魚金葶顆粒對(duì)AECOPD模型大鼠肺組織IL-8、TNF-α的影響*

宋欠紅　樊睿　蘇玉杰　李云華　朱虹江　陳麗娟　葉勇（云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，云南　昆明　650021）

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魚金葶顆粒對(duì)AECOPD模型大鼠肺組織IL-8、TNF-α的影響*

宋欠紅樊睿蘇玉杰李云華朱虹江陳麗娟葉勇
（云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，云南昆明650021）

【摘要】目的觀察魚金葶顆粒對(duì)慢性阻塞性肺病急性加重期（AECOPD）模型大鼠肺組織勻漿中細(xì)胞白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響及病理組織分析。方法將Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為空白組、模型組和魚金葶顆粒低、中、高劑量組及地塞米松對(duì)照組。采用煙霧吸入加脂多糖灌肺復(fù)合因素建立AECOPD大鼠模型。應(yīng)用魚金葶顆粒干預(yù)。采用ELISA法測(cè)定肺組織勻漿IL-8、TNF-α的含量。結(jié)果魚金葶高劑量、中劑量組與模型組比較肺組織勻漿IL-8、TNF-α水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論魚金葶顆粒對(duì)AECOPD模型大鼠肺組織勻漿中IL-8、TNF-α有明顯的干預(yù)作用，能夠有效降低IL-8、TNF-α的水平。

【關(guān)鍵詞】魚金葶顆粒AECOPD模型大鼠IL-8 TNF-α肺組織

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以免疫炎癥為特征的疑難疾病。COPD急性加重期（AECOPD）病理機(jī)制復(fù)雜，多種因素導(dǎo)致的肺實(shí)質(zhì)及肺血管慢性炎癥是發(fā)病的關(guān)鍵。炎癥細(xì)胞釋放多種活性物質(zhì)，參與慢性炎癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過觀察魚金葶顆粒對(duì)AECOPD大鼠肺組織細(xì)胞白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）的影響及病理改變，探討其對(duì)AECOPD的作用機(jī)理。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠72只，鼠齡16周，體質(zhì)量260～300 g，由云南中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（大鼠合格證號(hào)：43006700006076）。動(dòng)物飼養(yǎng)室為清潔級(jí)，控制溫度（22±2）℃，實(shí)驗(yàn)前1周在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2藥物及試劑1）魚金葶顆粒。組成為魚腥草、金蕎麥、葶藶子、川芎、桔梗、水蛭、地龍。規(guī)格為10 g/袋，每袋含生藥10 g，由云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室提供。成人每日用量為60 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與成人用藥量的換算方法：人用量（體質(zhì)量70 kg）×0.018=大鼠（體質(zhì)量200 g）用量。該方法計(jì)算結(jié)果為中劑量，其1/2劑量為低劑量組，2倍為高劑量組。2）試劑IL-8、TNF-α試劑盒。用酶聯(lián)免疫吸附法，采用相應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒（TNF-α檢測(cè)試劑盒購于晶美生物工程有限公司，IL-8檢測(cè)試劑盒購于美國R&D公司）檢測(cè)，按照試劑盒說明書操作。脂多糖購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司（由美國Sigma公司生產(chǎn)）。香煙購自昆明卷煙廠生產(chǎn)云煙牌香煙，焦油含量19 mg，尼古丁1.2 mg。地塞米松片購自廣東三才石岐制藥股份有限公司，規(guī)格0.75 mg/片。

1.3主要儀器AEU-210型電子天平，日本島津廠；722型分光光度計(jì)，上海第二分析儀器廠；80-2型離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠。

