小尾寒羊TGF-β3基因在同期發(fā)情處理過程中的表達分析

馬　瑞,許立勝，殷茂軍，陳　軍，許文海

(1.靖邊縣畜牧局草原工作站,陜西 榆林 718500；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院)

小尾寒羊TGF-β3基因在同期發(fā)情處理過程中的表達分析

馬瑞1,許立勝1，殷茂軍1，陳軍1，許文海2

(1.靖邊縣畜牧局草原工作站,陜西 榆林 718500；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院)

摘要：為了探索胚胎移植過程中妊娠率的根本原因。本研究以高繁殖力小尾寒羊為試驗對象,采用公認(rèn)的CIDR結(jié)合外源激素處理使其同期發(fā)情，與自然發(fā)情及乏情的小尾寒羊作對比，分析了轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3基因在卵巢細(xì)胞中的表達差異，同時對其啟動子區(qū)的甲基化島進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),自然發(fā)情綿羊和外源激素處理發(fā)情的羊在發(fā)情表現(xiàn)和時間上無明顯差別,但是TGF-β3基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上自然發(fā)情綿羊顯著高于外源激素處理發(fā)情的羊,而同期處理發(fā)情的羊顯著高于乏情期綿羊卵巢細(xì)胞內(nèi)的表達。自然發(fā)情和激素處理的綿羊TGF-β3基因啟動子甲基化水平分別為25.8%和53.3%，而乏情期綿羊TGF-β3基因啟動子處于超甲基化水平達到70.0%。以上結(jié)果說明外源激素處理的同期發(fā)情小尾寒羊盡管在發(fā)情表現(xiàn)、時間等與自然發(fā)情的綿羊類似，但是胚胎發(fā)育和著床重要調(diào)控基因TGF-β3的表達和甲基化模式存在顯著性差異這也許是目前胚胎移植后著床率低下的原因之一。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)化生長因子；小尾寒羊；同期發(fā)情；基因表達

轉(zhuǎn)化生長因子B(transforming growth factors-β, TGF-βs)是一組多效性細(xì)胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，主要有卵巢組織分泌?？梢哉{(diào)節(jié)卵巢的生長和分化，促進卵母細(xì)胞的成熟、受精以及胚胎的分化、凋亡和著床。TGF-β家族在反芻動物胚胎形成到著床后30 d都能表達，體外采用無血清法培養(yǎng)山羊胚胎，TGFβ3能顯著增加桑葚胚和囊胚形成率，并且提高了胚胎抗凍性能。但至今未見TGFBs在超排動物上的研究報道。由于小尾寒羊體格高大,難產(chǎn)率低，并且相對較容易飼養(yǎng)管理，成為我國綿羊胚胎移植技術(shù)中首先的受體羊。因此，本文以小尾寒羊為試驗動物，重點研究同期發(fā)情處理后卵巢組織TGF-β3基因mRNA水平變化及與啟動子印跡區(qū)甲基化水平之間的關(guān)系，闡明胚胎移植過程中導(dǎo)致胚胎低著床率的關(guān)鍵因素，為提高小尾寒羊作為受體動物的受胎率提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1試驗動物和主要試劑

同等條件下選取18只發(fā)情周期正常的成年小尾寒羊，6只用作同期處理(EST,estrus synchronization treatment)，6只作為自然發(fā)情的對照(Natural estrus control,NEC)，另外6只作為乏情羊(Anestrus,ANE)。同期處理按照目前國內(nèi)公認(rèn)的方法，即CIDR+PMSG法，第1 d放栓，第12 d肌肉注射PMSG，第13 d撤栓并且開始觀察發(fā)情表現(xiàn)。

試劑主要包括TRIZOL RNA 提取試劑盒、熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT-PCR Kit、Taq DNA聚合酶和EpiMethy DNA甲基化檢測試劑盒等。

1.2樣品采集

將各組羊頸動脈放血致死，打開腹腔，取出卵巢，一部分進行蛋白分離；另一部分迅速放入液氮中冷凍，用于進一步提取RNA。

1.3PCR引物的設(shè)計與合成

用引物設(shè)計軟件Primer Premier 6.0對TGF-β3基因mRNA序列(GenBank號：NC_019464的CDS區(qū))設(shè)計引物；選擇β-actin(GenBank號：U39357)為內(nèi)參基因。所有引物由大連TAKARA公司合成。TGF-β3上游引物5'-AACTTTGCCACGGTCAGC-3', 下游引物5'-TCGGGTGCTGTTGTAAAGA -3'，產(chǎn)物大小186bp；β-actin上游引物5'-TGACGTCGACATCCGCAAAG-3'下游引物5'-GGAGCCGCCAATCCACAC-3'產(chǎn)物大小179bp。

