頭花蓼對H.pylori感染大鼠模式識別分子DC-SIGN、TLR4表達的影響*

任艷君， 莫　非*， 何　蕓， 趙書琴， 江明禮， 孫朝琴

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床檢驗教研室， 貴州 貴陽　550004)

頭花蓼對H.pylori感染大鼠模式識別分子DC-SIGN、TLR4表達的影響*

任艷君**， 莫非***， 何蕓， 趙書琴， 江明禮， 孫朝琴

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床檢驗教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察頭花蓼對幽門螺桿菌(H. pylori)感染SD大鼠對免疫應(yīng)答模式識別受體DC-SIGN、TLR4蛋白和mRNA表達的影響，探討頭花蓼抗H.pylori可能的機制和調(diào)節(jié)作用。方法： SD大鼠分為空白組、模型組、藥物組及藥物空白組，模型組及藥物組用1×1011cfu/L H.pylori菌液進行灌胃，空白組和藥物空白組用腦心浸液肉湯灌胃，8周后，取大鼠胃黏膜顯微鏡觀察組織學(xué)改變，鑒定造模是否成功；造模成功后，藥物組和藥物空白組大鼠取頭花蓼灌胃處理，空白組和模型組給予生理鹽水灌胃；采用免疫組織化學(xué)法和實時熒光定量PCR法(real-time PCR)測定大鼠胃黏膜中DC-SIGN、TLR4蛋白和mRNA表達，觀察各組大鼠胃黏不同部位的表達情況。結(jié)果： 大鼠感染H.pylori后，胃黏膜腺體排列不規(guī)則，黏膜下層可見血管充血及大量淋巴細胞浸潤，表明造模成功；免疫組織化學(xué)和real-time PCR結(jié)果顯示 H.pylori上調(diào)了TLR4 、DC-SIGN的表達(P<0.05)，經(jīng)頭花蓼處理后，表達明顯下調(diào)(P<0.05)；TLR4、DC-SIGN主要在胃黏膜上皮細胞胞漿中表達，H.pylori感染大鼠后TLR4 、DC-SIGN表達強陽性。結(jié)論： H.pylori感染可上調(diào)大鼠胃黏膜上皮細胞DC-SIGN、TLR4的表達，頭花蓼處理后，其表達水平降低。

[關(guān)鍵詞]螺桿菌,幽門； 基因表達； 免疫； Toll樣受體； C型凝集素受體； 頭花蓼

幽門螺桿菌是一種螺旋形、多鞭毛、微需氧的革蘭陰性細菌，可以引發(fā)H.pylori相關(guān)性胃炎、消化性潰瘍及胃癌等[1-4]。以C型凝集素受體(CLR)及Toll樣受體(TLR)為代表的固有免疫分子，它們能識別相應(yīng)抗原進而通過不同的方式進行抗原呈遞，CLR 中的DC-SIGN(dendritic cell-specific inter-cellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin, CD209)屬Ⅱ型跨膜蛋白，具有模式識別受體功能，在針對病原微生物的免疫反應(yīng)中，可通過協(xié)同Toll樣受體參與免疫反應(yīng)；TLR4作為TLR家族主要成員，是機體激活固有免疫和適應(yīng)性免疫對抗病原微生物的重要因素[5-6]。本研究通過檢測H.pylori感染SD大鼠及經(jīng)頭花蓼處理后大鼠胃黏膜中TLR4、DC-SIGN蛋白和mRNA表達變化，探討H.pylori引起的固有免疫平衡調(diào)節(jié)機制。

1材料與方法

1.1試劑及儀器

苗藥頭花蓼浸膏，批號14196 ,由浙江眾益藥業(yè)有限公司提供。SPF級SD大鼠，6～8周齡，150～180 g，購買于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，批號SCXK(軍)2012-0011。H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)測序株SS2000，由中國疾病控制中心傳染病所張建中教授惠贈。哥倫比亞血瓊脂(購于OXOID公司)、萬古霉素、兩性霉素、 多粘菌素B、TMP(購于上海生工生物)、兔抗DC-SIGN抗體(Bioss公司)、TLR4單克隆抗體(abcam公司)、二抗試劑盒(中杉)、PBS緩沖、檸檬酸緩沖液(C6H8O7·H2)、DAB顯色劑、二甲苯、中性樹膠、無水乙醇、蘇木素、DAB顯色液、Omega RNA提取試劑盒、ROCHE LightCycler480 熒光定量PCR儀。

