FZD3基因和蛋白在大腸癌中的表達(dá)*

何　婉， 成志強(qiáng)， 黃思銓， 許瑞蓮， 譚文勇， 黃凱斌， 鐘克力， 陳亦欣， 陳明樂， 傅宇翔， 夏利剛**

(1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 深圳市人民醫(yī)院， 廣東 深圳　518020； 2.香港理工大學(xué)， 香港； 3.香港中文大學(xué)， 香港)

FZD3基因和蛋白在大腸癌中的表達(dá)*

何婉1， 成志強(qiáng)1， 黃思銓2， 許瑞蓮1， 譚文勇1， 黃凱斌1， 鐘克力1， 陳亦欣1， 陳明樂3， 傅宇翔1， 夏利剛1**

(1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 深圳市人民醫(yī)院， 廣東 深圳518020； 2.香港理工大學(xué)， 香港； 3.香港中文大學(xué)， 香港)

[摘要]目的： 探討WNT信號(hào)通路受體FZD3mRNA及蛋白在大腸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)。方法: 取正常大腸細(xì)胞株CCD18-Co、大腸癌細(xì)胞株SW480和SW620，以WNT信號(hào)通路PCR芯片篩選大腸癌細(xì)胞株中差異性表達(dá)的基因，并選擇FZD3基因采用Taqman PCR法進(jìn)行驗(yàn)證其在大腸癌細(xì)胞中的高表達(dá)，同時(shí)比較FZD3蛋白在大腸癌組織、腺瘤組織及癌旁正常組織的表達(dá)。結(jié)果: 與大腸正常細(xì)胞株CCD18-Co比較，19個(gè)基因在大腸癌細(xì)胞株SW480和SW620中表達(dá)上調(diào)，其中FZD3基因?yàn)镃CD18-Co的195倍和105倍；驗(yàn)證結(jié)果顯示，與大腸正常細(xì)胞株CCD18-CoFZD3比較， FZD3 mRNA在SW480和SW620細(xì)胞株中較中升高820倍和622倍，驗(yàn)證了FZD3 mRNA在大腸癌細(xì)胞株中的高表達(dá)；免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中表達(dá)為100%，大腸腺瘤中的表達(dá)為88%，而癌旁正常組織中僅為17.5%，與癌旁正常組織相比，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中免疫組化分?jǐn)?shù)高6.6倍(P<0.01) ； FZD3蛋白的高表達(dá)與腸癌TNM分期顯著相關(guān)(P<0.005) 。結(jié)論： FZD3可能在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起到潛在癌基因的作用。

[關(guān)鍵詞]FZD3基因；WNT信號(hào)通路；大腸；腫瘤；PCR芯片；免疫組織化學(xué)；TNM分期

WNT信號(hào)通路在大腸癌致瘤過程中通過WNT配體結(jié)合Frizzled(FZD)受體，引起核β-catenin的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。以上稱為WNT信號(hào)通路的經(jīng)典通路[1]。WNT信號(hào)通路還包括非經(jīng)典通路及平面細(xì)胞極性通路[2]。人類FZD3基因編碼WNT配體的受體，在FZD基因家族的10個(gè)成員中，F(xiàn)ZD3定位于8號(hào)染色體短臂21位點(diǎn)，高表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域、睪丸、腎臟、子宮、前列腺和骨骼肌，而RT-PCR或northern雜交檢測FZD3在其他正常人類組織低表達(dá)[3]。FZD3被認(rèn)為是多功能的蛋白，它既可在經(jīng)典WNT/β-catenin途徑又可在非經(jīng)典的WNT途徑甚至PI3K-AKT途徑起作用[4]。相對(duì)于來自于人外周血中正常B細(xì)胞， 定量PCR方法檢測到FZD3 mRNA的表達(dá)在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中升高[5]。乳腺癌中，F(xiàn)ZD3基因聯(lián)合其他5種基因(ITGB5，M-RIP，MMP16，RDX和RhoA)是負(fù)向預(yù)后指標(biāo)，以特異性siRNA 敲減FZD3基因可降低乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的侵襲和遷移能力[6]。肝癌細(xì)胞中，F(xiàn)ZD3，6,7常常高表達(dá)，與活化的FZD依賴的包括經(jīng)典β-catenin 途徑和非經(jīng)典PKC和JNK瀑布的信號(hào)通路相關(guān)[7]。更顯著的是，大腸癌細(xì)胞株中FZD3 mRNA 強(qiáng)烈表達(dá)，且在46%的家族性腺瘤性息肉(FAP)和67%散發(fā)性結(jié)腸腺瘤中檢測到FZD3 mRNA的表達(dá)，表明FZD3在大腸癌的成瘤過程中起到關(guān)鍵的作用[8]。然而大腸癌中FZD3基因和蛋白的表達(dá)模式尚不清楚，且表達(dá)的意義值得進(jìn)一步探索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑RPMI-1640、胎牛血清購于美國Gibco公司，Trizol試劑購于美國Invitrogen公司、Qiagen試劑盒購自德國Roche公司；TaqMan 逆轉(zhuǎn)錄試劑、FZD3特異性引物(Hs00907279_m1)、內(nèi)參照GAPDH特異性引物 (Hs99999905_m1)和TaqmanMGB探針購自美國Life technologies公司，人類WNT signaling pathway RT2 ProfilerTMPCR Array及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RT2 First Strand Kit (#C-03)購于德國QIAGEN公司。

