星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化五味子木脂素的提取工藝

李平， 李小芳，向志云，李培培，周維，羅開沛

?

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化五味子木脂素的提取工藝

李平， 李小芳，向志云，李培培，周維，羅開沛

［摘要］目的：優(yōu)選五味子治療失眠有效部位的提取工藝。方法：采用單因素試驗考察回流提取時間、乙醇體積分數(shù)、溶劑用量、提取溫度、提取次數(shù)等對五味子總木脂素含量的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上選取乙醇體積分數(shù)、乙醇用量、提取時間為考察因素，每個因素設(shè)置5個水平，以總木脂素得率為評價指標，利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選回流提取工藝。結(jié)果：五味子治愈失眠有效部位的最佳回流提取工藝為乙醇體積85%、乙醇用量3倍、提取時間49 min、提取次數(shù)1次。結(jié)論：優(yōu)選的回流提取工藝簡便易行，預(yù)測性良好，為五味子后續(xù)的劑型開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］五味子；有效部位；總木脂素；星點設(shè)計-效應(yīng)面法

［作者單位］成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

Tel:18428319627 Email:996814977@qq.com.

Email:lixiaofang918@163.com

五味子具有益氣滋腎、生津止渴、寧心安神功效［1］，臨床用于治療心悸、失眠、多夢、津傷口渴、消渴［2］，其改善睡眠的主要有效成分為木脂素類［3］。目前對五味子多糖的研究報道較多，而對其木脂素活性成分的研究報道相對較少。本實驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，以總木脂素得率為指標，利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選五味子治愈失眠的有效部位的回流提取工藝［4］，為后續(xù)的劑型開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料

水浴鍋，UV-6000型紫外-可見分光光度計；DZG-6020型真空干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）、BP211D AG型電子天平（德國Satorius）；UPT-I-10T型超純水器（成都超純科技有限公司）；DEY-300型搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；SB-5200DT型超聲儀（200W，40 KHz；寧波新芝生物科技股份有限公司）。五味子飲片（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為五味子科植物五味子Schisandra chinensis.的成熟果實）；五味子乙素對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：Must-14041606）；所用試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取五味子乙素對照品1.9 mg，置于20 mL量瓶中，加95%乙醇使溶解并定容至刻度，即得。

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取五味子粗粉約2 g，精密稱定，置于150 mL燒瓶中，精密加入60%乙醇溶液20 mL，在90 ℃水浴鍋內(nèi)加熱回流1 h，濾過，取續(xù)濾液，取適量用95%乙醇定容至一定刻度即得。

2.1.2 線性關(guān)系考察 利用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在278 nm處有最大吸收［5］。精密吸取對照品溶液1，2，3，4，5 mL，分別置于5 mL量瓶中，各加入95%乙醇并定容至刻度，于278 nm處測定吸光度（A），以A為橫坐標，質(zhì)量濃度為縱坐標，得回歸方程Y=8.847X+0.003（r =0.9995），線性范圍0.019～0.095 mg.mL-1。

2.1.3 精密度試驗 精密量取五味子乙素對照品溶液2 mL，按“2.1.2”項下連續(xù)測定6次，結(jié)果A的RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液2 mL，分別于0，5，10，15，20，25 h按“2.1.2”項下方法測定，結(jié)果A的RSD 為0.95%，表明供試品溶液至少在25 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取同一份五味子提取液，按“2.1.1”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.2”項下方法測定，結(jié)果總木脂素提取率的RSD為 1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗 精密稱取已知提取率的同一五味子提取液6份，每份1 mL，各加入已精密量取的五味子乙素對照品溶液1mL，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法測定A，計算平均加樣回收率，見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

由表可知，平均加樣回收率為1.25%。

2.2 單因素試驗考察

選取提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)、溶劑用量等為考察因素，每個因素各設(shè)5個不同水平，分別稱取五味子飲片1 g進行提取工藝考察。

2.2.1 提取時間 規(guī)定提取溫度90 ℃，乙醇體積分數(shù)70%，料液比1:10，選取提取時間為30，60，90，120，150 min的5個水平分別進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總木脂素對應(yīng)的A隨提取時間的改變而呈現(xiàn)一定的變化，并在150 min時A最低，30 min時A最高。

2.2.2 乙醇體積分數(shù) 固定提取溫度90 ℃，提取時間30 min，料液比1:10，選取乙醇體積分數(shù)為30%，50%，70%，80%，90%的5個水平分別進行考察，結(jié)果可知當乙醇體積分數(shù)70%時，總木脂素有最大A。2.2.3 溶劑用量 固定提取溫度90 ℃，提取時間30 min，乙醇體積分數(shù)70%，選取料液比1:10，1:14，1:18，1:22，1:26的5個水平分別進行考察，結(jié)果顯示當料液比1:10時總木脂素有最大A，之后A隨比值的變小而變小，故選擇10倍量的溶劑用量。

2.2.4 提取溫度 固定提取時間30 min，乙醇體積分數(shù)70%，料液比1:10，選取50，60，70，80，90 ℃共5個水平進行考察，結(jié)果顯示各溫度下測得的A變化不大，但當提取溫度為90℃時，總木脂素有最大A。

2.3 星點設(shè)計試驗［6］

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇提取時間、乙醇體積分數(shù)、溶劑用量進行三因素五水平的星點設(shè)計，以總木脂素得率為評價指標，利用效應(yīng)面法優(yōu)化五味子的提取工藝。因為提取次數(shù)為非連續(xù)變量，結(jié)合預(yù)實驗和參考文獻，將提取次數(shù)先暫定為1次。因素水平見表2，試驗安排與結(jié)果見表3。

