mTOR信號通路在左旋多巴誘發(fā)異動癥中的作用及機制研究

繆茂軍　陳小武　曹學(xué)兵　陳志斌

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mTOR信號通路在左旋多巴誘發(fā)異動癥中的作用及機制研究

繆茂軍陳小武曹學(xué)兵陳志斌

570102海口，海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[繆茂軍陳志斌(通信作者)陳小武]；華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(曹學(xué)兵)

【摘要】目的探討mTOR(Mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)信號通路的激活在左旋多巴誘發(fā)異動癥(L-Dopa Induced Dyskinesia，LID)大鼠紋狀體中的作用及機制。方法普通級SD雄性大鼠共54只，隨機分為5組，8只正常組(N組),剩下8只帕金森病(Parkinson's disease)模型；異動癥組10只、余均分為雷帕霉素(Rapamycin)作為藥物治療組即干預(yù)組和Rapamycin溶劑的對照組(C組)各14只；記錄下對照組與干預(yù)組的行為學(xué)并進行異動癥AIM評分，每周至少兩次；用western blot技術(shù)測定N組、PD組、LID、C組以及R組紋狀體組織的免疫印跡，驗證所用NMDA受體亞基NR1(Ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)位點磷酸化及PSD-95、p-PSD95(S295)磷酸化位點的抗體特異性的變化。結(jié)果(1)對照組第1，3，5天時間點行為學(xué)AIM評分與干預(yù)組無差異(P>0.05),第8天時間點行為學(xué)AIM評分與對照組比較，干預(yù)組AIM評分有下降(P<0.01)，之后第9、10、13、16、18、21天2組仍然有明顯差異，干預(yù)組AIM評分無反彈上升現(xiàn)象。(2)LID組大鼠紋狀體PSD-95及p-PSD95(s295)表達(dá)水平較其他組高；干預(yù)后兩者的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。PSD-95及p-PSD95(S295)在正常組表達(dá)水平最低，在異動癥組和對照組最高，無差異(P>0.05)；與正常組外其他組對比，干預(yù)組兩者的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；干預(yù)組與正常組的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。(3)LID組、對照組NMDA受體亞基NR1(Ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)位點磷酸化的表達(dá)水平較干預(yù)組有所增高(P均<0.05)。結(jié)論(1)mTOR參與了LID的發(fā)病，應(yīng)用mTOR特異性抑制劑雷帕霉素對LID的治療有效。(2)大鼠紋狀體區(qū)的mTOR信號調(diào)理與LID的發(fā)生密切相關(guān)，mTOR激活對紋狀體突觸水平具有調(diào)節(jié)作用，可能通過依賴突觸分子PSD-95以及NMDAR各亞型的磷酸化水平導(dǎo)致突觸可塑性發(fā)生適應(yīng)改變，最終產(chǎn)生和維持皮質(zhì)紋狀體突觸“病理性LTP”，從而介導(dǎo)了LID發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】異動癥帕金森病mTOR雷帕霉素紋狀體突觸可塑性

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.03.011

PD是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性運動障礙疾病，目前治療PD的主要手段就是多巴胺(dopamine，DA)替代療法，但長期服用后可能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，其中較常見又是最難處理的一種并發(fā)癥就是LID，一旦出現(xiàn)該癥狀就會長期保持，嚴(yán)重影響左旋多巴(L-DOPA)對PD的進一步治療，LID被認(rèn)為是最普遍的限制PD治療療效的副作用[1]，臨床上處理尚無找到有效的辦法。LID的發(fā)生主要是由一些受體導(dǎo)致紋狀體的輸出的變化是從而造成紋狀體多巴胺受體(dopamine receptor，DR)波動性刺激并變化引起的，但確切的機制尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)：在LID模型中，直接通路(興奮性)MSNs內(nèi)哺乳動物mTOR(Mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)信號通路能夠被持續(xù)性的激活；然而阻斷 mTOR的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)不影響L-DOPA對PD的治療作用，但是卻能夠明顯減輕LID[2-4]。

