海馬神經(jīng)元初級纖毛染色技術(shù)探索

周曉春， 王珊珊， 安云鶴

(1. 唐山市豐潤區(qū)中醫(yī)院 中風(fēng)二科， 唐山 063000; 2. 北京市理化分析測試中心, 北京 100089)

海馬神經(jīng)元初級纖毛染色技術(shù)探索

周曉春1， 王珊珊1， 安云鶴2

(1. 唐山市豐潤區(qū)中醫(yī)院 中風(fēng)二科， 唐山 063000; 2. 北京市理化分析測試中心, 北京 100089)

摘要為了建立體外原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元初級纖毛的染色標(biāo)記方法，以體外原代培養(yǎng)的18 d 胎鼠的海馬神經(jīng)元為研究材料，應(yīng)用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用不同的初級纖毛蛋白標(biāo)記物的抗體[抗ADP核糖基化因子相似蛋白-13B(ARL13B)抗體，抗III型腺苷酸環(huán)化酶(ACIII)抗體]對海馬神經(jīng)元初級纖毛進(jìn)行染色，然后應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察記錄染色結(jié)果。從免疫熒光圖像中看出，anti-ARL13B抗體和anti-ACIII抗體都能較好地標(biāo)記海馬神經(jīng)元初級纖毛，但anti-ARL13B抗體的染色效果更佳。隨著體外原代培養(yǎng)天數(shù)的增加，初級纖毛長度逐步增加(anti-ACIII抗體標(biāo)記組：纖毛生長從第1天的3.3 μm到第14天的8.5 μm逐漸增加；anti-ARL13B抗體標(biāo)記組：纖毛生長從第1天的4.4 μm到第14天的9.1 μm逐漸增加)。對星型膠質(zhì)細(xì)胞的ACIII和ARL13B進(jìn)行免疫熒光染色，也能較好地標(biāo)記其初級纖毛。ARL13B和ACIII都能作為大鼠海馬神經(jīng)元初級纖毛的標(biāo)記物，但ARL13B體現(xiàn)出更好的特異性。初級纖毛會伴隨著海馬神經(jīng)元的發(fā)育成熟而生長，提示初級纖毛在海馬神經(jīng)元的發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要作用。ARL13B和ACIII也可以作為星型膠質(zhì)細(xì)胞初級纖毛的染色標(biāo)志。

關(guān)鍵詞初級纖毛；海馬神經(jīng)元；免疫熒光；ADP核糖基化因子相似蛋白-13B；III型腺苷酸環(huán)化酶

纖毛是進(jìn)化過程中保守的細(xì)胞表面發(fā)絲樣結(jié)構(gòu)，在絕大多數(shù)種類的細(xì)胞表面都有分布[1]。一般將纖毛分為2類：可動纖毛和初級纖毛?？蓜永w毛可以擺動，以此來幫助液體的流動，如在氣管內(nèi)促進(jìn)粘液移動[2]等；而初級纖毛，一般是不動的，以細(xì)胞觸角的狀態(tài)存在，其上有很多受體和離子通道的表達(dá)，能感受細(xì)胞周圍微妙的環(huán)境變化，從而使細(xì)胞做出相應(yīng)的信號反應(yīng)[3， 4]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，初級纖毛功能或結(jié)構(gòu)缺陷與人類疾病相關(guān)，典型的如多囊性腎病、腦積水、多趾癥、共濟(jì)失調(diào)等[5， 6]。已有研究表明，在腦中也廣泛分布著初級纖毛，并且它們在腦的發(fā)育和相關(guān)疾病方面發(fā)揮重要的功能, 但是，具體分子機(jī)制尚不清楚[7]。因此，建立良好的體外研究模型，對于研究神經(jīng)系統(tǒng)初級纖毛的生理功能和作用機(jī)制有重要意義。體外研究中，神經(jīng)元初級纖毛的染色標(biāo)記方法，仍然比較匱乏，沒有最佳的方案。本研究旨在以體外原代培養(yǎng)的孕18 d的大鼠胎鼠的海馬神經(jīng)元為研究對象[8]，應(yīng)用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)的方法，選擇ACⅢ和ARL13B 2種初級纖毛蛋白為標(biāo)記目標(biāo)，來研究它們對海馬神經(jīng)元初級纖毛的染色標(biāo)記情況，并初步探討初級纖毛在發(fā)育中的變化情況，同時(shí)對腦中另一重要細(xì)胞類型——星型膠質(zhì)細(xì)胞也進(jìn)行了相應(yīng)的免疫熒光染色觀察。本研究為體外神經(jīng)元初級纖毛的研究及進(jìn)一步豐富對初級纖毛特點(diǎn)和功能的認(rèn)識奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為臨床相關(guān)疾病研究提供了參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar 大鼠(孕18 d)。

