蛋白質(zhì)環(huán)化的研究進展

王心哲，張光亞

華僑大學(xué) 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門　361021

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蛋白質(zhì)環(huán)化的研究進展

王心哲，張光亞

華僑大學(xué) 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門361021

王心哲, 張光亞. 蛋白質(zhì)環(huán)化的研究進展. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(4): 430–439.

Wang XZ, Zhang GY. Advances in protein cyclization. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 430–439.

摘要:天然蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)主要以線性形式存在，由于多數(shù)蛋白質(zhì) (酶) 熱穩(wěn)定性較差，制約了其在工業(yè)催化、食品制造、醫(yī)藥領(lǐng)域的高效應(yīng)用。自然界中發(fā)現(xiàn)的天然環(huán)肽類物質(zhì)具有首尾相連的環(huán)化結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)具有較高的穩(wěn)定性，為改造酶的結(jié)構(gòu)、提高其熱穩(wěn)定性及拓寬其應(yīng)用范圍提供了新思路。本文根據(jù)國內(nèi)外在蛋白質(zhì)環(huán)化領(lǐng)域的新動態(tài)并結(jié)合本實驗室的研究，系統(tǒng)介紹了內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接、表達蛋白連接、轉(zhuǎn)肽酶催化的轉(zhuǎn)肽作用等幾種傳統(tǒng)蛋白質(zhì)環(huán)化方法，著重介紹了基于新型超強分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher介導(dǎo)的蛋白質(zhì)環(huán)化的研究。

關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì)反式剪接，表達蛋白連接，轉(zhuǎn)肽作用，光催化內(nèi)含肽，SpyTag/SpyCatcher

Received: June 19, 2015; Accepted: October 26, 2015

Supported b y: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21376103, 31201314), Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2013J01048), Subsidized Project for Cultivating Postgraduates’ Innovative Ability in Scientific Research of Huaqiao University.

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 21376103, 31201314)，福建省自然科學(xué)基金 (No. 2013J01048)，華僑大學(xué)研究生科研創(chuàng)新能力培育計劃資助。

眾所周知，蛋白質(zhì) (酶) 在生物體內(nèi)等溫和條件下能夠較好地發(fā)揮其生理作用。但隨著工業(yè)生產(chǎn)中酶的廣泛應(yīng)用，酶在工業(yè)條件 (如高壓、高溫、高機械強度、金屬離子、有機溶劑) 下，極易發(fā)生構(gòu)象改變從而失去活性的缺點也逐漸暴露。如何構(gòu)建既具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)又具有較高活性的酶成為研究者關(guān)注的焦點。較早前有研究者發(fā)現(xiàn)了大量天然合成的環(huán)肽[1-2]。這種環(huán)化結(jié)構(gòu)使得天然環(huán)肽類物質(zhì)具有較高的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，同時具有抗水解、在化學(xué)變性劑條件下能保持完整生物活性的特性[3]。隨著蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系研究的深入，環(huán)肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性為線性蛋白的改造以提高其穩(wěn)定性的研究奠定了基礎(chǔ)。有研究者建立了研究其序列結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫CyBase[4]，蛋白質(zhì)環(huán)化也隨之成為了以分子生物手段改造酶結(jié)構(gòu)的熱點之一。

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的折疊狀態(tài)(Folded state) 息息相關(guān)，研究表明，環(huán)化能夠降低蛋白折疊域與非折疊域的構(gòu)象熵，進而增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，同時可增加蛋白質(zhì)的受體親和力，其功能和活性幾乎不受影響[5-7]。蛋白質(zhì)骨架環(huán)化是一種將線性肽的C-端和N-端通過酰胺鍵進行首尾環(huán)合形成環(huán)狀分子的過程。隨著對分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)工程學(xué)的深入研究，已逐步建立起多種經(jīng)生物法獲得環(huán)狀蛋白的方法，其中較為常用的方法包括蛋白質(zhì)反式剪接(PTS)、內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白表達連接 (EPL)、蛋白酶催化的轉(zhuǎn)肽作用等[8]。

1　內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接作用 (Protein trans-splicing，PTS)

圖1　內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白剪接作用示意圖[10]Fig. 1　Sheme of cyclization by intein-mediated protein trans-splicing[10].