mTOR調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的合成在突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，利用不同頻率刺激發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)紋狀體谷氨酸能纖維能誘發(fā)長期增益效應(yīng)(LTP)，皮質(zhì)紋狀體通路異常在LID中起重要作用，即紋狀體神經(jīng)元通過“病理性”LTP對異常運動的記憶，是LID產(chǎn)生的重要機制。在調(diào)節(jié)突觸可塑性中，皮質(zhì)紋狀體突觸可塑性的異常可能是LID發(fā)生的重要機制。因此，關(guān)鍵分子PSD-95及骨架分子NMDA受體功能增強參與突觸可塑性，在“病理性LTP”產(chǎn)生中起重要作用[7]，但是mTOR在“病理性LTP”中的調(diào)控涉及到PSD-95、NMDA受體這一機制目前尚不清楚。

以上提示了mTOR在蛋白合成和LID中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，突觸異常是LID發(fā)生的重要基礎(chǔ)，mTOR信號通路的激活在LID中發(fā)生，并可能成為治療LID的新靶標(biāo)。因此，我們進一步猜想：作為與突觸可塑性相關(guān)的整合分子如PSD-95、NMDA受體。在LID中研究，mTOR信號通路的激活，導(dǎo)致與LTP產(chǎn)生和維持有關(guān)的蛋白質(zhì)合成增加如PSD-95、NMDA各種亞型NR1、NR2A、NR2B的蛋白分子磷酸化表達(dá)等，mTOR通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯機制使突觸可塑性發(fā)生適應(yīng)改變，最終產(chǎn)生和維持皮質(zhì)紋狀體突觸“病理性LTP”，從而介導(dǎo)了LID發(fā)生，而這一系列的整合分子的表達(dá)是否受mTOR信號通路的調(diào)控呢？

本研究通過腦立體定向儀注射6羥基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制作性能穩(wěn)定的PD模型，對PD模型外源性輸入腹腔注射左旋多巴+芐絲肼制作LID模型，并且用mTOR特異性抑制劑-雷帕霉素干預(yù)，深入闡明mTOR信號通路在LID模型中發(fā)生的相關(guān)的行為學(xué)變化、突觸可塑性相關(guān)分子作用以及突觸形態(tài)學(xué)觀察，從而為行為學(xué)以及突觸可塑性分子水平奠定理論基礎(chǔ)。因此，本實驗通過驗證mTOR在LID模型中的作用，觀察mTOR信號通路的激活對LID大鼠行為學(xué)及PSD-95、S295、NMDAR亞基磷酸化水平的影響及調(diào)控，進一步探討LID的病理機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

飼養(yǎng)成年普通級Sprague-Daewley rats，雄性，體重從200～250 g范圍，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，遵照倫理學(xué)，所有飼養(yǎng)符合華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)管理條例。

1.2實驗設(shè)計分組

設(shè)計分為5組：(1)正常觀察組(Normal，N組)，未做任何處理；(2)帕金森模型組(Parkinson,PD組)：6-OHDA(2 ug/ul，注射8 ug)腦立體注射制作，經(jīng)阿撲嗎啡檢測制作成功的帕金森病大鼠便納入該組，后未做任何處理；(3)異動癥組(LID組)：經(jīng)阿撲嗎啡(為0.05 mg/kg)檢測后選入成功的PD納入，L-DOPA +Benserazide (L-DOPA 25 mg+Benserazide 6.25 mg/kg，)腹腔注射給藥，連續(xù)21 d；(4)Rapamycin(劑量0.35 mg/kg用藥)為干預(yù)組(Rapamycin,R組)：Rapamycin干預(yù)后L-DOPA給藥；(5)Rapamycin的對照組(C組)：Rapamycin的溶劑(5% DMSO+5%聚乙二醇400+5%聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯溶液(Tween-20))作為對照，L-DOPA給藥不變。