1.4動(dòng)物模型制作參照宋一平等［2］采用煙霧吸入加脂多糖灌肺復(fù)合因素建立COPD大鼠模型。在造模的第1日、第14日將大鼠以10%水合氯醛2.4 mL/kg腹腔注射麻醉后，暴露喉頭，以靜脈套管針替代氣管導(dǎo)管行氣管插管，向大鼠氣管內(nèi)注入脂多糖（LPS）200 μg （μg/μL），完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)5～10 s（旋轉(zhuǎn)速度：1 周/秒），使LPS均勻分布于肺部。第2～13日、第15～28日，每日在有機(jī)玻璃密閉箱（80 cm×60 cm×50 cm，4個(gè)側(cè)面均有一直徑為1 cm的通氣孔）持續(xù)吸入新鮮的香煙霧（昆明卷煙廠生產(chǎn)云煙牌香煙，焦油含量19 mg，尼古丁1.2 mg）30 min，10支/d，造模28 d結(jié)束?？瞻讓?duì)照組僅在第1、14日氣管內(nèi)滴注等量的0.9%氯化鈉注射液，置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.5分組及給藥將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、魚金葶顆粒低劑量組、魚金葶顆粒中劑量組、魚金葶顆粒高劑量組、地塞米松對(duì)照組?？瞻捉M大鼠正常飼養(yǎng)，每日灌服等量0.9%氯化鈉注射液，其余組進(jìn)行COPD造模。模型組在COPD造模的同時(shí)，亦正常飼養(yǎng)，每天灌服等量0.9%氯化鈉注射液；魚金葶顆粒低、中、高劑量組大鼠在制備COPD模型的同時(shí)，于每日熏香煙后按2.7 g/kg、5.4 g/kg、10.8 g/kg的劑量分別灌服魚金葶顆粒；地塞米松對(duì)照組則給予醋酸地塞米松片0.9 mg/kg，灌服。

1.5標(biāo)本制作和處理各組動(dòng)物造模28 d結(jié)束后，先將動(dòng)物稱重，腹腔內(nèi)注入10%水合氯醛（2.4 mL/kg）。麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定，沿胸部正中線剪開皮膚和胸壁肌肉，剪斷兩側(cè)肋骨和胸肌，暴露胸腔。迅速開胸分離肺臟，然后夾閉右肺，以0.9%氯化納注射液3 mL灌洗左側(cè)肺臟，松開右肺，夾閉左側(cè)肺臟，用含有1/1000 DEPC的4%多聚甲醛溶液在20 cmH2O壓力下進(jìn)行灌注固定，30 min后投入多聚甲醛溶液中固定1周。取固定好的組織，在最大橫徑處切3 mm厚的組織塊，常規(guī)脫水，二甲苯透明，用自動(dòng)石蠟包埋機(jī)包埋，切成4 μm厚的切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理改變，研磨肺組織取上清液進(jìn)行IL-8、TNF-α檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組肺組織勻漿IL-8、TNF-α水平的比較見表1。結(jié)果示魚金葶顆粒低、中、高劑量組IL-8比模型組有較好抑制作用（P＜0.05）；魚金葶顆粒中、高劑量組TNF-α比模型組有較好抑制作用（P＜0.05）；IL-8、TNF-α在魚金葶顆粒中、高劑量組與地塞米松對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表1　各組大鼠肺組織勻漿IL-8、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1　各組大鼠肺組織勻漿IL-8、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別　n　IL-8　TNF-α空白組　10　12.31±2.64　773.2±188模型組　12　24.42±4.01　978.5±39.78魚金葶顆粒低劑量組　11　18.10±5.86*　908.1±77.72魚金葶顆粒中劑量組　11　15.69±4.80*　842.1±76.83*魚金葶顆粒高劑量組　12　13.81±4.08**　821.8±114.6**地塞米松對(duì)照組　11　21.38±8.29　895.8±37.44

2.2各組大鼠病理比較見圖1～圖5。所建COPD模型的病理學(xué)改變符合人類COPD的特點(diǎn)?？瞻捉M大鼠活潑好動(dòng)，皮毛光澤無脫落；模型組及魚金葶干預(yù)組大鼠毛發(fā)失去光澤，黃澀，神情倦怠，活動(dòng)能力下降。模型組呈慢性支氣管炎、肺氣腫的特征性病理學(xué)改變；魚金葶干預(yù)組大鼠支氣管肺組織損傷的程度較模型組輕。與空白對(duì)照組比較，模型組氣道壁增厚，魚金葶干預(yù)組與模型組比較氣道壁變薄。

圖1　空白組：肺組織未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管管腔規(guī)則，氣道黏膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔窄，氣道平滑。肌薄，肺泡腔透亮，無上皮脫落損傷，黏膜無水腫。

