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    川芎嗪對宮頸癌Hela細(xì)胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表達(dá)的影響

    2016-06-30 01:17:24宋慶嬌榮光影柳朝陽
    中國老年學(xué)雜志 2016年11期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞凋亡川芎嗪宮頸癌

    張 濤 宋慶嬌 榮光影 柳朝陽 汪 悅

    (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

    川芎嗪對宮頸癌Hela細(xì)胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表達(dá)的影響

    張濤宋慶嬌榮光影1柳朝陽2汪悅3

    (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯154007)

    〔摘要〕目的研究川芎嗪(TMP)對Hela細(xì)胞磷酸化Bad(p-Bad)蛋白和Survivin蛋白表達(dá)的影響。方法四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測TMP對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;Western印跡法檢測p-Bad和Survivin蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對照組相比TMP可抑制Hela細(xì)胞的增殖(P<0.01);增加Hela細(xì)胞的凋亡率(P<0.05,P<0.01);降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論TMP可抑制Hela細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡,降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達(dá),這可能是TMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

    〔關(guān)鍵詞〕川芎嗪;宮頸癌;細(xì)胞凋亡;磷酸化Bad蛋白;Survivin蛋白

    川芎嗪(TMP)是中藥川芎根莖中的生物堿單體,臨床上主要用于治療多種心血管疾病〔1,2〕。目前報(bào)道,TMP的抗腫瘤〔3~7〕作用主要見于對肺癌、白血病、黑色素細(xì)胞瘤和胃癌的抑制作用,TMP對宮頸癌的抑制及其作用機(jī)制國內(nèi)外暫無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

    1材料與方法

    1.1材料細(xì)胞株:Hela細(xì)胞株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞庫。 藥物和試劑:TMP純品購于Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購于北京拜爾迪生物技術(shù)公司。AV-FITC凋亡檢測試劑盒、兔抗人Survivin抗體和抗人β-actin抗體、Bad蛋白磷酸化(p-Bad)抗體購于艾美捷科技有限公司。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞復(fù)蘇后,RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),37℃、5% CO2培養(yǎng),選對數(shù)生長期時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖胰酶消化調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml,接種于96孔板,100 μl/孔,培養(yǎng)24 h,分別給予不同濃度的TMP(0,0.25,0.5,1.0,1.5,2.0 mg/ml)處理,每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別處理(24、48、72)后進(jìn)行檢測,加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl培養(yǎng)4 h,每孔加入200 μl DMSO,于490 nm處檢測吸光度(OD)值。同時(shí)設(shè)空白對照組,有細(xì)胞,無藥物。細(xì)胞增殖抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD均值/對照組OD均值)×100%。

    1.2.3膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V FITC)染色流式細(xì)胞儀觀察Hela細(xì)胞凋亡Hela細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng),24 h后加入TMP(0,0.25,0.5,1.0,1.5,2.0 mg/ml),培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說明書操作,流式細(xì)胞儀檢測,利用FCSExpress 3.0軟件分析細(xì)胞凋亡。

    1.2.4Western印跡法檢測Survivin及p-Bad蛋白表達(dá)收集對照組及TMP(1.0,1.5,2.0 mg/ml)處理的Hela細(xì)胞,提取總蛋白,用Bradford法測定各組蛋白質(zhì)含量。蛋白上樣后,進(jìn)行凝膠電泳,移膜,4℃用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入兔抗人抗體(1∶100),過夜,加二抗(1∶10 000),雜交1 h。采用ECL法分析檢測結(jié)果,以β-actin為對照蛋白,各組蛋白條帶進(jìn)行灰度分析,計(jì)算Survivin和p-Bad蛋白表達(dá)水平。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.3軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

    2結(jié)果

    2.1TMP抑制Hela細(xì)胞增殖MTT法結(jié)果顯示,與對照組相比,不同濃度的TMP作用于Hela細(xì)胞可明顯抑制細(xì)胞的增殖(P<0.01);各時(shí)間點(diǎn)均以2.0 mg/ml濃度的抑制率最高,具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。見表1。

    2.2TMP對Hela細(xì)胞凋亡率的影響不同濃度的TMP作用于Hela細(xì)胞24 h后,與對照組相比,隨著藥物濃度的增加,早期凋亡率、晚期凋亡率或壞死細(xì)胞逐漸上升(P<0.05,P<0.01)(0.25 mg/ml組除外),具有濃度依賴性,見表2。