1.3藥物及主要試劑

6-羥多巴(6-OHDA)、阿樸嗎啡、左旋多巴甲酯、鹽酸芐絲肼、雷帕霉素(rapamycin)、等均購于美國sigma公司。Anti-phospho -NR1 (Ser896) 購于 millipore公司；Anti-NMDAR2A(phospho Y1325)、Anti-NMDAR2B(phospho Y1472)購于Abcam；Anti-PSD95 (phospho S295)、Anti-PSD95 購于Epitomics；Anti-β-actin 購于santa。

1.4主要實驗器材

腦立體定位儀購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，超聲勻漿器、低溫離心機、電泳儀、-70 ℃超低溫冰箱等均由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病國家重點實驗室基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院9樓實驗室提供。

1.5偏側(cè)帕金森病大鼠模型的制備

以右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束(MFB)為目標(biāo)靶區(qū)，腦立體定向注射6-OHDA制作偏側(cè)帕金森病大鼠模型[8,9]。

1.6檢測PD模型

術(shù)后2周，使用阿撲嗎啡(0.05 mg/Kg)，旋轉(zhuǎn)>7轉(zhuǎn)/min 為成功的成功PD大鼠模型[10]。

1.7LID大鼠模型的制作(L-DOPA腹腔注射)

注射阿撲嗎啡3 d后，LID組大鼠給予溶液L-DOPA 25 mg+Benserazide 6.25 mg/kg于腹腔注射，1次/d，連續(xù)用藥7 d，評定等達(dá)到AIM[11]的標(biāo)準(zhǔn)。

Q：作為較早進入內(nèi)地的香港企業(yè)，金杯印刷見證了改革開放的高速發(fā)展，您認(rèn)為改革開放為貴公司提供了怎樣的發(fā)展環(huán)境？

1.8LID隨機分組

LID組：繼續(xù)每天L-DOPA給藥；R組大鼠每天在給予L-DOPA前1h給予Rapamycin；C組給予同等劑量的安慰劑(內(nèi)含5% DMSO+5%聚乙二醇400+5%聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯溶液(Tween-20))，同時，如LID組所述，給予含L-DOPA+Benserazide溶液同劑量腹腔注射。

1.9異動癥(AIM)評分

AIM評分并錄取視頻交有課題負(fù)責(zé)人審校，評定標(biāo)準(zhǔn)按Monville等[11]標(biāo)準(zhǔn)， AIM目的評分分為4個部分：口面部-即下頜運動和嘴部舌頭伸出；上肢-即對側(cè)前肢重復(fù)無目的的動作；軸性-即頸部和對側(cè)上體的扭曲姿勢；運動-即與對側(cè)轉(zhuǎn)向運動)進行評定,數(shù)據(jù)順序亦按此記錄，每部分的評分等級根據(jù)行為學(xué)的有無及不自主運動的嚴(yán)重程度來劃分，共5個等級(0～4):0分為無出現(xiàn)；1分為偶爾出現(xiàn),少于50%的時間，即少于觀察期的一半；2分經(jīng)常出現(xiàn)，超過50%的時間，即一半以上的觀察期；3分為繼續(xù)存在，刺激可以停止；4分為持續(xù)存在,刺激不可使之停止。從理論上評論每只大鼠，1只大鼠1次用藥后每個評分時間點最大得分為16分，120 min內(nèi)最大評分為64分。記錄數(shù)據(jù)以供進一步分析。