圖2　模型組：肺組織病理切片可見杯狀細(xì)胞及平滑肌增生，基底膜增厚且形態(tài)不規(guī)則，支氣管管腔內(nèi)可見黏液栓，氣道有損傷、斷裂，肺泡間隔不同程度增寬，部分?jǐn)嗔?，支氣管與血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖3　魚金葶顆粒低劑量組：支氣管上皮結(jié)構(gòu)較完整，肺泡間隔窄，肺泡腔內(nèi)透亮，無明顯炎性滲出，內(nèi)無明顯分泌物，支氣管及肺泡炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。

圖4　魚金葶顆粒中劑量組：支氣管上皮結(jié)構(gòu)較完整，肺泡壁變薄，相互融合成大小不一的氣囊腔，肺泡腔內(nèi)透亮，無明顯炎性滲出，支氣管及肺泡炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。

圖5　魚金葶顆粒高劑量組：支氣管上皮結(jié)構(gòu)較完整，肺泡間隔窄，支氣管及肺泡炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。部分肺泡壁變薄、融合。

3　討論

在煙熏加脂多糖造模過程中，可能出現(xiàn)大鼠首次接觸煙熏不能耐受的情況，出現(xiàn)6只死亡。所以在正式實(shí)驗(yàn)中，開始煙熏從15 min開始，每2日延長(zhǎng)煙熏時(shí)間5 min最終至煙熏時(shí)間為30 min/次。這樣可以減少大鼠的死亡，該組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低劑量煙熏并延長(zhǎng)煙熏時(shí)間至42 d造模方法，可以更好地模擬人COPD形成的過程。

AECOPD趨化物質(zhì)尤其是TNF-α、IL-8在肺組織中表達(dá)。其病理機(jī)制復(fù)雜，多種因素導(dǎo)致的肺實(shí)質(zhì)及肺血管慢性炎癥是發(fā)病的關(guān)鍵。炎癥細(xì)胞釋放多種活性物質(zhì)，參與慢性炎癥的發(fā)生。IL-8、TNF-α是其中較重要的炎性因子。支氣管、肺組織的炎癥、損傷、修復(fù)、重塑是COPD不斷進(jìn)展的病理基礎(chǔ)，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積與小氣道平滑肌層增厚共同構(gòu)成COPD氣道重塑的病理基礎(chǔ)。

該研究發(fā)現(xiàn)，魚金葶顆粒具有明確的抗炎，抑制炎性介質(zhì)的作用，對(duì)于肺組織勻漿中的TNF-α、IL-8與模型組對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)單味藥藥理研究表明，方中魚腥草、金蕎麥、葶藶子等藥具有抗炎、抑制炎性介質(zhì)的作用，川芎、水蛭、地龍具有活血化瘀改善微循環(huán)，緩解支氣管痙攣?zhàn)饔?。該方配伍使用后，能夠起到清熱化痰、活血化瘀、宣肺止咳的作用，能夠顯著抑制炎性介質(zhì)的釋放。

但其量效關(guān)系尚不明確，可以進(jìn)一步觀察魚金葶顆粒的量效關(guān)系及毒副作用。

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·研究報(bào)告·

·研究報(bào)告·

Effects and Pathological Analysis of Yujinting Granule on IL-8 and TNF-α of Lung Tissue in AECOPD Rat Model

SONG Qianhong，F(xiàn)AN Rui，Su Yujie，et al.The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Yunnan，Kunming 650021，China.

【Abstract】Objective：To observe the effects and pathological analysis of Yujinting granule on IL-8 and TNF-α of lung tissue in AECOPD rat model.Methods：72 Wistar rats were randomly divided into the blank group，the model group，Yujinting granule low，mid and high dose groups and dexamethasone group.The smoke inhalation and lipopolysaccharide lung perfusion of complex factors were used in the establishment of rat model of acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease（AECOPD）.Yujinting granule intervention was applied.ELISA was used to determine IL-8 in lung tissue homogenate and TNF-α content.Results：In the comparison among Yujinting granule high dose，middle dose group and the model group in IL-8 in lung tissue homogenate and TNF-α，there was statistically significant difference（P＜0.05）.Conclusion：Yujinting granule has a significant intervention effect on IL-8 and TNF-αof lung tissue homogenate in AECOPD rat models.

【Key words】Yujinting granule；AECOPD rat model；IL-8；TNF-α；Lung tissue

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）04-0588-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.007

*基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013FZ208）

收稿日期（2015-12-20）