1.1.2 主要試劑 L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Neurobasal、B27、L-多聚賴氨酸、PBS (磷酸鹽緩沖溶液)、 鼠抗微管相關(guān)蛋白(MAP2)單抗、兔抗ARL13B多克隆抗體、兔抗ACIII多克隆抗體、鼠抗GFAP單抗、山羊抗兔488-IgG、山羊抗兔594-IgG、山羊抗鼠594-IgG、山羊抗鼠488-IgG 、DAPI(4′, 6-diamidino-2-phenylindole)。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺、顯微解剖鏡、培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡)。

1.2 方法

1.2.1 胎鼠海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

孕18 d Wistar 大鼠, 頸椎脫臼法處死，超凈臺內(nèi)，無菌條件下取胎鼠的海馬組織，0.05%胰蛋白酶37℃消化8 min, 然后用含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化作用，吹散細(xì)胞后用離心機(jī)300 r/min，離心8 min。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以適當(dāng)密度接種于多聚賴氨酸包被過的已加入培養(yǎng)基的六孔板內(nèi)的蓋玻片上，于37℃，5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換半液。培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)液是含有2% B27 的Neurobasal培養(yǎng)液, 培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液是含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。為了抑制海馬神經(jīng)元培養(yǎng)中膠質(zhì)細(xì)胞的生長復(fù)制，第3天在海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷(Ara-C; Sigma-Aldrich)，終濃度為10 μm/mL。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

1)將分別培養(yǎng)1 d、4 d、7 d及14 d的海馬神經(jīng)元經(jīng)含4%多聚甲醛(PFA)及4%蔗糖的PBS 固定10 min;2)用PBS洗3次(5 min/次);3)用含0.4%TritonX-100的PBS室溫透化40 min;4)含有10%山羊血清的PBS室溫封閉1 h;5)PBS配制的一抗稀釋液，4℃孵育過夜;6)PBS洗3次(5 min/次)；7)PBS配制的熒光二抗:結(jié)合488或594熒光素的山羊抗兔IgG(1∶500)、結(jié)合594或488熒光素的山羊抗鼠IgG (1∶500)，室溫孵育1 h;8)PBS洗3次(5 min/次);9)DAPI染色5 min;10) PBS洗3次(5 min/次)；11)封片。

1.2.3 觀察，拍照

在倒置熒光顯微鏡下，觀察初級纖毛的染色情況，并拍照記錄。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量結(jié)果采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1 ACIII抗體與ARL13B抗體免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

從免疫熒光結(jié)果中可以看出，體外培養(yǎng)7 d的大鼠海馬神經(jīng)元無論是用ACIII還是ARL13B進(jìn)行免疫熒光染色，均能明顯地觀察到陽性染色的初級纖毛，但抗ARL13B抗體較抗ACIII抗體的染色效果更特異(見圖1)。從免疫熒光圖中看出，抗ACIII抗體標(biāo)記的紅色纖毛之外有非特異的紅色雜點(diǎn)(圖1A)，而抗ARL13B抗體無此現(xiàn)象(圖1B)。