內(nèi)含肽是一種介導(dǎo)蛋白質(zhì)剪接的作用元件，蛋白質(zhì)內(nèi)含肽 (Protein-intein) 是指前體蛋白中的一段插入序列。根據(jù)自身結(jié)構(gòu)特征可將其分為3類：大型內(nèi)含肽 (Maxi-inteins)、小型內(nèi)含肽 (Minimal or mini-inteins) 和反式剪接內(nèi)含肽 (Trans-splicing inteins)。內(nèi)含肽既能夠作用于氨基末端也能作用于羧基末端，它在蛋白質(zhì)翻譯后的成熟過程中能夠進行自我催化，使自身從前體蛋白中切除，并將其兩側(cè)的多肽片段以肽鍵進行連接，形成成熟的蛋白質(zhì)[9]，其連接過程見圖1[10]。蛋白質(zhì)剪接 (Protein splicing)是由蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的在蛋白質(zhì)水平上翻譯后的加工過程。內(nèi)含肽在N-末端和C-末端剪接位點催化高度協(xié)調(diào)的反應(yīng)。該環(huán)化過程是一種分子內(nèi)程序，不需要其他蛋白和任何ATP等新陳代謝能源類物質(zhì)。

蛋白質(zhì)剪接的典型機制包括4個步驟：1) N-S或N-O?；嘏糯嫔嫌螏в絮ユI的肽鍵；2) N-外顯肽發(fā)生?；D(zhuǎn)移作用，重新定位到下游剪接位點，形成結(jié)合N-外顯肽的C-外顯肽酯鍵；3) 內(nèi)含肽C-末端的天冬酰胺殘基打破內(nèi)含肽和C-外顯肽之間的鍵進行環(huán)化；4) S-N或O-N酰基通過在下游剪接位點重排，通過肽鍵替換連接N-外顯肽的C-外顯肽之間的酯鍵[11-13]。在外顯肽的全部氨基酸殘基中，只有與C-末端外顯肽相連的第一個殘基參與整個剪接過程[14-15]。

Gottfried[16]研究小組對以內(nèi)含肽介導(dǎo)的末端環(huán)化的DnaB與天然線性的DnaB進行一系列蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白折疊率、構(gòu)象熵等參數(shù)的測定和比較。結(jié)果表明，與線性蛋白質(zhì)相比較，環(huán)化蛋白質(zhì)在變性條件下具有更強的穩(wěn)定性，并能夠通過環(huán)化來降低蛋白質(zhì)的解折疊率及蛋白解折疊域的構(gòu)象熵以增加其穩(wěn)定性。環(huán)化后的蛋白質(zhì)其解鏈溫度也相應(yīng)地有所提升。蛋白質(zhì)骨架環(huán)化帶來的構(gòu)象熵穩(wěn)定性可以顯著提高蛋白穩(wěn)定性，蛋白解鏈溫度的提升則取決于野生型蛋白非折疊域熵的大小以及蛋白質(zhì)解折疊時的熱容改變量，解鏈溫度的提升程度與該野生酶解折疊域熵的大小成反比。經(jīng)表征，環(huán)化的蛋白質(zhì)同時具有抗氨基和羧肽酶活性[17-18]。

隨著對內(nèi)含肽的深入研究，陸續(xù)有研究者發(fā)現(xiàn)了受光、溫度、pH、氧化還原狀態(tài)等外部因素調(diào)節(jié)控制的內(nèi)含肽。最近，加州大學(xué)Huiwang Ai實驗小組[19]將光控的半胱氨酸殘基用基因方法引入到念珠藻DnaE結(jié)構(gòu)域中，再將這種光激發(fā)的內(nèi)含肽插入到RFP和人酪氨酸激酶中，形成一種不活躍的嵌合蛋白。經(jīng)長波 (約為250–370 nm) 紫外光照射，發(fā)生光引發(fā)的光化學(xué)反應(yīng)，可以激發(fā)內(nèi)含肽，繼而引發(fā)蛋白剪接。這種由基因編碼的光控內(nèi)含肽是一種對蛋白質(zhì)初級結(jié)構(gòu)和功能研究有效的技術(shù)途徑。

圖2　光敏感性基團參與的蛋白剪接作用及內(nèi)含肽前體分離示意圖[20]Fig. 2　Sheme of protein splicing by the incorporation of a photolabile protecting group and the isolation of the unspliced precursor[20].