    2.3TMP對Hela細(xì)胞p-Bad蛋白及Survivin蛋白表達(dá)的影響與對照組相比,不同濃度的TMP作用于Hela細(xì)胞48 h后,可見隨藥物濃度的增高,p-Bad蛋白及Survivin蛋白的表達(dá)逐漸降低,呈一定的濃度依賴性,見表3。

    表1 不同濃度的TMP對Hela細(xì)胞增殖的影響

    與對照組比較:1)P<0.01

    表2 TMP對Hela細(xì)胞凋亡的影響

    與對照組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

    表3 TMP對Hela細(xì)胞磷酸化Bad蛋白和Survivin

    與對照組比較:1)P<0.01;與TMP 0.25 mg/ml組比較:2)P<0.01;與TMP 1.0 mg/ml組比較:3)P<0.05

    3討論

    宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤之一,死亡率占女性癌癥的第二位〔8〕。研究證明,500 mg/L TMP對人胃低分化腺癌有一定殺傷作用,抑制率約為24.4%~28.5%〔3〕;TMP能輕度抑制敏感性白血病K562細(xì)胞的DNA合成〔4〕;≥250 mg/L的TMP對體外培養(yǎng)的B16-FIO黑色素瘤細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成具有抑制作用,并存在劑量依賴關(guān)系〔5〕;TMP對肺癌A549細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用,機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的〔6〕;TMP通過誘導(dǎo)Bel-7402肝癌細(xì)胞株分化抑制細(xì)胞增殖〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TMP能夠抑制Hela細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

    Bad是 Bcl-2家族中的促凋亡基因。Bad在多種細(xì)胞中表達(dá),研究表明Bad可通過與Caspase家族成員的相互作用和作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞凋亡全過程。接受細(xì)胞凋亡信號刺激后,鈣調(diào)磷酸酶可誘導(dǎo) Bad去磷酸化,去磷酸化的游離 Bad 通過易位等細(xì)胞活動(dòng)促進(jìn)凋亡的發(fā)生〔9〕。

    Bad蛋白對凋亡的調(diào)控與其磷酸化-去磷酸化修飾有關(guān),生理狀態(tài)下,p-Bad一方面與 14-3-3 蛋白結(jié)合成復(fù)合物穩(wěn)定存在于胞質(zhì)中發(fā)揮抗凋亡效應(yīng);另一方面,p-Bad與bcl-2解聚,而游離的bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用〔10〕。

    Survivin是抗凋亡蛋白家族(IAP)中最小的一個(gè)抗凋亡基因,在正常組織(子宮內(nèi)膜等少數(shù)組織除外)不表達(dá),而在多種腫瘤組織中呈周期依賴性的表達(dá)〔11〕。

    Survivin通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體的釋放從而在上游就阻斷了凋亡信號的傳導(dǎo);Survivin能夠阻止Caspase-9前體構(gòu)象的改變,進(jìn)而阻止下游Caspases分子前體蛋白的分解,且Survivin可與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合并抑制其活性,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡〔12〕。本研究結(jié)果提示TMP誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡、抑制其增殖,與其降低抗凋亡蛋白p-Bad和Survivin表達(dá)有關(guān)。

    4參考文獻(xiàn)

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    12謝海洋,劉邕波.Caspase-3及Survivin與心肌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展〔J〕.臨床醫(yī)學(xué)工程,2014;21(1):124-5.

    〔2015-10-25修回〕

    (編輯李相軍/滕欣航)

    基金項(xiàng)目:黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2015074);黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(2009-336);黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1252G059);佳木斯大學(xué)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(Sz2011-009);佳木斯大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510222026)

    通訊作者:柳朝陽(1971-),男,碩士,副主任醫(yī)師,主要從事腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌免疫研究。

    〔中圖分類號〕R285.5;R73-36

    〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

    〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2605-03;

    doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.016

    1佳木斯大學(xué)醫(yī)政管理處2佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

    3佳木斯大學(xué)2014級免疫學(xué)碩士

    第一作者:張濤(1971-),女,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事中草藥抗腫瘤及腫瘤免疫機(jī)制方面的研究。

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