1.10Western-Blot檢測紋狀體PSD95、S295等表達(dá)：

在藥物干預(yù)的最后1 d準(zhǔn)備凍存管，液氮等，異動癥組、干預(yù)組及對照組在給予L-DOPA藥物2 h后處理，快速斷頭，放入冰上操作，小心解剖出右側(cè)紋狀體，稱重后記錄下數(shù)據(jù)并置入EP管，液氮速凍，存于-80 ℃，正常組以及PD組的紋狀體標(biāo)本采集同上。根據(jù)各組大鼠的總重量來配置RIPA裂解液的量，加入10倍的RIPA裂解工作液體積，研磨徹底，用超聲波破碎儀勻漿3 s停1 min，提取蛋白，用BCA法測定蛋白水平，根據(jù)樣品數(shù)量BCA試劑按體積比A∶B=50∶1，加入5x蛋白上樣緩沖液的量為按EP中蛋白樣品的體積1/4，充分混合，震蕩義震蕩5 min后，電磁爐設(shè)置100 ℃，待達(dá)到100 ℃時候，放入沸水中加熱10 min，冷卻，將樣本經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離膠進行分離后，將膠移入PVDF膜上，右上角缺失及標(biāo)記處為正面，合起，恒流300 mA 2 h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束，條帶放入在TBST中用搖床洗5 min，然后放入預(yù)先配置好5%的脫脂奶粉中，搖床1 h即封閉結(jié)束。稀釋一抗，開始一抗孵育4 ℃過夜，一抗孵育結(jié)束。TBST洗滌3*10 min或者5*6 min。稀釋二抗(用TBST稀釋，不回收)，開始孵育二抗，室溫下約1 h，二抗孵育結(jié)束。用TBST洗滌5*6 min。在暗室中按1∶1體積吸入ECL發(fā)光液A和B試劑，于EP管中充分混勻，將PVDF膜放入暗匣中曝光，掃描曝光，保存圖像，若果效果不好，用TBST洗3*5 min，用一抗二抗洗脫液洗5 min，再次封閉，重新孵育一抗過夜，繼續(xù)前面步驟。

1.11統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1行為學(xué)評分

如圖1示，隨機選8只對照組與8只干預(yù)組行為學(xué)評分，在第8 d之前兩組無明顯差異即第1,3,5 d時間點兩組間無差異(P>0.05)，根據(jù)實驗設(shè)計，第7 d藥物干預(yù)，經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后第二天即第8 d時間點即出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，后AIM評分持續(xù)下降未出現(xiàn)明顯反彈現(xiàn)像(表1)。

表1　2組行為學(xué)評分

注：與干預(yù)組比較，*P>0.05,#P<0.01

圖1 行為學(xué)趨勢 與干預(yù)組同時間點比較,*P>0.05,#P<0.01

2.2突觸可塑性骨架分子水平Western-Blot檢測

2.2.1突觸可塑性骨架分子p-PSD95(s295)水平的變化LID組大鼠紋狀體s295表達(dá)較正常組外的其他組高(P<0.05)；N組表達(dá)水平最低；LID組和C組(P>0.05)最高，兩者無明顯差異(P>0.05)；R組與C比較有差異(P<0.05)；R與N組比較無明顯差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 Westernblot檢測p-PSD95(s295)水平的變化 與同正常組比較,△P=0.011<0.05;同PD組比較,*P=0.176>0.05;與異動癥組比較,**P=0.904>0.05;與對照組比較,***P=0.013<0.05;與干預(yù)組比較,※P=0.075>0.05

2.2.2突觸骨架分子PSD-95水平的變化

PD組PSD-95表達(dá)水平與N組較高(P<0.05)；LID組較PD組表達(dá)較高(P<0.05)；LID組和C組(P>0.05)表達(dá)最高，兩者無明顯差異(P>0.05)；R組與C比較有差異(P<0.05)；R組與N組比較無明顯差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 Westernblot檢測PSD-95水平的變化 與正常組比較,△P=0.012<0.05;與帕金森組比較,*P=0.195>0.05;與異動癥組比較,**P=0.836>0.05;與對照組比較,***P=0.021<0.05;與干預(yù)組比較,※P=0.809>0.05