1.1.2細(xì)胞株人類大腸癌細(xì)胞株SW480、SW620和正常大腸細(xì)胞株CCD18-Co購買自美國ATCC公司(http://www.atcc.org/)，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含100 ml/L 胎牛血清的RPMI-1640 (#31800-022;Invitrogen Corporation,CA,USA)完全培養(yǎng)液中， 37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代后至指數(shù)增長期用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3大腸癌組織從香港伊麗莎白醫(yī)院病理科收集福爾馬林固定、石蠟包埋的40例大腸癌組織及41例大腸腺瘤組織。大腸癌患者中男性25例(62.5%)，女性15例 (37.5%)，中位年齡59歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)的標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期5例 (12.5%)為，Ⅱ期13例 (32.5%),Ⅲ期14例 (35.0%)及Ⅳ期8例 (20.0%)。研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1大腸癌細(xì)胞中人類WNT信號(hào)通路中高表達(dá)基因的篩選采用人類WNT signaling pathway RT2 ProfilerTMPCR Array篩選，取SW480、SW620及CCD18-Co單層細(xì)胞，采用Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，NanoDrop分光光度計(jì)測定總RNA的濃度及純度；取2 μg總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒the RT2 First Strand Kit (#C-03)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)得到cDNA。25 μL PCR Array反應(yīng)體系包括 cDNA、2×SABiosciences RT2 qPCR反應(yīng)混合液和水，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火/延伸 1 min，共40個(gè)循環(huán)，計(jì)算每孔達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)(Ct)。采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果，重復(fù)檢測3次。按以下公式計(jì)算各轉(zhuǎn)移相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt對(duì)照組-ΔCt試驗(yàn)組，F(xiàn) =2-ΔΔCt。根據(jù)比較結(jié)果，選出WNT信號(hào)通路中高表達(dá)基因?yàn)镕ZD3。

1.2.2驗(yàn)證大腸癌細(xì)胞中FZD3 mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量PCR法，取1.2.1提取的總RNA 2 μg，采用TaqMan 逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。20 μL PCR反應(yīng)系統(tǒng)包括20×TaqMan?基因表達(dá)預(yù)混液1 μL， TaqMan?統(tǒng)一預(yù)混液10 μL，水7 μL及cDNA 2 μL。50 ℃擴(kuò)增2 min，95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火/延伸1 min,共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算每個(gè)孔的達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)(Ct)。按1.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3大腸癌組織中FZD3蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法，大腸癌組織石蠟切片在二甲苯中脫蠟，分別經(jīng)100%、95%和70%乙醇再水化，最后在蒸餾水中洗滌?？乖迯?fù)及與FZD3抗體(1∶100稀釋)結(jié)合的過程在Ventana BenchMark XT 自動(dòng)染色機(jī)上完成，室溫孵育約1 h 32 min，采用媒染二氨基聯(lián)苯沉積物DAB檢測蛋白表達(dá)；玻片以蘇木精復(fù)染，經(jīng)70%、95%及100%乙醇中脫水，最后加載蓋玻片。不加一抗作為陰性對(duì)照。由二位病理醫(yī)師獨(dú)立盲評(píng)結(jié)果并計(jì)分，400倍放大倍數(shù)取5個(gè)視野進(jìn)行評(píng)估得分。IHC評(píng)分=陽性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)度[9]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1大腸癌細(xì)胞株中高表達(dá)基因的篩選