表2 五味子有效部位回流提取工藝因素水平

表3 五味子有效部位回流提取工藝星點試驗安排

注：15～20號為重復(fù)實驗，結(jié)果用平均值表示。

2.3.1 統(tǒng)計分析 以總木脂素得率為因變量（Y），X1，X2，X3為自變量，采用Design-Expert8軟件進行多元線性回歸和二項式擬合，擬合模型，多元線性回歸：r=0.462，P=0.045＞0.01，模型不能通過檢驗，模型擬合度不高，預(yù)測性也不好，因此不采用線性模型擬合。二項式擬合復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.9372，P＜0.0001，各項方差分析結(jié)果見表4。從表4可以看出，各因素中一次項、二次項都具有顯著性差異，再次說明具體實驗因子對效應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。最后選擇二項式擬合模型為成功模型。

表4 五味子回流提取工藝多元二項擬合方程方差分析

2.3.2提取工藝的優(yōu)化與預(yù)測 根據(jù)已經(jīng)確定的方程為模型，固定3個自變量之一為中值，以總木脂素得率為因變量，繪制效應(yīng)面的三維圖，見圖1～3，結(jié)果得最優(yōu)工藝條件為提取時間49 min，乙醇體積分數(shù)為84.52%，乙醇用量為3.07倍。為便于實際操作，最后將參數(shù)確定為加3倍量的85%乙醇提取49 min。

圖1 表示乙醇體積分數(shù)和提取時間對總木脂素得率的影響

圖2 表示乙醇體積分數(shù)和用量對總木脂素得率的影響

圖3 表示乙醇用量和提取時間對總木脂素得率的影響

2.3.3 驗證試驗 按優(yōu)選的工藝條件進行3次驗證試驗，結(jié)果平均得率 30%，與預(yù)測值的偏差1.6%，實測值和預(yù)測值基本吻合說明建立的數(shù)學(xué)模型可靠，預(yù)測性良好。

3　討論

研究報道表明五味子木脂素類化合物具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗衰老、抗氧化等藥理活性［7］。五味子中木脂素類和揮發(fā)油類成分具有縮短潛睡期，改善睡眠作用，還有能抑制腫瘤細胞行為［8］。五味子中木脂素類成分的提取有采用水煎法、乙醚回流提取以及超聲提取法［9］。通過預(yù)實驗證明五味子木脂素類成分適宜用乙醇進行回流提取。利用乙醇對五味子粗粉進行回流提取，操作方便可控，且提取快速，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

［參考文獻］

［1］楊放，袁軍.付平五味子的研究概況［J］.華西藥學(xué)雜志，2003，18（6）:438.

［2］霍艷雙，陳曉輝，李康，等.北五味子的鎮(zhèn)靜催眠作用［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，22（2）:126.

［3］徐麗華，黃芳，孫萌，等.南北五味子鎮(zhèn)靜催眠活性部位共有成分的分析［J］.分析化學(xué)，2009，37（6）:828.

［4］田振坤，馬英麗，吳倫，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化北五味子果實提取工藝［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（23）:29.

［5］李霞，賈曉斌，陳彥，等.五味子提取工藝的優(yōu)化研究［J］.中國藥房，2007，18（6）:425.

［6］文怡靜，李小芳，劉玲，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化首烏藤微波提取工藝［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（23）:26.

［7］齊雁輝，趙彩玉.五味子的現(xiàn)代藥理作用研究進展［J］.中國醫(yī)藥指南，2011，9（26）:44.

［8］張朝波，柳燕，李林燕.南五味子總木脂素有效部位鎮(zhèn)靜催眠作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2011，27（1）:29.

［9］周玲，王學(xué)魁，沙作良.五味子木脂素超聲循環(huán)提取工藝條件的優(yōu)化［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報，2012，27（1）:14.

（責任編輯：傅舒）

Optimize the extraction process of Wuweizi lignans by central composite design - response surface methodology

LIPing， LI Xiao-fang， XIANG Zhi-yun， LI Pei-pei， ZHOU Wei， LUO Kai-pei//（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan）

［Abstract］Objective: To optimize extraction process of effective parts of Wuweizi for curing insomnia. Method: Singlefactor tests were adopted to investigate effects of extraction time， ethanol concentration， solvent dosage， extraction temperature and extraction times on contents of total lignans in Wuweizi. Based on single factor tests， ethanol concentration， solvent dosage and extraction time were used as factors （five levels for each factor）， then extraction process of effective parts in Wuweizi for curing insomnia was optimized by central composite design-response surface methodology with extraction efficiency of total lignans as evaluation indicator. Result: Optimum extraction process was as follows: extracted 49 min with 3 volumes of 85% ethanol at 90℃，1 time. Conclusion: Optimized extraction process is simple and feasible with good predictability. It can provide experimental evidence for formulations development and industrial production of Wuweizi.

［Key words］Wuweizi； effective parts； total lignans； central composite design-response surface methodology

［中圖分類號］R283.6

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-926X（2016）02-012-03

［作者簡介］李 平，在讀碩士研究生；研究方向：中藥新劑型及中藥新技術(shù)研究

［通訊作者］李 小芳，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新劑型及中藥新技術(shù)研究

［收稿日期］2015-01-07