1.4總RNA的提取、cDNA合成及RT-PCR

采用Trizol RNA提取試劑盒提取卵巢總RNA，每個樣品取約0.2 g，邊添加液氮邊勻漿，具體操作按試劑說明書進行。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，并用核酸蛋白測定儀測定其濃度及純度。最后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA合成CDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為25 μL,然后采用RT-qPCR試劑盒進行熒光定量PCR，反應(yīng)總體積為50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 1 min, 然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s, 72 ℃ 45 s 30個循環(huán)。每個樣品做3個重復(fù)，用相對定量法計算TGF-β3基因表達量。

1.5Western blot

在低溫下將卵巢組織進行勻漿研磨，SDS蛋白裂解液(25 mmol/L H E PE S,4 nmol/L E D TA,10 g/L SDS,25 nmol/L NaF, 1 mmol/L Na3VO4; 10mmol/L sodium PyroPhosPhate, 1 mmol/PMSF)冰上裂解細(xì)胞2 0 min , 超聲波粉碎5 s×4次, 4 ℃,12 000 g 離心30 min , 采用BCA法對蛋白樣品進行定量, 用蒸餾水將蛋白樣品調(diào)成相同濃度, 加入相同體積上樣緩沖液, 沸水煮5 min 進行蛋白變性。

Westernblot 每個樣本取等量蛋白(約50 μg )進行SDS-PAGE 凝膠電泳, 電壓00 V,2.5 h, 電泳后將蛋白轉(zhuǎn)膜, 電壓50 V,2 h, 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜,TBS洗3次, 加入兔抗TGF-β3抗體(1∶1 000)室溫2 h, TTBS洗3次, 然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體(1∶5000)室溫2 h, TTBS洗后用ECL顯色。以同一樣本的β-atin 作為內(nèi)參。結(jié)果通過SpectrumSee凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.6TGF-β3基因啟動子區(qū)甲基化水平分析

根據(jù)生物信息學(xué)分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview)，發(fā)現(xiàn)綿羊TGF-β3基因啟動子區(qū)僅有1個甲基化島，共12個CpG位點，利用在線軟件http://www.urogene.org/methprimer/對該甲基化島序列設(shè)計特異性亞硫酸氫鹽測序引物，共有5對引物供參考，試驗過程中選擇第三對，即上游引物5'- TAAGAGGTAGTTTTTGATTGTTTGG-3'，下游引物5'- CCAAAAAAATACCCACATTATACAC-3',產(chǎn)物長度為180 bp。利用常規(guī)方法提取不同羊卵巢基因組序列，采用EZ DNA Methylation-DirectTM 試劑盒(貨號：zymo.D5005)對提取的基因組進行轉(zhuǎn)換處理，然后用Zymo TaqTM DNA Polymerase (貨號:A1003-25)試劑盒對轉(zhuǎn)換的基因組進行擴增，PCR條件為94 ℃ for 4 min，再94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s 共35個循環(huán)，最后提純PCR產(chǎn)物，并測序。甲基化CpG位點占該甲基化島總CpG位點的百分比為甲基化水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

試驗結(jié)果均以mean±SD表示, 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對各組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析, 每個試驗均重復(fù)3次。統(tǒng)計學(xué)上P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA樣品完整性檢測

為了證明提取的總RNA能滿足后續(xù)試驗的要求，先對其進行高壓快速電泳。本試驗隨機從每組選兩個樣品進行，取0.5 μg樣品RNA，補水至總體積約5～10 μL，再加入適量loading buffer及EB混合，進行1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察條帶并照相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取的總RNA樣品28S和18S兩條帶清晰、完整，無彌散(如圖1)。說明提取的總RNA樣品沒有發(fā)生降解，完整性好，完全能滿足后續(xù)試驗的需要。

圖1　卵巢細(xì)胞總RNA完整性檢測

注釋：1～2為自然發(fā)情羊卵巢組織；3～4為激素同期處理發(fā)情羊卵巢組織；5～6為乏情羊卵巢組織。

2.2TGF-β3基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達

采用常規(guī)的熒光染料嵌入法對TGF-β3基因進行定量分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，采用激素處理后發(fā)情小尾寒羊卵巢細(xì)胞內(nèi)TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于自然發(fā)情羊TGF-β3基因的轉(zhuǎn)錄水平 (P<0.05)；乏情期羊TGF-β3的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于同期發(fā)情處理的小尾寒羊TGF-β3基因轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)。