Henning D. Mootz研究團隊[20]也通過對蛋白骨架結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈的人工合成構(gòu)建了一種光激發(fā)型內(nèi)含肽，這種新型由基因編碼的光依賴型內(nèi)含肽通過在其結(jié)構(gòu)內(nèi)非催化結(jié)合位點引入鄰硝基芐基酪氨酸 (ONBY)——一種酪氨酸衍生物來獲得。該帶有“光控開關(guān)”的光敏感型內(nèi)含肽ONBY75-intein在波長為366 nm的紫外光照射4 min后即可誘發(fā)蛋白剪接作用的發(fā)生，繼續(xù)照射即可達到約70%的反應(yīng)率，并可通過His6標(biāo)記來分離純化內(nèi)含肽前體。其分離過程見圖2，在第一次實現(xiàn)了對多肽環(huán)化過程中內(nèi)含肽前體純化的同時，也實現(xiàn)了從成分復(fù)雜的細(xì)胞提取物中有效分離純化目標(biāo)多肽的目標(biāo)。實驗結(jié)果表明，此類由光催化的內(nèi)含肽引發(fā)的蛋白剪接作用既可在大腸桿菌也可在哺乳動物中發(fā)生，為其在生物體內(nèi)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[21-22]。

內(nèi)含肽對蛋白的剪接作用通常是一種不可控的過程，但這種新型的光誘導(dǎo)的內(nèi)含肽剪接作用具有時間和空間上的靈活性，將為環(huán)化提供可以根據(jù)需要來進行反應(yīng)的有利條件。同時，光激活內(nèi)含肽對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息和生化過程沒有過多的限制，可以直接從氨基酸序列水平對蛋白質(zhì)進行調(diào)控，實現(xiàn)了對完全由基因編碼蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)。這一突破性成果將給蛋白質(zhì)初級結(jié)構(gòu)和功能的研究帶來新的希望[19,23]。盡管如此，目前研究表明，還沒有發(fā)現(xiàn)任何一種能夠在所有的位點結(jié)合序列中均能起到催化PTS作用過程的內(nèi)含肽。由于PTS在作用過程中通常需要在結(jié)合位點附近存在幾個或多個突變結(jié)合部位，這一特性制約了PTS方法的通用性。若在PTS作用過程中能夠找到有特定序列的內(nèi)含肽，或在反應(yīng)過程中對內(nèi)含肽序列的位點選擇具有更大的隨機性的情況下，均能實現(xiàn)PTS在多種結(jié)合位點的有效連接，將使PTS的應(yīng)用具有更廣泛的前景[9]。

2　表達蛋白連接 (Expressed protein ligation，EPL)

EPL是一種以內(nèi)含肽為基礎(chǔ)的化學(xué)選擇性蛋白質(zhì)半合成方法，最早被報道于1998年，該方法通過改變裂解條件以及對內(nèi)含肽進行適當(dāng)修飾，利用蛋白剪接機制生成目標(biāo)蛋白重組體α-硫酯衍生物，再將N-末端自由的半胱氨酸殘基與C-末端α-硫酯片段進行連接，這些片段可進行共價修飾，在硫酯和半胱氨酸之間形成肽鍵，從而將兩種蛋白質(zhì)連接起來用于氨基酸位點特異性多肽的制備。后續(xù)也有研究者從溫度、pH、反應(yīng)時間、反應(yīng)結(jié)構(gòu)域比率等因素對EPL反應(yīng)發(fā)生的條件進行探索。實驗證明，在反應(yīng)域比率較低情況下，適當(dāng)添加少量尿素有助于提高連接效率，反應(yīng)域比率較高的情況下，連接效率自發(fā)提高，添加尿素失去了優(yōu)勢作用[24]。EPL可作為連接蛋白產(chǎn)物的同位素標(biāo)簽，被廣泛應(yīng)用于生物物理學(xué)探針特異性位點的引入、非天然氨基酸的合成以及翻譯后修飾途徑[25-28]。不僅如此，通過EPL還實現(xiàn)了對金屬蛋白中單個氨基酸功能的全面分析和蛋白質(zhì)功能的完善，這些金屬蛋白包含用來接受高度特異性金屬離子的結(jié)合位點，借以維持正常的生理功能。同時，可通過EPL法改變金屬離子的配位層(Coordination sphere)，以微調(diào)所需蛋白突變體的性質(zhì)[27]。