1.2方法

1.2.1H.pylori培養(yǎng)按照文獻[7]，從-80 ℃冰箱中取出H.pyloriSS2000，待室溫溶解后，傾倒于哥倫比亞血瓊脂平皿內(nèi)涂抹均勻，三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h(37 ℃、5% O2、10% CO2、85% N2，相對濕度>95%)，觀察細菌生長情況，穩(wěn)定傳代3次后進行H.pylori鑒定(尿素酶、觸酶、氧化酶陽性)。

1.2.2動物模型復(fù)制及頭花蓼處理將52只SD大鼠隨機分為造模組和對照組，造模組分為模型組(16只)和藥物組(10只)，對照組分為空白組(16只)和藥物空白組(10只)。各種大鼠禁食不禁水12 h，用5 g/L的NaHCO3和消炎痛混合液按體質(zhì)量給雄鼠1.0 mL/只，雌鼠0.5 mL/只進行灌胃預(yù)處理1次；預(yù)處理后繼續(xù)禁食不禁水，6 h后模型組及藥物組給予1×1011cfu/LH.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株SS2000菌液1.5 mL灌胃，灌胃后需禁食禁水4 h，隔天1次，共5次；空白組及藥物空白組以等量的無菌腦心浸液肉湯灌胃。末次灌胃8周后，模型組、空白組隨機抽取6只大鼠，鑒定其造模是否成功，大鼠胃黏膜有H.pylori定植且胃黏膜出現(xiàn)慢性炎癥病理學(xué)改變判斷為造模成功[8-9]。造模成功后，藥物組及藥物空白組大鼠參考文獻[7]每天給予頭花蓼灌胃處理(1.58 g生藥/d)，空白組和模型組給予等量無菌生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥2周。末次灌胃結(jié)束后，正常飼養(yǎng)4周，處死大鼠，取胃黏膜組織進行石包埋或-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3DC-SIGN、TLR4蛋白表達采用免疫組織化學(xué) (S-P )法檢測，石蠟切片常規(guī)脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，3% H2O2溶液孵育37 ℃孵育10 min，PBS液沖洗，分別滴加DC-SIGN(Bioss公司)、TLR4(abcam公司)一抗 ，4 ℃孵育過夜；次日取出至室溫，PBS 液沖洗，滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS液沖洗，應(yīng)用DAB溶液(現(xiàn)配)顯色，PBS沖洗，蘇木素輕度復(fù)染20 s，自來水沖洗，脫水，透明，中性樹脂封片。DC-SIGN、TLR4蛋白的陽性表達為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，選取5個高倍鏡視野，Image pro- Plus 6.0軟件測量各組陽性產(chǎn)物的平均光密度值作為DC-SIGN、TLR4蛋白的陽性表達量。

1.2.4DC-SIGN、TLR4 mRNA表達采用Real-Time PCR檢測，Omega試劑盒提取樣品的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用Real-Time PCR檢測DC-SIGN、TLR4 mRNA表達水平。采用primer 5 設(shè)計DC-SIGN、TLR4 擴增引物(見表1)。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 3 min，95 ℃ 7 s、 57 ℃ 10 s、75 ℃ 15 s， 40個循環(huán)。每組做3個生物重復(fù)，采用2-ΔΔCT法對目標(biāo)基因的表達差異進行分析。

表1　PCR擴增引物序列

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1H.pylori及動物模型

H.pylori經(jīng)培養(yǎng)后，在哥倫比亞血平板上呈半透明，針尖狀細小菌落。觸酶、尿素酶、氧化酶鑒定呈陽性反應(yīng)，革蘭染色呈弧形、螺旋狀、S形的革蘭陰性桿菌(圖1A)。H.pylori感染SD大鼠8周后，取大鼠胃黏膜進行細菌微需氧培養(yǎng)結(jié)果顯示H.pylori定植密度約為105cfu/g；空白對照組大鼠胃黏膜完整，腺體排列規(guī)則，無異常黏膜肌層(圖1B)，模型組H.pylori感染后的胃黏膜腺體排列不規(guī)則，胃黏膜下層可見血管內(nèi)充血及大量淋巴細胞浸潤(圖1C)。