2.3TGF-β3基因在蛋白水平的表達

由于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3的功能主要表現(xiàn)在蛋白水平上。因此，進一步采用Western blot技術(shù)進行了蛋白表達分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β3蛋白在自然發(fā)情小尾寒羊卵巢細(xì)胞內(nèi)表達最高(圖3A 和3B)，盡管采用同期處理的小尾寒羊卵巢細(xì)胞內(nèi)TGF-β3蛋白表達水平顯著高于(P<0.05)乏情期綿羊卵巢細(xì)胞的水平，但是仍然顯著低于自然發(fā)情的綿羊(P<0.05)。說明激素處理受體母羊后,即使其發(fā)情癥狀相似,但是卵巢細(xì)胞內(nèi)TGF-β3基因在蛋白水平上的表達存在顯著性差異。

圖2　 轉(zhuǎn)化生長因子基因TGF-β3在轉(zhuǎn)錄水平

的表達分析結(jié)果注釋：不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.05; P<0.01)。

圖3　轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3基因的Western blot圖

注釋：1為激素同期處理發(fā)情期羊卵巢組織；2為自然發(fā)情期羊卵巢組織；3為乏情期羊卵巢組織。

圖4　轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3基因在蛋白水平的表達分析

注釋：不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.4TGF-β3基因啟動子甲基化CpG水平

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)綿羊轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3基因啟動子區(qū)含有唯一1個甲基化島，包含12個CpG位點(圖5)；經(jīng)過亞硫酸氫鹽測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)小尾寒羊自然發(fā)情時TGF-β3基因啟動子區(qū)甲基化水平僅有25.8%；采用外源激素同期處理的羊該基因啟動子區(qū)甲基化水平為53.3%，而處于乏情時的小尾寒羊TGF-β3基因啟動子甲基化水平最高(70.0%)。

圖5　 綿羊轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3啟動子區(qū)CpG島圖

自然發(fā)情(25.8%)　　　同期處理(53.3%) 　　　乏情綿羊(70.0%)

圖6 轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3基因啟動子區(qū)甲基化水平

3討論

胚胎移植技術(shù)經(jīng)過幾十年的發(fā)展和完善，廣泛應(yīng)用于牛、羊等家畜的擴繁，在我國得到了交大的推廣和應(yīng)用。羊是季節(jié)性發(fā)情動物，生殖活動受到生殖激素的調(diào)節(jié)與影響，當(dāng)內(nèi)源生殖激素不足以使卵巢活動時，應(yīng)用外源激素促使發(fā)情可達到理想的效果，即同期發(fā)情處理。同期發(fā)情技術(shù)的應(yīng)用，可實現(xiàn)不同生理階段的羊群集中發(fā)情、配種、產(chǎn)羔、育肥、出欄，有助于實現(xiàn)集約化的生產(chǎn)方式。而我國小尾寒羊具有體格高大，易飼養(yǎng)，抗病率強等特點，是其他品質(zhì)綿羊無法比擬的。因此，在大規(guī)模綿羊胚胎移植過程中是一種理想的受體綿羊。但是胚胎移植后胚胎在子宮內(nèi)的著床及隨后的胚胎發(fā)育是影響胚胎移植成功率的關(guān)鍵所在。目前,小尾寒羊作為受體綿羊的妊娠率約為75%，產(chǎn)羔率約為60%，仍然顯著低于自然情況下綿羊的妊娠率90%和產(chǎn)羔率80%。國內(nèi)外許多研究已經(jīng)證明轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3基因在卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育甚至著床過程中起著重要的調(diào)控作用。

啟動子區(qū)域DNA甲基化(CpG位點中胞嘧啶第5位碳原子的甲基化)是一種重要的表觀遺傳修飾機制，為基因沉默與開啟提供了基因組水平的調(diào)控方式。一般而言，低甲基化的DNA與活躍的染色質(zhì)相關(guān)，而高甲基化的DNA則與不活躍的染色質(zhì)相關(guān)。