EPL相對于NCL (天然化學(xué)連接) 具有化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性以及合成的特異性。EPL合成法克服了DNA重組和異源蛋白表達等方法對蛋白大小和氨基酸數(shù)量的限制，將小型蛋白或片段進行聚合，可以實現(xiàn)結(jié)合非編碼氨基酸的目標(biāo)，可更高效地用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系[25,29]。目前，EPL已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一種較為穩(wěn)定的化學(xué)連接方法，但在研究開展前期，由于在蛋白表達階段細(xì)胞內(nèi)就會發(fā)生目標(biāo)蛋白與內(nèi)含肽間的自剪接作用，以及通過EPL方法得到最終蛋白連接產(chǎn)物步驟復(fù)雜，使影響蛋白產(chǎn)率的因素增多，以致目標(biāo)蛋白表達量較低[30]。研究表明較高的α-硫酯衍生物產(chǎn)率是得到高蛋白連接率的關(guān)鍵。Zhao等[27]通過對人載脂蛋白 (apoE) 的研究，使aopE以三聯(lián)結(jié)構(gòu)(Triple-labeled) 進行連接反應(yīng)，實現(xiàn)了對連接程序的簡化和連接率的提升。

3　轉(zhuǎn)肽酶A (Sortase A，SrtA) 催化的轉(zhuǎn)肽作用

1999年，Mazmanian等[31]首次對分離自金黃色葡萄球菌的SrtA進行了定義，SrtA是一種來源于革蘭氏陽性菌，能夠催化酰胺鍵合成的，能夠?qū)⒓?xì)胞表面蛋白共價結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)肽酶類。其在不同的細(xì)菌中具有不同的識別序列 (Motif)，如在金黃色葡萄球菌中可識別LPXTG序列，在釀膿鏈球菌中則能夠有效識別LPXTG/LPXTAA序列。SrtA可對LPXTG序列間的Thr和Gly進行切割，形成?；钢虚g化合物，進而與N-末端Gly殘基進行結(jié)合形成酰胺鍵。SrtA具有作用條件溫和，能夠與細(xì)胞表面結(jié)合的特點，在蛋白質(zhì)連接方面應(yīng)用潛力巨大[32]。

2004年，Mao等研究人員首次成功應(yīng)用SrtA實現(xiàn)蛋白連接。Proft將重組C-末端帶有LPETG-His6標(biāo)簽的綠色熒光蛋白 (GFP) 與多肽進行連接，并證實轉(zhuǎn)肽酶能夠催化天然多肽、非天然多肽及非多肽分子的連接。反應(yīng)時間為6 h，連接效率約為50%，反應(yīng)時間大于24 h后連接效率達90%以上[33]。

圖3　包含SrtA識別序列 (LVPTG) 的線性kB1經(jīng)SrtA催化的轉(zhuǎn)肽形成環(huán)狀kB1示意圖[34]Fig. 3　Scheme of the linear oxidized kB1 contains a SrtA recognition sequence (LPVTG) and undergoes a transpeptidation reaction catalyzed by SrtA to form cyclo-kB1[34].