2.2 初級纖毛的生長變化情況

同樣應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)，對獲取的不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果中的初級纖毛長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2B。隨著神經(jīng)元體外培養(yǎng)天數(shù)的增加，分別選擇1 d、4 d、7 d和14 d, 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行免疫熒光染色標(biāo)記見圖2A，發(fā)現(xiàn)隨著神經(jīng)元的成熟，初級纖毛也不斷生長。ARL13B標(biāo)記組初級纖毛長度從第1天的約3.3 μm到第14天的8.5 μm，不斷增長。ACIII標(biāo)記組的初級纖毛長度變化為，第1天的約4.4 μm到第14天的9.1 μm不斷增長。

2.3 星型膠質(zhì)細(xì)胞中初級纖毛的染色 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在此作為星型膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記分子。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在星型膠質(zhì)細(xì)胞中，ACⅢ和ARL13B也能較好地被染色，特異地顯示初級纖毛。

圖1 不同抗體標(biāo)記海馬神經(jīng)元的免疫熒光圖

A：ACIII抗體染色為紅色，MAP2染色為綠色；B：ARL13B抗體染色為紅色，MAP2染色為綠色。A和B中箭頭表示ACIII或ARL13B標(biāo)記的初級纖毛；星號(*)指示ACIII組的非特異性染色。比例尺：10 μm

圖2 初級纖毛的生長變化情況(培養(yǎng)不同時(shí)間)

A：ACIII和ARL13B免疫熒光染色的代表性圖片；B：初級纖毛長度的統(tǒng)計(jì)圖

圖3 星型膠質(zhì)細(xì)胞初級纖毛的染色標(biāo)記Fig 3 The staining of primary cilia in astrocytesA：ACIII染色組，ACIII用綠色熒光表示，GFAP用紅色熒光表示；B：ARL13B染色組，ARL13B用綠色熒光表示，GFAP用紅色熒光表示。箭頭表示標(biāo)記的初級纖毛。比例尺：10 μm

3討論

隨著科學(xué)及醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，纖毛在生物體內(nèi)的功能，特別是人類疾病方面所扮演的角色，越來越受到關(guān)注[9, 10]。因此，更好地弄清楚纖毛的功能及作用機(jī)制，也成為當(dāng)前科研領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。一般將不可動的纖毛稱為初級纖毛，它與可動纖毛主要的區(qū)別是不參與幫助液體流動。初級纖毛是一類廣泛存在于體內(nèi)各類細(xì)胞中的，以微管為中心的細(xì)胞表面附屬器，具有感受和傳導(dǎo)多種細(xì)胞周圍的刺激信號，如生長因子、激素、氣味分子和發(fā)育形態(tài)發(fā)生素的濃度以及滲透壓、光強(qiáng)、液體流動等多種功能，因此對機(jī)體的正常發(fā)育和維持正常的生理功能有重大作用[5]。初級纖毛在腦中也有廣泛的分布，而且研究發(fā)現(xiàn)有多種人類遺傳疾病與腦內(nèi)纖毛功能異常密切相關(guān)，包括Joubert綜合征，Meckel綜合征等[11, 12]，但是它的具體功能機(jī)制仍然不清楚。特別是，這些綜合征都具有典型的精神呆滯、行動遲緩等特征。由此可知，初級纖毛對于正常的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能至關(guān)重要。因此，研究神經(jīng)系統(tǒng)中初級纖毛的結(jié)構(gòu)與功能意義重大。為了更好、更方便地研究初級纖毛的內(nèi)在結(jié)構(gòu)和工作機(jī)制，首先我們要尋找合適的體外研究神經(jīng)元初級纖毛的模型系統(tǒng)。體外研究神經(jīng)元初級纖毛模型的建立，首先是要描述和證明它的分布，傳統(tǒng)手法使用電鏡已經(jīng)證明和描述神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上均有初級纖毛分布，但此實(shí)驗(yàn)方法操作復(fù)雜，難度大，限制了它的推廣以及對初級纖毛的探究[13]。本研究選用操作簡便的免疫熒光實(shí)驗(yàn)為手段，選擇2個(gè)在纖毛上分布的ACⅢ和ARL13B蛋白作為標(biāo)記分子，對海馬神經(jīng)元的初級纖毛進(jìn)行熒光標(biāo)記，來研究它們對初級纖毛的指示情況。ACⅢ蛋白是腺苷酸環(huán)化酶家族中的一種，已經(jīng)證明，在嗅神經(jīng)初級纖毛中富含ACⅢ的表達(dá)[13, 14]。ARL13B蛋白是屬于ADP核糖基化因子家族和GTP酶Ras超家族的纖毛蛋白，研究已證明它對于纖毛結(jié)構(gòu)的形成以及纖毛功能的發(fā)揮是必需的[15]。那么它們能在研究神經(jīng)元初級纖毛中, 特異地、明顯地顯示初級纖毛，從而作為初級纖毛的指示標(biāo)記嗎？因此，以尋找初級纖毛標(biāo)記分子為研究目的，我們開展了本項(xiàng)研究。

