅迫作為一種突出的非生物逆境，導致作物生長受到抑制、產(chǎn)量降低［2-3］。

紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界范圍廣泛栽培的優(yōu)質(zhì)多年生豆科牧草之一［4］，在我國主要分布在西北和華北的干旱、半干旱地區(qū)［5］，其生長所需的水分主要依靠自然降水。水分供應不足成為產(chǎn)量形成的重要因素。尤其是在苗期遭遇干旱少雨，將嚴重影響紫花苜蓿出苗及成苗［6］。已有研究表明，接種叢枝菌根真菌、根瘤菌等根部共生菌可以提高紫花苜蓿抵抗干旱的能力［7-13］。

印度梨形孢（Piriformosporaindica）是印度科學家Verm a等［14］于1998年在印度西北部的塔爾沙漠中發(fā)現(xiàn)的，屬擔子菌門（Basidio m ycota），層菌綱（H y m eno m yeetes），梨形孢屬（Piriformospora），該屬真菌特點是只形成厚垣孢子，典型的厚垣孢子是梨形，目前，該屬只有一個種，即印度梨形孢。該真菌的作用在很多方面與叢枝菌根真菌相似，它能夠廣泛定殖于單子葉和雙子葉植物的根部，促進植物生長，并能夠誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性［15］，提高作物對逆境脅迫的忍耐性。不同的是，印度梨形孢能在許多復雜的合成或半合成培養(yǎng)基上生長，不僅有助于理解該菌與植物間的互作機制，而且能為遺傳育種、作物品種改良提供候選功能基因。而叢枝菌根真菌是營專性寄生的，不能進行純培養(yǎng)［16］。目前，關(guān)于印度梨形孢真菌的研究主要集中在對植物的生長促進、提前開花和提高產(chǎn)量及病蟲害防治等方面［15，17-26］，在誘導植物逆境抗性方面，主要集中在抗旱、抗鹽等，涉及的植物主要為大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticum aestivum）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、小白菜（Brassica chinensis）、番茄（Lycopersiconesculentum）、煙草（Nicotiana tabacum）等［15，19，27-30］，但在紫花苜?？购捣矫鎯H有本課題組在2013年進行了初步研究［31］，研究結(jié)果表明，干旱脅迫條件下，接種印度梨形孢真菌有促進紫花苜蓿生長的作用，但其機理還不清楚。因此，本試驗目的是在前期試驗的基礎(chǔ)上，進一步驗證印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿生長的作用，并對其生理機理進行探討，為印度梨形孢真菌在紫花苜蓿旱地栽培中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株和供試紫花苜蓿品種農(nóng)菁1號分別由德國耶拿大學Ralf Oelm üller博士和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所提供。

將印度梨形孢接種在P D A（馬鈴薯培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L）固體培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)72 h進行活化培養(yǎng)。切取P D A固體培養(yǎng)基上的小塊真菌菌絲塊，接種到曲霉（Aspergillus）液體培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，置于恒溫搖床，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為30℃，黑暗培養(yǎng)7 d。過濾菌絲，用無菌水沖洗3～5次，1 g鮮重菌絲懸浮在100 m L無菌水中，放在三角瓶中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗于2014年5月實施，采用盆栽沙培方法，設干旱和接種2個試驗因素，干旱設置干旱（保持土壤含水量為田間最大持水量的15%～20%）和正常供水（保持土壤含水量為田間最大持水量的75%～80%）2個處理水平，接種設置接種和不接種2個處理水平，完全隨機設計，共4個處理組合，分別為接種+干旱、未接種+干旱、接種+正常供水、未接種+正常供水，每個處理重復4次。接菌方法：將1 kg高溫滅菌河沙（121℃，3 h）與40 m L含有印度梨形孢菌絲體的菌劑混勻裝入高12 c m、上口徑15 c m、底徑10 cm 的營養(yǎng)缽；不接種印度梨形孢處理則將等量無菌水與滅菌河沙混勻。將精選的紫花苜蓿種子用0.1%升汞滅菌處理后，播于裝好的營養(yǎng)缽內(nèi)，覆蓋1 c m厚滅菌沙。每缽播種20粒，于培養(yǎng)室進行培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，光照時間16 h。

1.2.2 根樣染色方法及定殖觀測 出苗后15 d，隨機選取紫花苜蓿幼苗根系，用自來水沖洗干凈后再用蒸餾水沖洗3遍，剪成1 c m長小段，經(jīng)10%Na O H浸泡4 h后洗凈，再經(jīng)1%H Cl浸泡5 min后洗凈，最后用0.05%乳酸石炭酸棉藍染色液染色制片，觀察印度梨形孢真菌定殖情況并拍照［30］。