2.2DC-SIGN、TLR4蛋白表達

在胃黏膜上皮細胞胞漿可見DC-SIGN、TLR4蛋白表達，免疫組織化學(xué)染色見棕黃或棕褐色顆粒。在空白組中，上皮細胞構(gòu)成規(guī)則的腺體，基本未見DC-SIGN、TLR4蛋白表達。模型組中，DC-SIGN及TLR4表達強陽性，胃腺松散，排列不規(guī)則，藥物組經(jīng)頭花蓼處理后，表達減弱，其平均光密度值比較，模型組高于空白組和藥物組(P<0.05)，藥物空白組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

表2　各組大鼠DC-SIGN、TLR4蛋白表達平均光密度值

(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.3DC-SIGN、TLR4 mRNA表達

結(jié)果顯示，H.pylori刺激后，模型組的TLR4、DC-SIGN mRNA明顯高于空白組 (P<0.05)，藥物組經(jīng)頭花蓼處理后，TLR4 、DC-SIGN mRNA的表達水平下降 (P<0.05)，而藥物空白組與空白組TLR4 、DC-SIGN mRNA的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

3討論

H.pylori作為一種模式致病菌，其細胞壁主要成分為脂多糖，含有病原體相關(guān)模式分子，而胃上皮細胞表面具有的模式識別受體可調(diào)控前者識別H.pylori，行使抗原提呈細胞功能，募集的炎癥細胞相互作用和協(xié)調(diào)，形成固有免疫局部防御乃至調(diào)節(jié)后續(xù)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[10-12]。林凱等[12]研究表明，在H.pylori感染下，胃黏膜上皮細胞表達樹突狀細胞表型DC-SIGN，系CLR的重要成員，在針對病原微生物的免疫反應(yīng)中，具有模式識別受體的功能，可通過協(xié)同Toll樣受體參與免疫反應(yīng)，TLR4可在人類胃上皮細胞上表達，TLR4作為LPS的優(yōu)先受體，H.Pylori及其菌體成分LPS等刺激均可使TLR4的表達上調(diào)，進而激活NF-κB，促進細胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥免疫反應(yīng)。DC-SIGN、TLR4作為重要的識別模式受體，通過激活一系列的信號轉(zhuǎn)到途徑，調(diào)控著諸多細胞生物學(xué)行為，在H.pylori感染后的免疫反應(yīng)中，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，SD大鼠在受到H.pylori刺激時，模式識別受體發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，識別模式受體TLR4、DC-SIGN通過識別病原菌相關(guān)分子脂多糖，引起炎性因子的分泌，誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)清除外來抗原，構(gòu)成了機體免疫反應(yīng)的天然屏障。但是，H.pylori的持續(xù)作用，引起過度的炎癥反應(yīng)，會對組織、器官造成嚴(yán)重的損害或?qū)е缕渌嚓P(guān)疾病，如重癥細菌感染導(dǎo)致TLR4通路持續(xù)活化，引起過度的炎癥反應(yīng)，造成敗血癥、TLR4信號通路過度激活從而介導(dǎo)激素性股骨頭壞死的發(fā)生[13-14]。因此，免疫平衡的調(diào)節(jié)在免疫反應(yīng)中及其重要。林凱[12]研究認為H.pylori可刺激TLR4、DC-SIGN的表達，產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)。本次研究與Castano-Rodriguez和林凱結(jié)果一致，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染H.pylori后，上皮細胞DC-SIGN、TLR4表達明顯上調(diào)，頭花蓼可能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)著免疫平衡。多數(shù)研究表明，中藥對LPS介導(dǎo)的TLR4信號通路的抗炎作用，是通過影響TLR4/NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控釋放相關(guān)炎性因子來完成的。謝毅等[15]研究發(fā)現(xiàn)TLR4在肝組織的表達量在加味大柴胡湯的作用下有所減少。李卿姬等[16]研究發(fā)現(xiàn)，人類臍靜脈內(nèi)皮細胞受LPS刺激后，TLR4表達升高，補陽還五湯治療后，TLR4明顯下降；本研究中在藥物頭花蓼作用后，DC-SIGN、TLR4的表達下調(diào)，轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)一致，頭花蓼的主要成分之一為黃酮，黃酮能抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，它的單體黃芪皂苷可以抑制LPS的核轉(zhuǎn)位，頭花蓼可能通過相同的作用抑制TLR4、DC-SIGN的表達，也推測頭花蓼可能形成穩(wěn)定的黏膜屏障，通過改變胃黏膜周圍的微環(huán)境，抑制了TLR、CLR的表達，進而減少TNF-α、IL-6等炎性因子的產(chǎn)生以及切斷了部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]。在感染H.pylori引起的固有免疫中，TLR4、DC-SIGN一方面促進免疫細胞膜表面有關(guān)免疫分子的表達和促進免疫細胞的成熟，另一方面可促進細胞因子的合成和釋放，引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，頭花蓼可能通過調(diào)節(jié)TLR4和DC-SIGN的表達水平來平衡機體的反應(yīng)，TLR與CLR的識別與LPS介導(dǎo)的信號通路以及基因多態(tài)性以及收到巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶等諸多因素影響，因此，頭花蓼在模式識別過程中具體如何調(diào)控，該機制有待深入研究。