富硫環(huán)肽類物質(zhì)具有酶穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定、抗化學(xué)攻擊等性能，因此在藥物設(shè)計方面具有較為廣泛應(yīng)用。Craik團隊[34]利用SrtA成功環(huán)化了多種小型富硫化物多肽，如Kalata B1 (圖3)、α-conotoxin Vc1.1 (α-芋螺毒素) 以及SFTI-1(向日葵胰蛋白酶抑制劑1) 等至少包含一個二硫鍵的多肽。其中SFTI-1是已知最小、最有效的蛋白酶抑制劑。研究表明，這種利用SrtA催化的環(huán)化反應(yīng)對目標(biāo)蛋白沒有結(jié)構(gòu)選擇性，即目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu)既可以是環(huán)狀也可以是線性。Wu等[35]成功利用SrtA催化了糖基磷酸酰肌醇 (GPI) 與綠色熒光蛋白 (GFP) 的連接。GPI錨定蛋白在許多生化途徑中均起重要作用，這一研究成果為合成大型復(fù)雜錨定蛋白提供了新途徑，同時也為GPI錨定位點和錨定蛋白的生物學(xué)研究提供了有效途徑。

Bolscher等[36]在對可促進再上皮化和傷口愈合組胺素的研究中，利用SrtA成功對其進行環(huán)化，相對于傳統(tǒng)化學(xué)方法約3%的組胺素產(chǎn)率，轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的環(huán)化可以使產(chǎn)物得率達到90%左右。且環(huán)化多肽摩爾分子活性 (Molar activity) 相對于線性多肽提高了近1 000倍。

此外，SrtA還可催化具有雙官能團的分子內(nèi)多肽和糖肽的從頭合成。相對于化學(xué)酶合成法，這種方法只要求目標(biāo)蛋白在N-、C-末端分別存在一個Gly殘基和一個短的信號肽。但這種方法的局限性在于多肽中必須包含LPETGG 及GG序列，從而能夠在轉(zhuǎn)肽酶作用下進行反應(yīng)。經(jīng)證實所有的連接產(chǎn)物中都包含有LPXTG序列，而這個序列對蛋白結(jié)構(gòu)和功能是否存在影響也是一個需要探明的重要問題[37]。

4　基于超強分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher的蛋白環(huán)化

隨著環(huán)肽類物質(zhì)對天然產(chǎn)物以及生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的重要作用被證實，通過內(nèi)含肽來介導(dǎo)蛋白質(zhì)剪接，以轉(zhuǎn)肽酶催化蛋白進行環(huán)化等非天然多肽的合成途徑對蛋白類物質(zhì)的改造研究取得極大進展。隨著環(huán)化蛋白與其線性蛋白相比具有更高的穩(wěn)定性、膜通透性等優(yōu)勢的顯露。找到更高效、更加具有突破性的方法手段以更好地實現(xiàn)環(huán)肽類物質(zhì)的從頭合成逐漸成為研究熱點，而新近發(fā)現(xiàn)的超強分子粘合劑則為蛋白的環(huán)化提供了全新的思路和研究方向。

圖4　纖連蛋白CnaB結(jié)構(gòu)中SpyTag/SpyCatcher反應(yīng)關(guān)鍵氨基酸結(jié)構(gòu)示意圖[39]Fig. 4　A cartoon of the key residues of SpyTag/ SpyCatcher for amide bond formation in CnaB2 shown in stick format[39].

Mark Howarth研究團隊[38]在2009年首次在革蘭氏陽性菌釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenes 菌毛蛋白 (Pilin) Spy0128中分離了帶有Lys殘基的Pilin-C和攜帶Asn的異構(gòu)肽鍵，實驗表明Lys能夠和Asn側(cè)鏈自發(fā)地進行共價結(jié)合。在后續(xù)的研究中，該實驗團隊從釀膿鏈球菌纖連蛋白CnaB2中分離了N-末端帶有Lys31、C-末端帶有Asp117的能夠進行自發(fā)共價結(jié)合的SpyTag/SpyCatcher，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖4[39]。該反應(yīng)能夠在短時間內(nèi)完成，并且不需要任何特異性物質(zhì)和離子進行催化，他們對這種自發(fā)共價結(jié)合反應(yīng)的條件進行了進一步驗證，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)的不同的pH、溫度、緩沖液以及去垢劑的條件下，反應(yīng)均能發(fā)生并具有優(yōu)良的重組表達效果[40-41]。為驗證這種共價結(jié)合反應(yīng)是否較容易發(fā)生逆反應(yīng)，該實驗小組將SpyCatcher與SpyTag-MBP進行共價結(jié)合反應(yīng)后，向反應(yīng)環(huán)境中加入大量的Cna從而捕獲自由的SpyCatcher，進行過夜培養(yǎng)。實驗結(jié)果表明，SpyTag-MBP結(jié)構(gòu)沒有減少，也沒有Cna多肽-SpyCatcher復(fù)合物的產(chǎn)生。經(jīng)實驗表征，共價結(jié)合的SpyTag/SpyCatcher異構(gòu)肽鍵一經(jīng)形成即具有極強的化學(xué)穩(wěn)定性和耐高溫等特性。這種能夠在多種環(huán)境條件下均能自發(fā)反應(yīng)形成的異構(gòu)肽鍵將為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究提供更穩(wěn)定可靠的研究模板。

