魚精蛋白包覆PLA納米囊對小鼠骨髓系樹突狀細胞免疫功能的影響*

楊　萍，　朱俊銘△

1武漢生物技術研究院，武漢　4300752華中科技大學生命科學與技術學院，武漢　430074

實驗研究

魚精蛋白包覆PLA納米囊對小鼠骨髓系樹突狀細胞免疫功能的影響*

楊萍1，2，朱俊銘1，2△

1武漢生物技術研究院，武漢4300752華中科技大學生命科學與技術學院，武漢430074

摘要：目的探索魚精蛋白(PS)包覆聚乳酸(PLA)納米囊對小鼠骨髓系樹突狀細胞(BMDC)體外免疫應答效應的影響。方法采用復乳溶劑揮發(fā)法制備包裹模型抗原雞卵清白蛋白(OVA)的PLA納米囊，以PS進行表面修飾。將納米囊作用于體外培養(yǎng)的BMDC，用流式細胞儀檢測BMDC表面分子CD80、CD83、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ的表達和對納米囊的攝取情況，用ELISA法檢測BMDC分泌IL-12 p70水平。結果PS包覆PLA納米囊可顯著促進BMDC表達CD80、CD83、MHCⅠ和MHCⅡ表面分子，增加BMDC分泌IL-12 p70，增強BMDC對OVA的攝取。結論PS包覆PLA納米囊可以增強BMDC的免疫應答效果，有望成為一種良好的藥物載體。

關鍵詞：聚乳酸；魚精蛋白；納米囊；樹突狀細胞；免疫功能

疫苗是人類治療和預防疾病最有效的手段之一。佐劑是一種能夠增強疫苗抗原特異性免疫應答或改變免疫反應類型的物質。目前研究的佐劑種類繁多，但鋁鹽(磷酸鋁、氫氧化鋁)仍是使用最廣泛的人注射用佐劑，主要用以增強Th2型免疫反應。鋁佐劑誘導抗體生成的程度比較緩和，對多肽類疫苗的輔佐效應不太明顯，并有諸多缺點，故近年來很多研究嘗試采用高分子材料來制備新型佐劑以取代鋁鹽[1]。

聚乳酸(polylactic acid，PLA)是一種具有良好生物相容性和生物可降解性的高分子材料，可用作多肽、蛋白質、質粒DNA抗原的載體，目前受到廣泛重視。PLA納米粒包裹抗原在注射局部起到儲庫效應并增強吞噬細胞攝取[2]。為誘導更強的免疫反應，在高分子載體表面修飾陽離子可增強載體的佐劑效應[3]。魚精蛋白(protamine，PS)富含精氨酸，帶正電荷，已被FDA批準用于因注射肝素過量導致的或自發(fā)的出血性疾病，也可與胰島素合用作為長效制劑。采用魚精蛋白包覆PLA納米囊作為疫苗載體對樹突狀細胞的免疫反應是一個創(chuàng)新的探索。

本研究以PLA納米囊作為新型載藥系統(tǒng)，其外包覆魚精蛋白作為佐劑，利用其帶正電荷和顆粒性，通過靜電吸引與帶負電的細胞相互作用，增加攝取量，增強免疫效果。

1材料與方法

1.1主要實驗材料

1.1.1試劑PLA(山東濟南岱罡科技有限公司)，OVA、脂多糖(LPS)、PS、聚乙烯醇(PVA)(Sigma-Aldrich公司)，重組小鼠集落刺激因子(rmGM-CSF)、小鼠白細胞介素-4(IL-4)(Peprotech公司)，RPMI-1640、胎牛血清(Gibco公司)，F(xiàn)ITC標記抗小鼠CD80、MHCⅡ(I-A/I-E)、PE標記抗小鼠CD11c、CD83、CD86、MHCⅠ(H-2Kb)(Biolegend公司)，小鼠IL-12 p70 ELISA試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)，BCA蛋白質測定試劑盒(江蘇海門碧云天生物技術研究所)。

1.1.2儀器激光粒度儀(Zetasizer/Nano-ZS90，Malvern公司)，流式細胞儀(FC5000，Beckman公司)，探頭超聲儀(JY99-2D，浙江寧波新芝生物技術研究所)。

1.1.3實驗動物4～8周齡C57BL/6雄性小鼠，購自武漢大學實驗動物中心。

1.2OVA/PLA/PS納米囊的制備及表征

采用復乳溶劑揮發(fā)法制備PLA納米囊。稱取50 mg PLA溶解于2 mL二氯甲烷中構成有機相。探頭超聲下，將0.3 mL OVA(25 mg/mL)溶液分散于有機相中，形成初乳。初乳加入含有1.5% PVA的外水相中，探頭超聲形成復乳。通風櫥中磁力攪拌至二氯甲烷揮發(fā)完全得到固化的OVA/PLA納米囊，用超純水洗滌2次，除去殘留PVA。在納米囊混懸液中加入PS至終濃度5 mg/mL，攪拌2 h，用超純水洗滌得到OVA/PLA/PS納米囊。采用激光粒度儀對納米囊進行粒徑、Zeta電位表征，并用BCA試劑盒按說明書操作步驟進行納米囊包封率和載藥量測定。采用透射電鏡觀察納米囊的形貌。