2.3突觸可塑性關(guān)鍵分子水平Western-Blot檢測

2.3.1mTOR信號通路激活導(dǎo)致的NMDA亞基NR1(ser896)磷酸化水平的變化PD組ser896磷酸化水平較N組高(P<0.01)；LID組較PD組高(P<0.05)；LID組和C組最高，無明顯明顯(P>0.05)；R組與C組差異明顯(P<0.01)(圖4)。

圖4 Westernblot檢測p-NMDAR1(Ser896)的水平的變化 與正常組比較,△P=0.002<0.01,與帕金森組比較,*P=0.013<0.05,與異動癥組比較,**P=0.932>0.05,與對照組比較,***P=0.003<0.01,與干預(yù)組比較,※P=0.070>0.05

2.3.2mTOR信號通路激活導(dǎo)致的NMDA亞基NR2A(Y1325)磷酸化水平的變化

PD組NR2A(Y1325)磷酸化水平與N組比較，兩者有明顯差異(P<0.05)；LID組與PD組比較，有明顯差異(P<0.05)；C組與LID組明顯無差異(P>0.05)；R組與C組比較有明顯差異(P<0.01)；R組比N組有明顯差異(P<0.01)(圖5)。

2.3.3mTOR信號通路激活導(dǎo)致的NMDA亞基NR2B(Y1472)磷酸化水平的變化

如圖6示，PD組NR2B(Y1472)磷酸化水平較正常組高(P<0.01)；LID組與PD組比較有差異(P<0.01)；LID組和C組無差異(P>0.05)；R組與C組比較明顯差異(P<0.01)；R組比N組比較有明顯差異(P<0.05)。

3討論

3.1mTOR與突觸后致密區(qū)骨架分子PSD-95及S295與LID發(fā)病機制

PSD-95是在突觸后密度樹突棘(PSD)的骨架分子，其中，PSD-95經(jīng)典角色是谷氨酸受體蛋白穩(wěn)定性的主要支架部分[12]。PSD-95作為重要的支架蛋白在興奮性突觸的PSD大量富集，PSD-95中分特定的PDZ結(jié)構(gòu)域大量介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子和細(xì)胞表面粘附分子，離子通道和受體包括NMDA受體的相互作用[13,14]。PSD-95在突觸可塑性中被認(rèn)可具有廣泛功能，包括膜蛋白和蛋白質(zhì)運輸?shù)亩ㄎ徽{(diào)節(jié)作用。許多信號傳輸通過它們的胞質(zhì)域。直接在突觸上與PSD-95互動，形成了豐富的突觸后骨架蛋白，起到了調(diào)節(jié)突觸可塑性的功能。突觸定位和NMDA受體的活性是由MAGUK家族蛋白(PSD-95,PSD-93，SAP-102和SAP-97)的成員調(diào)制，El-Husseini等[15]研究發(fā)現(xiàn)PSD-95的過度表達(dá)可以帶動谷氨酸突觸的成熟,它的表達(dá)可以增強谷氨酸受體的突觸聚集和活動,PSD-95突觸后的表現(xiàn)也增強了突觸前終端的成熟，PSD-95的表達(dá)也增加樹突棘的數(shù)量和大小，這些結(jié)果表明PSD-95的可編排突觸發(fā)展，提示了PSD-95在突觸穩(wěn)定和可塑性的重要角色。許多病理過程是用一種或多種突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體的故障相關(guān)聯(lián)，在PSD-95和NMDA受體的耦合與DA受體彼此間功能及調(diào)控功能中發(fā)揮重要作用。有研究顯示在紋狀體神經(jīng)元破壞D1R和PSD-95的相互作用會降低大鼠和獼猴模型的LID發(fā)展和嚴(yán)重程度[16]。突觸蛋白，包括受體被轉(zhuǎn)運、錨定，并通過PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其中最為明顯的特點是PSD-95聚集。PSD-95的提高可以改變突觸可塑性的可能性，它們可能是造成帕金森病和LID原因[12]。