1.2.3 干旱處理方法 出苗后20 d進行間苗和定苗，每缽保留10株大小均勻一致的紫花苜蓿幼苗。采用干旱－復水方法進行脅迫處理，從出苗21 d（第3周）開始控水，通過稱重法控制土壤水分到田間最大持水量的15%～20%，之后澆水至田間最大持水量的75%～80%，然后再次進行干旱脅迫，連續(xù)脅迫3個周期（每個周期10 d）。

1.2.4 測定指標 第3次干旱脅迫結(jié)束復水前，測定紫花苜蓿的主根長、側(cè)根數(shù)、根鮮重、根干重、地上部鮮重、地上部干重、葉片數(shù)、葉綠素含量及葉片相對含水量。葉綠素含量采用SP A D-502型葉綠素儀測定；葉片相對含水量（R W C）采用烘干法，分別取各處理同等葉位葉片，用萬分之一的電子天平稱其鮮重，然后用蒸餾水浸泡24 h，取出后擦凈葉片表面的水，再稱飽和鮮重，最后在烘箱內(nèi)105℃下烘8 h稱干重，根據(jù)公式計算：

R W C（%）＝（原始鮮重－干重）/（飽和鮮重－干重）

葉片超氧化物歧化酶（S O D）活性采用氮藍四唑（N B T）光氧化還原法測定［32］；過氧化物酶（P O D）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定［32］；過氧化氫酶（C A T）活性采用紫外吸收法測定［32］；丙二醛（M D A）和可溶性糖含量采用雙光組分光光度計法測定［32］；葉片游離脯氨酸含量采用茚三酮法測定［32］；超氧陰離子含量采用Elstner和H eupel［33］的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用S A S 8.02版本軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢真菌在紫花苜蓿幼苗根系定殖

印度梨形孢真菌與紫花苜蓿幼苗根系共生15 d后，經(jīng)臺盼藍染色，在400×生物顯微鏡下可清晰的觀察到該真菌在紫花苜蓿根部的細胞間和細胞內(nèi)非常密集地定殖有橢圓形的厚垣孢子，如圖1箭頭所示。共檢測135段1 c m長度印度梨形孢處理的紫花苜蓿根段，檢測到孢子的小段數(shù)有118段，定殖率為87.4%。

2.2 印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿生長的影響

2.2.1 印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿地上部生長的影響 表1為不同處理對紫花苜蓿地上部生長的影響?？梢钥闯?，與未接種+干旱處理相比，接種對干旱脅迫下紫花苜蓿的地上部生長影響明顯。接種+干旱處理地上部鮮重、干重、葉片數(shù)、葉綠素含量（SP A D值）和葉片相對含水量分別為0.116 g、0.026 g、16.7片、42.4 和80.5%，比未接種+干旱處理顯著增加了69.2%、63.4%、5.7片、12.5%和17.1%（P＜0.05）。從圖2可以很直觀地看到兩個處理間的長勢差別。與未接種+正常供水處理相比，接種+干旱處理明顯提高了紫花苜蓿地上部生長，可以達到未接種且正常供水情況下的生長效果，但接菌+正常供水處理對紫花苜蓿地上部的促生效果不明顯。

2.2.2 印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿根系生長的影響 表2為接種印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿根系生長的影響。結(jié)果表明，與未接種+干旱處理相比，接菌對干旱脅迫下紫花苜蓿的根系生長影響較大。接種+干旱處理根系鮮重、干重、主根長和側(cè)根數(shù)分別為0.120 g，0.021 g，15.3 c m和38條，比未接種處理顯著增加了33.3%，57.1%，5.1 c m和5條，差異達到顯著水平（P＜0.05）。與未接種+正常供水處理相比，接種+干旱處理明顯提高了紫花苜蓿根系的生長，可以達到未接種且正常供水情況下的生長效果，但接菌+正常供水處理沒有明顯促進紫花苜蓿根部生長的作用。

圖1 印度梨形孢在紫花苜蓿根部定殖Fig.1 Colonization of P.indica spores in the root of alfalfa

表1 印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿地上部生長的影響Table 1 Effects of P.indica on aboveground part of alfalfa under drought stress