1.3小鼠骨髓干細胞的分離與培養(yǎng)

根據(jù)文獻[4]方式分離BMDC，接種于6孔板，每孔2 mL。第3、5天換液，第7天收集培養(yǎng)板中半懸浮和懸浮的未成熟BMDC(imBMDC)。采用PE標記的抗小鼠CD11c對收獲的細胞進行純度檢測。

1.4實驗分組

實驗分為正常對照組、陽性對照組、OVA組、OVA/PLA組和OVA/PLA/PS組，分別加入PBS、1 μg/mL的LPS、200 μg/mL的OVA、200 μg/mL的OVA/PLA、200 μg/mL的OVA/PLA/PS。根據(jù)實驗目的分別設定細胞與藥物的孵育時間。

1.5魚精蛋白表面修飾PLA納米囊對BMDC表型的影響

將對照組和實驗組置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)20 h。收集BMDC，PBS洗2次，以PBS重懸細胞濃度為5×106/mL，取100 μL細胞懸液置于1.5 mL EP管中，分別加入FITC標記的抗小鼠CD80、MHCⅡ，PE標記的抗小鼠CD11c、CD83、CD86、MHCⅠ及其同型對照，混勻，置4℃避光孵育30 min，PBS洗2次。流式細胞儀檢測，結果以幾何平均熒光強度(gMFI)表示。

1.6魚精蛋白表面修飾PLA納米囊對BMDC細胞因子分泌的影響

BMDC與不同處理組置于37℃、5%CO2條件下共孵育20 h后，收集各孔細胞。1 500 r/min，5 min離心收集培養(yǎng)上清，采用ELISA法檢測IL-12 p70含量。按照試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上讀取各樣品吸光度值，對應計算IL-12 p70含量。

1.7魚精蛋白表面修飾PLA納米囊對BMDC攝取的影響

第7天收集BMDC，用PBS洗2次，以5×105細胞/孔的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板，加入FITC-OVA溶液、FITC-OVA/PLA懸液和FITC-OVA/PLA/PS懸液至終濃度為200 μg/mL。將各組BMDC在37℃分別孵育30、60、120 min，考察孵育時間對BMDC攝取的影響。達到孵育時間，收集各孔細胞，PBS洗3次，4℃避光保存，送流式細胞儀檢測。

1.8統(tǒng)計學方法

2結果

2.1魚精蛋白表面修飾PLA納米囊的表征

PLA納米囊表面電荷為負值，而包覆魚精蛋白后，OVA/PLA/PS的表面電荷轉為正值。制得的納米囊粒徑在300 nm以內，經BCA法測得包封率為36%，見表1。從圖1可知納米囊形態(tài)規(guī)整，具有典型的核-殼結構。

Table 1Characteristics of protamine coated PLA

納米囊粒徑(nm)PDIZeta(mV)OVA/PLA220.5±2.30.015±0.005-20.4±0.6OVA/PLA/PS243.7±3.10.130±0.00319.0±0.9FITC-OVA/PLA253.6±4.40.069±0.007-13.4±1.1FITC-OVA/PLA/PS294.6±6.30.197±0.01214.8±0.8

標尺為100 nm圖1　OVA/PLA納米囊(A)和OVA/PLA/PS納米囊(B)的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy(TEM)of OVA/PLA nanocapsule(A)and OVA/PLA/PS nanocapsule(B)

2.2魚精蛋白表面修飾PLA納米囊對BMDC表面分子的上調作用

流式細胞儀檢測CD11c結果顯示細胞純度為85%～90%，這為后續(xù)細胞實驗提供了可靠的支持。如圖2所示，OVA/PLA/PS組的BMDC細胞表面分子CD80、CD83、MHCⅠ、MHCⅡ表達均顯著高于OVA/PLA組。OVA/PLA/PS組與OVA/PLA組相比，CD86表達沒有顯著差異。

2.3魚精蛋白包覆PLA納米囊對BMDC細胞因子分泌的調節(jié)

經ELISA法檢測結果如表2所示，OVA/PLA/PS可以顯著增加細胞因子IL-12 p70的分泌。

A：正常對照組；B：陽性對照組；C：OVA組；D：OVA/PLA組；E：OVA/PLA/PS組；與正常對照組比較，*P<0.05 **P<0.01圖2　納米囊對BMDC表型的影響Fig.2 Effect of nanocapsule on the phenotypes of BMDCs

組別IL-12p70(pg/mL)正常對照組1.21±0.24陽性對照組239.56±23.36**OVA組4.77±0.89OVA/PLA組46.28±9.70*OVA/PLA/PS組175.26±14.22**

與正常對照組比較，*P<0.05**P<0.01

2.4魚精蛋白包覆PLA納米囊對BMDC攝取的影響

流式細胞儀檢測結果如圖3所示。FITC-OVA/PLA/PS和FITC-OVA/PLA都能顯著增強BMDC的攝取，且FITC-OVA/PLA/PS的增強作用更顯著。隨著時間延長，BMDC對FITC-OVA/PLA/PS的攝取作用在2 h顯著增強。