圖5 Westernblot檢測NR2A(Y1325)水平的變化 與正常組比較,△P=0.033<0.05,與帕金森組比較,*P=0.040<0.05,與異動癥組比較,**P=0.686>0.05,與對照組比較,***P=0.001<0.01,與干預(yù)組比較,※P=0.229>0.05

圖6 Westernblot檢測NR2B(Y1472)水平的變化 與正常組比較,△P=0.006<0.01,與帕金森組比較,*P=0.010<0.05,與異動癥組比較,**P=0.666>0.05,與對照組比較,***P=0.001<0.01,與干預(yù)組比較,※P=0.071>0.05

PSD-95的S295的磷酸化可以通過慢性活動操作來調(diào)節(jié),S295位點的磷酸化水平反映了PSD-95的突觸強度，抑制S295的磷酸化會引起響應(yīng)于NMDAR處理引起的LTD,S295的磷酸化促進PSD-95和影響增強突觸的積累，而LTP的誘導(dǎo)化學(xué)(化學(xué)LTP)的刺激增加了S295的磷酸化[17]。PSD-95是突觸強度和可塑性的重要調(diào)節(jié)器，PSD-95的過度表達(dá)在培養(yǎng)的神經(jīng)元突觸增加AMPA受體集群和電流[15]。PSD-95的過表達(dá)增加了微型興奮性突觸后電流(mEPSCs)的頻率，影響LTD以及LTP和關(guān)閉AMPA受體突觸傳遞的驅(qū)動[18,19]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，外源性的輸入L-DOPA對6-OHDA制作的PD模型中，mTOR信號通路的激活影響到突觸骨架分子PSD-95的表達(dá)，并且產(chǎn)生明顯變化(One-Way ANOVA，P<0.05)，且骨架分子PDS-95與mTOR信號通路的激活成一致性；作為骨架分子的PSD-95發(fā)生變化，PSD-95以D1和NMDA受體三元蛋白復(fù)合物的形式，并整合增強兩種受體之間的的相互作用[12]，最新研究表明，抑制PSD-95蛋白表達(dá)能夠下調(diào)NMDA受體過度活化，從而提供了有利于LID的療法[20]。因此本研究驗證了LID中阻斷mTOR信號通路會導(dǎo)致PSD-95及其磷酸化的水平下降，而兩者都在突觸可塑性具有重要的作用，這可能是mTOR信號調(diào)控底物的磷酸化水平改變了PSD-95、S295的變化。這提示了激活mTOR信號通路的途徑可能依賴PSD-95以及S295的突觸活動引起LID，但是兩者之間具體如何相互整合突觸活動尚需進一步研究。

3.2mTOR與突觸可塑性關(guān)鍵分子NMDA受體亞基磷酸化水平與LID發(fā)病機制

DR和NMDA受體的功能性相互作用已被廣泛研究。眾多的研究表明，活化D1R或D2R的可調(diào)節(jié)NMDA受體的功能和轉(zhuǎn)運，例如，在紋狀體長時程增強(LTP)的誘導(dǎo)要求D1R的活化，D1R拮抗劑阻斷防止NMDA受體依賴性LTP，而這種效果是通過D1R的激活逆轉(zhuǎn)[21,22]。NMDAR的NR1亞基由單個基因的8個剪接變異體,NMDAR通過其NR1-C末端區(qū)域NR1-C2和NR1-C2拼接的豐富程度與D1R相互作用。NMDAR聚合物與D1R內(nèi)化誘導(dǎo)激動劑刺激相互作用，ERK的磷酸化(即激活)被限制于中型棘狀神經(jīng)元D1R的表達(dá)，并取決于D1R和谷氨酸NMDAR的伴隨刺激，然而負(fù)責(zé)該激活的D1R和NMDAR各自的發(fā)生的機制仍未明確[23]。D1R激動劑可以增加NR2B(Y1472)的磷酸化水平[24]。觸發(fā)NMDA受體的開放或關(guān)閉通常要受多種因子的影響，NMDA受體的磷酸化是其調(diào)控的最重要的機制之一[25]。