2.3 印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿抗旱生理特性的影響

2.3.1 印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片保護酶活性的影響 圖3為接種印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片超氧化物歧化酶（S O D）、過氧化物酶（P O D）及過氧化氫酶（C AT）活性的影響。結(jié)果表明，與未接種+干旱處理相比，接種+干旱處理顯著增加了紫花苜蓿葉片S O D、P O D、C AT活性，三者分別為14.2 U/g F W，23.3 U/（m g·min），87.3 U/（g·min），是未接種+干旱處理的1.71，1.27和1.22倍（P＜0.05）。與未接種+正常供水處理相比，接種+干旱處理也明顯提高了紫花苜蓿葉片S O D、P O D、C A T活性，但接種+正常供水處理對3種酶活性影響不大。

2.3.2 印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片超氧陰離子和丙二醛（M D A）含量的影響 由圖4可以看出，與未接種+干旱處理相比，接種+干旱處理顯著降低了紫花苜蓿葉片超氧陰離子與M D A含量（P＜0.05），二者分別為43.6μg/g F W和3.8μm ol/g，比未接種+干旱處理分別降低了47.5%和55.3%，與未接種+正常供水處理的葉片超氧陰離子和M D A含量相差不大。正常供水條件下，接種處理的紫花苜蓿葉片超氧陰離子與M D A含量比未接種處理略有降低，但差異不顯著。

圖2 干旱脅迫下接種（＋P.indica）與不接種（C K）紫花苜蓿生長狀況Fig.2 Growth of alfalfa with P.indica inoculation and non-inoculation under drought stress

表2 印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿根系生長的影響Table 2 Effects of P.indica on the root of alfalfa under drought stress

圖3 印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片保護酶活性的影響Fig.3 Effects of P.indica on protective enzyme activities in the leaves of alfalfa under drought stress

圖4 印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片超氧陰離子和丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of P.indica on the O2－and M D A content in the leaves of alfalfa under drought stress

2.3.3 印度梨形孢真菌對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 圖5結(jié)果表明，與未接種+干旱處理相比，接種+干旱處理顯著增加了紫花苜蓿葉片脯氨酸和可溶性糖含量，二者分別為146.6μg/g和374.4 μg/g F W，是未接種+干旱處理的1.49和1.48倍（P＜0.05）。與未接種+正常供水處理相比，接種+干旱處理的葉片脯氨酸和可溶性糖含量明顯增加，但接種+正常供水處理二者沒有顯著變化。

圖5 印度梨形孢對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig.5 Effects of P.indica on the proline and soluble sugar content in the leaves of alfalfa under drought stress

3 討論

已有研究表明，接種印度梨形孢的玉米（Zea mays）、芝麻（Sesamum indicum）等在遭受干旱脅迫后生長效果較好［34-35］。本試驗結(jié)果表明，在干旱脅迫下，接種印度梨形孢的紫花苜蓿植株比未接菌的植株表現(xiàn)出更好的長勢，這也進一步驗證了本課題組在2013年得到的初步試驗結(jié)果。

植物在遭受干旱脅迫時，干旱脅迫會首先導致植物脫水，進而影響其生理生化過程，同時在這個過程中，植物也會主動適應干旱脅迫，產(chǎn)生積極的生理生化和代謝變化［36］。葉片相對含水量反映了水分不足時，植物組織在蒸騰時的耗水程度和恢復能力的差異。有研究指出，干旱脅迫下能保持較高葉片相對含水量的紫花苜蓿其抗旱性較強［37］。本試驗結(jié)果表明，接種印度梨形孢的紫花苜蓿在干旱脅迫時葉片相對含水量不但明顯高于未接菌處理，而且與未接種+正常供水處理沒有差異，原因可能是一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸、可溶性糖）的大量累積穩(wěn)定了紫花苜蓿體內(nèi)滲透壓的平衡，增強其保水的能力［3］，本試驗數(shù)據(jù)也證實了這一推斷，干旱脅迫下，接種后的紫花苜蓿葉片脯氨酸和可溶性糖含量是未接菌處理的1.49和1.48倍，且與未接種+正常供水處理差異不顯著。這一研究結(jié)果說明印度梨形孢對維持紫花苜蓿葉片細胞含水量有很好的作用，可以在一定時間內(nèi)減輕干旱脅迫的危害。因此，表現(xiàn)在地上部分和根系生長性狀上優(yōu)勢明顯。