PCR芯片結(jié)果顯示, 與大腸正常細(xì)胞株CCD18-Co比較，19個(gè)基因在大腸癌細(xì)胞株SW480和SW620中表達(dá)上調(diào)，其中FZD3基因的表達(dá)在SW480和SW620細(xì)胞中較在CCD18-Co中為195倍和105倍，見表1。

表1　WNT信號(hào)通路芯片中大腸癌細(xì)胞株SW480和SW620中的高表達(dá)基因

2.2FZD3 mRNA在大腸癌細(xì)胞中的高表達(dá)驗(yàn)證

Taqman探針PCR法驗(yàn)證FZD3 mRNA在大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與大腸正常細(xì)胞株CCD18-CoFZD3比較， FZD3 mRNA在SW480和SW620細(xì)胞株中較中升高820倍和622倍，驗(yàn)證了Sybr Green PCR 芯片檢測到的FZD3 mRNA在大腸癌細(xì)胞株中的高表達(dá)，見圖1。

2.3FZD3蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中表達(dá)為100%，大腸腺瘤中的表達(dá)為88%，而癌旁正常組織中僅為17.5%(圖2)。與癌旁正常組織相比，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中免疫組化分?jǐn)?shù)高6.6倍(P<0.01) ，見圖3。FZD3蛋白的高表達(dá)與腸癌TNM分期顯著相關(guān)(P<0.005) ，見圖4。

圖1　FZD3 mRNA在大腸癌細(xì)胞株中高表達(dá)驗(yàn)證 Fig.1　Validation of FZD3 mRNA over-expression in CRC cell line

A為癌旁正常組織，B為大腸腺瘤組織，C為大腸癌組織圖2　FZD3蛋白在大腸癌及大腸腺瘤組織中的表達(dá)Fig.2　Expression of FZD3 protein in colorectal carcinoma and colorectal adenoma

圖3　石蠟組織切片上FZD3染色的IHC評(píng)分Fig.3　IHC score of FZD3 staining on paraffin sections

圖4　不同TNM分期大腸癌患者組織中ZD3 蛋白表達(dá)IHC評(píng)分Fig.4　IHC score of protein expression in the tissues of patients with colorectal cancer in different TNM staging

3討論

經(jīng)典WNT信號(hào)通路的激活在大腸癌的發(fā)展中起主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示包括AXIN1,NKD1,PORCN,WNT10A,WNT3,WNT6,FZD3,FZD5, CTNNB1(β-catenin), CTNNBIP1和TCF7在內(nèi)的11個(gè)經(jīng)典WNT信號(hào)通路基因在SW40和SW620 中表達(dá)增高，其中β-catenin的表達(dá)是WNT信號(hào)通路生理性或異常激活的標(biāo)志, 同時(shí)WNT信號(hào)靶基因MYC在2種大腸癌細(xì)胞株中亦表達(dá)增高，至少部分因?yàn)榻?jīng)典WNT/ β-catenin信號(hào)通路的過度激活導(dǎo)致[10]。除經(jīng)典途徑外，非經(jīng)典WNT信號(hào)通路亦參與了大腸癌的發(fā)展[11]。例如WNT3和WNT6既參與經(jīng)典途徑又參與非經(jīng)典途徑，他們?cè)赟W480細(xì)胞中的高表達(dá)都曾有報(bào)道[12]，本研究結(jié)果與之相符。大腸癌細(xì)胞株SW620和SW480來自同一病人的不同病情階段，前者取自大腸癌Duke’s C的病人1年后廣泛轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的細(xì)胞。SW620細(xì)胞中WNT3和WNT6仍然高表達(dá)可能提示W(wǎng)NT信號(hào)通路仍然異常激活。