D1R和D2R激動劑-L-DOPA產(chǎn)生的運動障礙和類似的發(fā)病率已經(jīng)明確并具有嚴(yán)重性，而基底節(jié)谷氨酸傳輸信號通路異常已被證明是在PD和LID的發(fā)展的重要參與者[26,27]。激動劑D1R會增加整體NMDA受體NR1亞單位的磷酸化水平[28]。NR2A和NR2B積極的參與了突觸可塑性中的活動，置換NR2B與NR2A導(dǎo)致降低神經(jīng)元突觸的LTP[29]，與D1R互動進一步增加了NMDAR系統(tǒng)的復(fù)雜性。D1R的激活是對谷氨酸(NMDA、AMPA等)誘導(dǎo)的長時程增強的皮質(zhì)紋狀體突觸的生成至關(guān)重要，黑質(zhì)紋狀體多巴胺能投射到皮質(zhì)紋狀體接收運動信息的處理是非常重要的，在6-OHDA損毀大鼠中顯著改變了紋狀體的興奮傳導(dǎo),該途徑會導(dǎo)致類似于一些PD的癥狀等自發(fā)的變化[23]。從紋狀體切片皮質(zhì)纖維高頻刺激(HFS)產(chǎn)生的LTP中突觸電位會發(fā)生改變，興奮性突觸后電位(EPSP)通過刺激皮質(zhì)纖維誘發(fā)LTP，可能觀察到一些在PD中所表現(xiàn)的運動障礙[23,30]。谷氨酸(NMDA等)的動力學(xué)與D1R信號傳導(dǎo)級聯(lián)密切相關(guān)，多巴胺受體激動劑會促進紋狀體中的NMDA亞基NR1(Ser896)的磷酸化表達(dá)[31]。多巴胺D1R耦合PKA的活化誘導(dǎo)NMDA受體NR1磷酸化，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中絲氨酸896位點的磷酸化較為常見[32]。在紋狀體神經(jīng)元中可通過NR1亞基去磷酸化水平下調(diào)谷氨酸的活性[33]。慢性左旋多巴治療6-OHDA所致的PD大鼠模型中會影響NMDA受體各亞基成分的變化，而且NMDAR1磷酸化表達(dá)水平升高[34]。Ser896是在NR1亞基上的胞內(nèi)羧基端磷酸化位點上，該位點的磷酸化能夠調(diào)節(jié)NMDA受體的活性和易化突觸傳遞的作用。而NMDA受體的NR2A與NR2B兩個亞基在突觸可塑性中起著關(guān)鍵因素。

NMDA受體的活性是通過NR1亞基磷酸化的調(diào)制[35]。NMDANR2A亞單位Y1325磷酸化位點是主要的酪氨酸殘基之一[36]，其磷酸化水平被認(rèn)為是NMDA受體的活性的一個良好指標(biāo)，是調(diào)節(jié)突觸可塑性的關(guān)鍵步驟[37]。另外從突觸可塑性作為其關(guān)鍵分子，即從NMDANR1(ser896)磷酸化水平反應(yīng)NMDA受體細(xì)胞膜數(shù)量、NMDA受體的活性的一個良好指標(biāo)NMDANR2A(Y1325)以及NMDA受體最重要的NMDANR2B(Y1472)出發(fā)，突觸可塑性的許多分子，至于具體如何以怎么樣的突觸參數(shù)等去平衡紋狀體NMDA受體亞基磷酸化水平并降低LID發(fā)生的風(fēng)險，其尚需要進一步研究。在突觸后膜致密區(qū)(PSD)中NR2B是發(fā)生酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)的主要亞單位，其中Tyr1472是最重要的磷酸化靶位點[38,39]。