與FITC-OVA/PLA組比較，*P<0.05圖3　BMDC對FITC-OVA溶液、FITC-OVA/PLA納米囊和FITC-OVA/PLA/PS納米囊的攝取Fig.3 Uptake of FITC-OVA solution，F(xiàn)ITC-OVA/PLA and FITC-OVA/PLA/PS nanocapsules by BMDCs

3討論

PLA納米囊是廣泛應用于抗原轉運的載體，近年來研究熱點集中于對PLA納米囊的表面修飾及其對免疫反應類型的影響。文獻報道納米囊表面修飾正電荷物質可以增強細胞攝取，誘導更強的免疫反應。魚精蛋白是一種帶正電荷無毒且具有生物可降解性的材料[5]。本實驗制備魚精蛋白包覆PLA納米囊，考察其細胞免疫效應，為制備新型疫苗載體提供初步的實驗依據(jù)。

本實驗制備的PLA納米囊粒徑為200～400 nm，介于可被BMDC有效吞噬的粒徑范圍[6]。PLA納米囊包覆魚精蛋白后Zeta電位由負變正，表明正電荷魚精蛋白已經有效包覆于PLA納米囊表面。樹突狀細胞是非常重要的抗原遞呈細胞(APC)，在激發(fā)體內免疫反應的過程中起到關鍵性作用。在BMDC表型分析中，我們發(fā)現(xiàn)OVA/PLA/PS能顯著上調BMDC表面分子CD80、CD83、MHCⅠ、MHCⅡ的表達。CD83表達的增加意味著樹突狀細胞由不成熟狀態(tài)轉為成熟狀態(tài)[7]。而BMDC的表面分子不僅僅是BMDC分化成熟的標志，同時也是BMDC發(fā)揮其免疫功能的重要組成部分。

IL-12 p70是BMDC分泌的細胞因子，大量的研究證明成熟的BMDC分泌的IL-12 p70可促使活化后的T細胞分化為Th1細胞，在Th1細胞的分化和CTL反應中占據(jù)著重要的位置。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA/PLA/PS對BMDC分泌IL-12 p70有顯著上調作用，這表明魚精蛋白包覆PLA納米囊可能使T細胞反應向Th1和CTL反應方向發(fā)展。

樹突狀細胞的攝取是疫苗發(fā)揮免疫效應的前提。本研究采用流式細胞儀檢測了BMDC對包裹FITC-OVA的各種納米囊的吞噬特征，發(fā)現(xiàn)魚精蛋白包覆PLA納米囊可以顯著增強BMDC的攝取。魚精蛋白調整納米囊表面的Zeta電位由負轉正，可提高納米囊與帶負電荷的BMDC的靜電吸引力，增加被BMDC吞噬的機會[8]。這種攝取在37℃下，隨時間延長而增加，呈時間依賴性。BMDC在同等條件下能攝取更多的抗原可能是促進BMDC成熟、增強其免疫效果的原因。

綜上所述，我們的研究表明魚精蛋白包覆PLA納米囊可增強BMDC的攝取，上調BMDC表達CD80、CD83、MHCⅠ、MHCⅡ，促進BMDC分泌誘導細胞免疫反應的細胞因子IL-12 p70，提示其具有誘導細胞免疫反應的作用，從而為新型疫苗的研發(fā)開辟了一條新途徑。

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(2015-05-25收稿)

Effect of Protamine Coated PLA Nanocapsule on the Immune Function of Murine BMDCsInVitro

Yang Ping1，2，Zhu Junming1，2△

1WuhanInstituteofBiotechnology，Wuhan430075，China2SchoolofLifeSciencesandTechnology，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430074，China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of protamine(PS)coated polylactic acid(PLA)nanocapsule on the immune response of murine bone marrow-derived dendritic cells(BMDCs).MethodsPLA nanocapsules were prepared by W1/O/W2method.Protamine was used to modify the surface of PLA nanocapsule that encapsulated ovalbumin(OVA)，a model antigen.The prepared OVA/PLA/PS nanocapsules were used to stimulate BMDCs.Flow cytometry was used to analyze the expression of surface molecules CD80，CD83，CD86，MHCⅠ，and MHC Ⅱ，and the uptake of nanocapsule.The levels of IL-12 p70 secreted by BMDCs were detected by ELISA.ResultsOVA/PLA/PS nanocapsules could significantly up-regulate the expression of CD80，CD83，MHCⅠ，and MHC Ⅱ in BMDCs，and increase the secretion of IL-12 p70 by BMDCs.Furthermore，OVA/PLA/PS nanocapsules could enhance the uptake efficiency of OVA by BMDCs.ConclusionOVA/PLA/PS nanocapsule can enhance the immune response of BMDCs，and may become a good drug delivery carrier.

Key wordspolylactic acid(PLA)；protamine；nanocapsule；bone marrow-derived dendritic cell(BMDC)；immune function

中圖分類號：R392.12

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.012

*武漢市關鍵技術攻關計劃資助項目(No.2014061305090453)

楊萍，女，1992年生，碩士研究生，E-mail：764183950@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jmzhu@hust.edu.cn