注：A為H.pylori培養(yǎng)(100×)，B為空白組大鼠胃黏膜(HE，×400)，C為模型組大鼠胃黏膜(HE，×400)圖1　H.pylori培養(yǎng)及各組大鼠胃黏膜Fig.1　H.pylori culture and rats' gastric mucosa

注：A、B、C及D分別為空白組、模型組、藥物組及藥物空白組的DC-SIGN表達E、F、G及H分別為空白組、模型組、藥物組及藥物空白組的TLR4表達圖2　各組大鼠胃黏膜DC-SIGN及TLR4蛋白表達(SP，×40)Fig.2　Immunohistochemical staining of G cells gastric antrum(SP，×40)

(1)與空白組比較， P<0.05；(2)與模型組比較P<0.05圖3　頭花蓼對H.pylori感染SD大鼠胃黏膜TLR4和DC-SIGN mRNA表達的影響Fig.3　Effect of Polygonum Capitatum on TLR4 mRNA and DC-SIGN mRNA expression of gastric mucosa of Hp infected rats

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(2016-03-28收稿，2016-05-27修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Effect ofPolygonumCapitatumon Pattern Recognition Molecules DC-SIGN, TLR4

REN Yanjun， MO Fei， HE Yun， ZHAO Shuqin， JIANG Mingli， SUN Chaoqin

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuihzouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guihzou,China)

[Abstract]Objective: To observe the effect of Polygonum capitatum on protein and mRNA expression of immune response pattern recognition receptor DC-SIGN, TLR4, and to investigate the possible mechanism and regulation role of Polygonum capitatum anti H.pylori. Methods: SD rats were divided into blank group, model group, drug group and drug blank group. Model group and drug group received intragastric administration of 1×1011cfu/L H.pylori bacteria solution while blank group and drug blank group received intragastric administration of brain heart infusion broth. 8 weeks later, the microscope was used to observe the histological changes of gastric mucosa of rats in order to identify whether the model was successful to. After modeling was successful, drug group and drug blank group were treated with Polygonum capitatum by intragastric administration while blank group and model group received physiological saline by intragastric administration. Immunohistochemistry and real-time PCR were adopted to detect the protein and mRNA expression of in gastric mucosa of rats. The expression of different parts of gastric mucosa of rats in each group was observed. Results: After rats were infected with H.pylori, the gastric mucosal glands showed irregular arrangement, with visible vascular congestion and a large number of lymphocytes infiltration in the submucosal layer, which proved that model was established successfully. The results of Immunohistochemistry and real-time PCR showed that H.pylori up-regulated TLR4, DC-SIGN expression level (P<0.05). After the treatment of Polygonum capitatum, TLR4 and DC-SIGN expression level significantly down-regulated (P<0.05). TLR4, DC-SIGN were mainly expressed in cytoplasm of gastric mucosal epithelial cells. After rats were infected with H.pylori, TLR4, DC-SIGN showed strongly positive expression. Conclusion: H.pylori infection can up-regulate DC-SIGN and TLR4 expression level in gastric mucosa epithelial cells, but after treatment of Polygonum capitatum their expression levels significantly decrease.

[Key words]Helicobacter pylori; gene expression; immune; Toll like receptor; type C lectin receptor; Polygonum capitatum

*[基金項目]高等學(xué)校特色專業(yè)建設(shè)點[No(2010)15]； 貴州省科技計劃課題[黔科合J字(20142027)號]； 貴州省科技合作計劃基金[黔科合LH(2015)7417號]； 貴州省衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)基金[gzwjkj2015-1-003]； 貴陽市科技計劃項目 [筑科合同(20141001)號]

[中圖分類號]R961.1

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0640-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.005

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級臨床檢驗診斷學(xué)碩士研究生

***通信作者 E-mail:354406804@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1647.022.html