本研究發(fā)現(xiàn)，LID組的NMDA亞基磷酸化水平NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)的表達(dá)水平均為最高，其中在LID組和C組之間兩者比較無明顯差異(P>0.05)，雷帕霉素干預(yù)后NMDA亞基磷酸化水平NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。同樣，在實驗大鼠LID的模型中Gardoni等[40]研究發(fā)現(xiàn)在LID的發(fā)展過程中證實突觸NMDA受體通過使用一種細(xì)胞滲透性肽的組合物來調(diào)制NR2A亞基以致減少的大鼠LID的進程中所占比，也就是說預(yù)防含NR2A-NMDA受體的突觸異常激活足以確定具有一個顯著減少LID發(fā)病的作用；靶向離子型谷氨酸受體劑可改善PD的運動癥狀，以及降低LID的運動行為的發(fā)作[41]。NMDA受體過度活化并與LID緊密關(guān)聯(lián)，同樣選擇性NR2B亞基拮抗劑可以改善LID[42]。mTOR信號通路在突觸水平的失調(diào)有牽連PD的發(fā)病機制，在突觸水平適當(dāng)?shù)牟倏vAMPK/AKT/mTOR的信號是預(yù)防和治療PD的一個潛在策略[43]。

本實驗中也發(fā)現(xiàn)這一系列的突觸關(guān)鍵分子磷酸化水平的變化均與mTOR信號有關(guān)，這可能是mTOR信號調(diào)控底物的磷酸化水平改變了MDA亞基NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)磷酸化的表達(dá)水平，提示了激活mTOR信號通路可能不僅依賴PSD-95同時也依賴于關(guān)鍵分子NMDA受體亞基磷酸化一系列的突觸活動引起LID。

因此本研究發(fā)現(xiàn)：1、mTORC1參與了LID的發(fā)病，應(yīng)用mTOR特異性抑制劑雷帕霉素能夠緩解異動癥嚴(yán)重程度；雷帕霉素并不影響L-DOPA對PD的治療，這與以往的研究相符[44]；2、大鼠紋狀體區(qū)的mTOR信號通路激活與LID的發(fā)生密切，D1R受體過度活化，mTOR信號的激活對紋狀體的突觸分子具有調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致突觸可塑性的骨架分子PSD-95以及關(guān)鍵分子NMDA亞基的磷酸化表達(dá)水平升高，mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能依賴突觸分子PSD-95、NMDA受體NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)亞基磷酸化等的表達(dá)引起突觸活動過表達(dá)，使突觸可塑性發(fā)生適應(yīng)性改變，最終產(chǎn)生和維持皮質(zhì)紋狀體突觸“病理性LTP”，出現(xiàn)基底節(jié)信號異常，從而介導(dǎo)了LID的發(fā)生。

圖7 mTOR信號通路被激活管理L-DOPA及參與LID

總之，L-DOPA誘發(fā)運動障礙的突觸機制，是懸而未決的問題[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，從突觸可塑性的一些分子水平表達(dá)當(dāng)中得出mTOR信號通路激活異動癥組中大鼠PSD-95、NMDA受體亞基的磷酸化表達(dá)水平升高，經(jīng)特異性抑制mTOR信號后可以減輕LID癥狀并降低PSD-95、NMDA受體亞基的磷酸化表達(dá)水平，mTORC1參與LID的發(fā)病過程，而這過程中PSD-95、NMDA受體功能增強在“病理性LTP”產(chǎn)生中起重要作用，但是“病理性LTP”中的調(diào)控涉及到PSD-95、NMDA受體等到底是怎么整合的具體機制目前尚不清楚，有待進一步研究。

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(2015-11-12收稿2016-04-12修回)

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(項目編號為31260241)

【中圖分類號】R

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)03-0182-09