為了探究這種超強分子粘合劑SpyTag/ SpyCatcher的共價結(jié)合對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、熱穩(wěn)定性及蛋白生物活性的影響，該實驗團隊通過基因融合，將含13個氨基酸的SpyTag與β-內(nèi)酰胺酶N-末端連接，將分子量約為15 kDa的SpyCatcher與C-末端連接，使β-內(nèi)酰胺酶自發(fā)環(huán)化，其環(huán)化過程見圖5[42]。

圖5　SpyTag/SpyCatcher介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶環(huán)化過程示意圖[42]Fig. 5　A cartoon of the SpyTag/SpyCatcher-mediated cyclization of β-lactamase (BLA)[42].

通常情況下該野生型酶在約37 ℃的條件下發(fā)生聚集失活，環(huán)化后的β-內(nèi)酰胺酶熱穩(wěn)定性得到較大提升。為驗證該方法是否適用于其他酶類，后續(xù)對通過該方法環(huán)化的二氫葉酸還原酶 (DHFR) 進行了熱穩(wěn)定性的測定，結(jié)果表明，在100 ℃的條件該酶仍然具有催化活性且反應(yīng)收率很高。通過SpyTag/SpyCatcher共價結(jié)合的方法較點突變及其他環(huán)化途徑對酶熱穩(wěn)定性具有較大幅度提高。SpyTag/SpyCatcher對酶進行環(huán)化以期改造其熱穩(wěn)定性，為酶的改造、提高其生物活性提供了新思路和方法，但該方法通用與否仍亟待深入研究[42]。

本課題組近年來一直致力于SpyTag/SpyCatcher的研究，成功構(gòu)建了基于超強分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher構(gòu)建“Y型”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的雙酶，并以ELPs為純化標(biāo)簽實現(xiàn)雙功能酶分離純化及固定化的集成；利用SpyTag/SpyCatcher成功構(gòu)建了三臂ELPs，其性狀與線性ELPs有較大差異，有望應(yīng)用于一些新的領(lǐng)域。最近，本課題組成功在地衣多糖酶兩端分別融合SpyTag和SpyCatcher，在溫和條件下能自發(fā)共價結(jié)合實現(xiàn)酶分子環(huán)化。經(jīng)實驗證實，與線性地衣多糖酶相比，環(huán)化后的地衣多糖酶的溫度穩(wěn)定性有顯著提高，其最適反應(yīng)溫度由55 ℃提高到了60 ℃左右，且最適反應(yīng)溫度范圍有了大幅提高。在100 ℃煮沸10 min后，環(huán)化的地衣多糖酶酶活回收率較線性相比提高了將近4倍。經(jīng)一系列酶活性、聚合溫度以及高溫冷卻后酶活力恢復(fù)情況的測定，證實利用SpyTag/SpyCatcher能夠高效實現(xiàn)地衣多糖酶環(huán)化，在高溫等條件下，也保有相對較高的酶活力。該方法簡單易行，能夠自發(fā)反應(yīng)，且共價結(jié)合較穩(wěn)定。然而，在該過程中引入了新的基團，它是否會影響酶與底物的親和力？在熱穩(wěn)定大幅度提高的同時，酶學(xué)性質(zhì)及活力是否受到不利影響？其影響機制以及如何高效構(gòu)建拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)合理的環(huán)化酶等問題仍有待深入研究，本課題組將會持續(xù)探究。