FZD3作為WNT信號(hào)通路的受體，在Ewing 肉瘤細(xì)胞中WNT誘導(dǎo)的神經(jīng)元軸突生長中起主導(dǎo)作用[13]。FZD3在分化差的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)[14]。本研究采用Taqman PCR方法證實(shí)大腸癌細(xì)胞株SW480和SW620較正常腸細(xì)胞株CCD18-Co高表達(dá)FZD3，仔細(xì)比較侵襲性高的SW620細(xì)胞和侵襲性較低的SW480，F(xiàn)ZD3的表達(dá)呈降低趨勢，這個(gè)現(xiàn)象曾在卵巢癌中報(bào)道，即發(fā)生轉(zhuǎn)移的卵巢癌中表達(dá)的FZD3 mRNA水平較局限的卵巢癌中低[15]。免疫組化的結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD3蛋白表達(dá)水平隨著腫瘤的從腺瘤發(fā)展到大腸癌升高，與此相反，Caldwell等[16]發(fā)現(xiàn)FZD3 mRNA在11/14 (79%)大腸腺瘤中過表達(dá)，但僅僅在9/23(39%)大腸癌中過表達(dá)。另一項(xiàng)來自Kyoto基因及基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)也顯示，大腸癌相對(duì)于大腸腺癌FZD3基因表達(dá)下降[16]。對(duì)于這種基因和蛋白表達(dá)的不一致性可能的解釋是mRNA表達(dá)水平可能因?yàn)檗D(zhuǎn)錄后、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)相關(guān)[17]。但真正原因還需進(jìn)一步研究。課題組下一步還將探索同一大腸癌患者組織表達(dá)FZD3基因及蛋白的關(guān)系及潛在的機(jī)制，以期闡明FZD3促進(jìn)腫瘤進(jìn)展可能的信號(hào)通路。

腫瘤組織FZD3 IHC分?jǐn)?shù)高于327分的患者主要是Ⅲ和Ⅳ期患者，而分?jǐn)?shù)≤327主要是Ⅰ和Ⅱ期患者[9]。結(jié)合本研究結(jié)果，F(xiàn)ZD3蛋白在患者大腸癌組織中隨著臨床TNM分期越晚表達(dá)越高，提示FZD3可能作為一項(xiàng)大腸癌有用的預(yù)后工具。課題組也將進(jìn)一步比較FZD3表達(dá)和傳統(tǒng)大腸癌生物標(biāo)志物CEA的表達(dá)的關(guān)系，并試圖探索FZD3蛋白在外周血的表達(dá)，尋找新的輔助預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志。

總之，F(xiàn)ZD3基因在大腸癌細(xì)胞株中高表達(dá)，蛋白水平亦在大腸腺瘤和大腸癌中表達(dá)升高，并且具有一定的預(yù)后價(jià)值。

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(2016-03-15收稿，2016-05-29修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Expression of FZD3 Gene and Protein in Colorectal Cancer

HE Wan1, CHENG Zhiqiang1, HUANG Siquan2, XU Ruilian1, TAN Wenyong1, HUANG Kaibin1,ZHONG Keli1, CHEN Yixin1, CHAN Mingle3, FU Yuxiang1, XIA Ligang1

(1.TheSecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople'sHospital,Shenzhen518020,Guangdong,China；2.HongKongPolytechnicUniversity,HongKong,China; 3.TheChineseUniversityofHongKong,HongKong,China)

[Abstract]Objective: To explore mRNA and protein expression of FZD3 receptor for WNT signaling pathway in colorectal cancer (CRC) cell lines and tissue and its clinical significance. Methods: Normal colorectal cell line CCD18-Co, colorectal cancer cell line SW480 and colorectal cancer cell line SW620 were selected in this study. The differentially expressed genes in colorectal cancer cell lines and normal colorectal cell line were screened by WNT signaling pathway PCR array, and FZD3 gene was chosen to validate the overexpression in CRC cell lines by using Taqman PCR assay. Meanwhile, FZD3 protein expression profile was also detected and compared between colorectal cancer tissue, adenoma tissue and adjacent normal tissue. Results: Compared with normal colorectal cell line CCD18-Co, nineteen genes up-regulated their expression in CRC cell lines SW480 and SW620, of which FZD3 gene expression was up-regulated by 195 and 105 folds in SW480 and SW620, respectively. Identification results showed compared with normal colorectal cell line CCD18-Co, FZD3 mRNA up-regulated its expression in SW480 and in SW620 by 820 folds and 622 folds, respectively. Immunohistochemical results showed that the expression of FZD3 protein in colorectal cancer tissue was 100%, the expression in colorectal adenoma was 88%, and the expression in the adjacent normal tissues was only 17.5%. There was a 6.6-fold up-regulation of FZD3 protein expression in CRC tissue compared with in adjacent normal tissue (P<0.01). The high expression of FZD3 protein was significantly correlated with the TNM staging of colorectal cancer (P<0.005). Conclusion: FZD3 may play a role in CRC tumorigenesis and development as a potential oncogene.

[Key words]FZD3 gene; WNT signaling pathway; colon; cancer; PCR array; immunohistochemistry; TNM staging

*[基金項(xiàng)目]深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目(201401013)

[中圖分類號(hào)]R735.34

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)06-0681-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.014

**通信作者 E-mail:393322301@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1632.012.html