此外，植物在長期進化過程中形成了包括S O D、P O D和C A T等抗氧化物酶保護系統(tǒng)，可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)抗氧化物酶活性的含量來消除或減輕由干旱引發(fā)的活性氧傷害［38］。本研究中，接種印度梨形孢的紫花苜蓿在干旱脅迫下葉片S O D、P O D、C A T活性分別是未接菌處理的1.71，1.27和1.22倍，而超氧陰離子與M D A含量比未接種處理顯著降低了47.5%和55.3%，表明印度梨形孢真菌與紫花苜蓿共生后刺激了3種保護酶活性的大幅度增加，使紫花苜蓿幼苗膜質(zhì)過氧化程度減輕，抗氧化能力增強，從而使得干旱脅迫下的紫花苜蓿能夠更好的生長。孫超［25］在小白菜上的研究結(jié)果表明，經(jīng)印度梨形孢處理的小白菜的抗氧化酶活性急劇且快速增加，且活性峰值的出現(xiàn)早于或高于對照活性峰值的出現(xiàn)。

大量研究結(jié)果證實，正常栽培條件下，接種印度梨形孢真菌可促進作物生長［18-19，21，24-25，39］，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常供水條件下，印度梨形孢與紫花苜蓿共生沒有明顯的促進生長的作用，是否不同作物有不同表現(xiàn)還需進一步探究。此外，印度梨形孢可誘導鹽脅迫下煙草和蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）等抗鹽相關(guān)基因的表達［40-41］，因此，本試驗后續(xù)相關(guān)研究主要應從紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因及抗旱相關(guān)蛋白含量方面深入研究，進一步揭示印度梨形孢對紫花苜?？购档淖饔脵C制。

4 結(jié)論

印度梨形孢與紫花苜蓿共生可以促進干旱脅迫下紫花苜蓿地上部和根系生長，能夠達到未接種且正常供水時的生長狀況。接種印度梨形孢真菌主要刺激了紫花苜蓿葉片S O D、P O D、C A T活性大幅度增加，有效地減輕了超氧陰離子對葉片細胞的傷害，降低了M D A含量，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖含量在葉片細胞內(nèi)大量累積，維持細胞相對含水量，從而提高紫花苜蓿對干旱脅迫的抗性。但在正常供水條件下，接種印度梨形孢真菌沒有明顯的促進生長的效果。

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Effects of Piriformosporaindica fungus on growth and drought resistance in alfalfa under water deficit stress

W U M ei-Yan，H A O Ruo-Chao，Z H A N G W en-Ying*
Research Center of Crop Stresses Resistance Technologies and Key Laboratory of Crop Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，China

Pot experim ents were conducted to evaluate the growth and drought resistance of alfalfa（Medicago sativa）seedlings colonized by Piriformosporaindica fungus.T he experim ent co m prised a 2×2 factorial co mbination of inoculation（inoculated，I，or un-inoculated，NI）and drought（droughted，D or not，N D）treatm ents，giving 4 co m binations：I-D，I-N D，NI-D（reference），and NI-N D.For the inoculated plants，40 m L of inoculant with P.indica m yceliu m was applied，and for control plants，40 m L of sterile water was added.Soil water content was 75%－80%of field capacity for the norm al irrigation treatm ent and 15%－20%for the drought treatm ents.Fresh shoot and root weights，root length，dry shoot and root weights，chlorophyll（SP A D），relative water content（R W C），antioxidase enzy m e activity，O2－，m ethane dicarboxylic aldehyde （M D A）and os m olytes were determined for all treatm ents.T he fungus strongly colonized the roots of alfalfa，infecting 87.4%of seedlings.W hen the colonized plants were exposed to drought stress，the fresh shoot weight，dry shoot weight，chlorophyll，relative water content and the nu m ber of leaves per plant were pro m oted significantly by 63.4%，69.2%，12.5%，17.1%and 5.7，respectively.In addition the fresh root weight，dry root weight，length of taproot and nu m ber of lateral roots were im proved significantly by 33.3%，57.1%，5.1 c m and 5 roots，respectively，co m pared to the reference plants（NI-D）.Furtherm ore，the activities of super-oxide，peroxidases，catalases，and the levels of proline and of soluble sugarin the leavesincreased by 1.71，1.27，1.22，1.49 and 1.48 tim es，respectively，and the contents of O2－and M D A decreased significantly.In su m m ary，P.indica fungus enhanced the growth and drought tolerance of alfalfa in the seeding stage by stimulating the activity of antioxidant enzy m es and the content of os m olytes，w hile under norm al irrigation，the fungus had no significant effect on the growth of alfalfa.

alfalfa（Medicagosativa）；seeding stage；Piriformosporaindica；growth pro m otion；drought resistance

.E-m ail：wyzhang＠yangtzeu.edu.cn

10.11686/cyxb2015366

2015-07-20；改回日期：2015-10-21

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203032），長江大學作物抗逆技術(shù)研究中心開放基金（2014001）和濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金項目（K F201506）資助。

武美燕（1977-），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，副教授，博士。E-m ail：w u m eiyan2002＠163.com