5　總結(jié)與展望

隨著對環(huán)狀多肽/蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，越來越多的重要生物學(xué)功能被發(fā)現(xiàn)，用來改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效分子生物學(xué)方法不斷地被優(yōu)化以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、酶學(xué)活性等。這些新的蛋白合成途徑成功地替代了化學(xué)合成方法，為分子改造提供了新的改造手段。研究表明利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白剪切作用，表達蛋白連接作用以及蛋白酶催化的轉(zhuǎn)肽作用都能夠有效地實現(xiàn)蛋白的環(huán)化以提高其熱穩(wěn)定性以及對化學(xué)物質(zhì)、變性條件的耐受性。在過去幾十年里，研究者們探索和改進了多種蛋白環(huán)化方法。上述方法也都具有各自的優(yōu)缺點，在實際應(yīng)用時，需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的特性選擇合適的環(huán)化方法。表1列舉了幾種蛋白環(huán)化方法的應(yīng)用實例及各種方法的特性。

表1　蛋白環(huán)化的方法特點比較Table 1　Characters of the cyclization methods

與此同時，一些更有效、更簡便的方法也逐漸走入研究者的視野。SpyTag/SpyCatcher在酶環(huán)化中的應(yīng)用，其反應(yīng)的自發(fā)性、高效性給蛋白環(huán)化帶來了新突破，值得深入研究。

此外，最近兩年，一種相對于傳統(tǒng)內(nèi)含肽剪接方法具有時間及空間靈活性的光催化內(nèi)含肽作用也受到了蛋白質(zhì)環(huán)化領(lǐng)域的極大關(guān)注。該過程可以直接從氨基酸序列水平對蛋白質(zhì)進行調(diào)控，進而實現(xiàn)光對完全由基因編碼蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)，由于在大多數(shù)蛋白中均存在Cys，因此該方法具有普遍有效性且高效。與傳統(tǒng)方法相比，該方法不僅可以規(guī)避對細(xì)胞內(nèi)組分的干擾，而且能有效抑制產(chǎn)物毒性。這種能夠直接從氨基酸序列水平對蛋白進行調(diào)控的方法為蛋白質(zhì)環(huán)化的研究提供了新方向。接下來蛋白環(huán)化研究的重點應(yīng)該圍繞增強環(huán)化蛋白的穩(wěn)定性，找到更快速、簡單且對蛋白本身結(jié)構(gòu)和功能影響較小的環(huán)化途徑來開展。隨著對蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究的深入以及酶活性和穩(wěn)定性的研究的進行，相信在不久的將來，一定能夠克服目前幾種蛋白環(huán)化方法的缺陷和不足，使環(huán)化蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性更接近于天然環(huán)肽。環(huán)化酶在工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用一定會取得更多突破性進展。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

動物及獸醫(yī)生物技術(shù)

Advances in protein cyclization

Xinzhe Wang, and Guangya Zhang
Department of Bioengineering and Biotechnology, Huaqiao University, Xiamen 361021, Fujian, China

Abstract:Proteins, which exist mainly in linear form in vivo, are easily affected by the change of ambient temperature and pH. The application of proteins (enzymes) in the fields of industrial catalyzing, food manufacturing and medicine are restricted due to their properties. The cyclic structure of natural cyclic peptides confers high thermal stability on itself; such mechanism can be referred to in further enhancement of the thermal stability and transformation of the structure of enzymes. This article reviewed the latest progress in the domestic and international studies on protein cyclization andsummarized the traditional methods (such as protein trans-splicing, expressed protein ligation and sortase-catalyzed transpeptidation) in protein cyclization. A novel method based on SpyTag/SpyCather-mediated enzyme cyclization was discussed in more detail.

Keywords:protein trans-splicing, expressed protein ligation, sortase-catalyzed transpeptidation, photocontrol intein, SpyTag/SpyCatcher

DOI:10.13345/j.cjb.150284

Corresponding author:Guangya Zhang. Tel: +86-592-6162302; E-mail: zhgyghh@hqu.edu.cn