本研究以小尾寒羊為試驗材料,采用公認(rèn)的CIDR結(jié)合外源激素處理使其同期發(fā)情，與自然發(fā)情的小尾寒羊作對比，利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量RT-PCR和Western blot技術(shù)研究TGF-β3基因在卵巢細(xì)胞中的表達差異，探索胚胎移植過程中低著床率的根本原因；同時將乏情期的小尾寒羊做對比，更有利于說明TGF-β3基因在發(fā)情不同階段的表達差異，為今后闡明胚胎著床機理以及提高胚胎移植率奠定基礎(chǔ)。自然發(fā)情綿羊和外源激素處理發(fā)情的羊在發(fā)情表現(xiàn)和時間上無明顯差別，這可能與促卵泡素和雌激素的水平有關(guān)。利用熒光定量RT-PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果表明，在TGF-β3基因mRNA表達量在自然發(fā)情羊卵巢顯著高于同期處理羊，并且它們顯著高于在乏情期綿羊卵巢細(xì)胞內(nèi)的表達。由于TGF-β3最終起作用是發(fā)生在蛋白水平，因此我們進一步采用蛋白雜交技術(shù)對蛋白的表達進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激素處理的同期發(fā)情羊卵巢細(xì)胞內(nèi)的TGF-β3蛋白表達量顯著高于乏情期綿羊，但是仍然顯著低于自然發(fā)情期綿羊卵巢細(xì)胞的表達。說明激素處理受體母羊后,即使其發(fā)情癥狀相似,但是卵巢細(xì)胞內(nèi)TGF-β3基因在蛋白水平上的表達存在顯著性差異。

采用亞硫酸氫鹽測序發(fā)現(xiàn)TGF-β3基因啟動子區(qū)的CpG島在3種綿羊卵巢細(xì)胞中也存在明顯的差異。自然發(fā)情的綿羊卵巢細(xì)胞TGF-β3基因啟動子甲基化水平最低，而乏情綿羊卵巢細(xì)胞中甲基化水平最高，從表觀遺傳學(xué)上說明了外源激素處理的小尾寒羊與自然發(fā)情綿羊仍然具有一定的差異。

以上結(jié)果說明:(1)外源激素處理的同期發(fā)情小尾寒羊盡管在發(fā)情表現(xiàn)、時間等與自然發(fā)情的綿羊類似，但是其卵巢生理環(huán)境有明顯的差別；(2)轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β3基因無論在轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平在綿羊卵巢內(nèi)的的表達是一致的；(3)同期發(fā)情處理的綿羊卵巢TGF-β3基因啟動子區(qū)甲基化修飾程度顯著高于自然發(fā)情綿羊，這與該基因的表達有直接的關(guān)系；(4)小尾寒羊作為綿羊胚胎移植過程中的受體羊，TGF-β3基因啟動子區(qū)高甲基化修飾及其在蛋白水平的低表達可能是目前胚胎移植后著床率低下的原因之一。

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Expression Analysis of TGF-β3 Gene in the Process of Estrus Synchronization for Small-Tail Han Sheep

MA Rui1,XU Li-sheng1,YIN Mao-jun1, CHEN Jun1, XU Wen-hai2

(1.JingbianCountyGrasslandWorkstationofAnimalHusbandryBureau,YulinShaanxi718500；2.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity)

Abstract:In order to explore the underlying reason of pregnancy rate after embryo transplantation, Small-tail han sheep with high fertility were used as experimental animals in this study, and exogenous hormones and CIDR were used to make synchronize estrus. Compared with natural oestrous and anestrous Small-tail han sheep, the expression difference of transforming growth factor-beta 3 (TGF-β3) gene in ovarian cells and the methylation levels of TGF-β3 promoter was analyzed. The results showed that there was no significantly difference in estrus performance and time between natural oestrous sheep and treated oestrous sheep by exogenous hormones,but in the transcription level and protein level of TGF-β3 gene, natural oestrous sheep was significantly higher than treated oestrous sheep by exogenous hormones, and treated oestrous sheep by exogenous hormones were significantly higher than that of anestrous sheep. The methylation levels of TGF-β3 gene promoter were 25.8% and 53.3% in natural oestrous sheep and treated oestrous sheep by exogenous hormones, respectively. While in anestrous sheep the supermethylation level was 70.0%. These results suggested that treated oestrous sheep by exogenous hormones in estrus performance and time were similar to natural oestrous sheep,but it was important to regulate embryo development and implantation in the expression and methylation pattern of TGF-β3 gene. And there were significantly different between them, which may be one reason resulting in the low implantation rate after embryo transplantation.

Key words:transforming growth factor；Small-tail han sheep；estrus synchronization；gene expression

[收稿日期]2015-09-17

[基金項目]國家自然基金青年基金項目(31101682)

[作者簡介]馬瑞(1969-)，男，陜西靖邊人，本科，主要從事優(yōu)質(zhì)牧草的培育及高效利用等方面工作。

[中圖分類號]S 188

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1004-6704(2016)01-0024-05