雖然Kirk Mykytyn實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對體外培養(yǎng)的新生小鼠的海馬神經(jīng)元的纖毛進(jìn)行染色標(biāo)記研究，但與之以Six somatostatin receptor 3和ACIII 2種蛋白為研究對象不同，本研究以ARL13B和ACIII為研究對象，另外不同的是本研究以體外原代培養(yǎng)的孕18d大鼠的胎鼠海馬神經(jīng)元為材料[7]。本研究發(fā)現(xiàn)ACIII抗體和ARL13B抗體都能夠較好地標(biāo)記初級纖毛，可以作為標(biāo)記初級纖毛的靶標(biāo)分子。本研究還對初級纖毛在海馬神經(jīng)元的發(fā)育過程中的變化情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)初級纖毛會伴隨著海馬神經(jīng)元的成熟不斷生長變化。這與許多實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)提出的初級纖毛能影響機(jī)體和腦的發(fā)育這個(gè)觀點(diǎn)相一致，也為我們對纖毛的了解拓寬了視野。同時(shí)對星型膠質(zhì)細(xì)胞中這兩種分子進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)它們同樣能對星型膠質(zhì)細(xì)胞的初級纖毛有很好地標(biāo)記作用，因此在對星型膠質(zhì)細(xì)胞纖毛的研究中，ARL13B和ACIII也是作為標(biāo)記信號的良好選擇。

綜上所述，ACⅢ和ARL13B均可作為海馬神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的初級纖毛的染色標(biāo)記信號分子，用于后續(xù)研究中識別初級纖毛。

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The research of staining technology of primary cilium in hippocampal neurons

ZHOU Xiao-chun1, WANG Shan-shan1, AN Yun-he2

(1. Tangshan City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Tangshan 063000;2. Beijing Center for Physical & Chemical Analysis， Beijing 100089, China)

AbstractTo explore the staining methods of primary cilia in cultured rat primary hippocampal neurons, primary culture of 18 day fetal rats′ hippocampal neurons was used in this study. In cellular level，the immunofluorescence staining was used to label the primary cilia of hippocampal neurons at different culture time points and with different antibodies recognizing of different ciliary protein (anti-ADP-ribosylation factor-like protein 13B (ARL13B) antibody，anti-Type III adenylyl cyclase (ACIII) antibody). Fluorescence images were acquired by an inverted fluorescence microscope. From the results, we found that both anti-ARL13B antibodies and anti-ACIII antibodies can label the primary cilia of hippocampal neurons, although anti-ARL13B antibodies with more specific labeling effect. The length of primary cilia increasd during the development of hippocampal neuron cultured in vitro (anti-ACIII antibody groups：the length of primary cilia increases from 21.6 μm at the 1stday to 44.6 μm at the 14thday; anti-ARL13B antibody groups：the length of primary cilia increases from 15.2 μm at the 1stday to 37.6 μm at the 14thday) . The same immunofluorescence experiments were done in astrocyte with these two antibodies. They can also label the primary cilia of astrocyte. To some extent, both anti-ARL13B antibodies and anti-ACIII antibodies can act as the marker of the primary cilia in hippocampal neurons. The primary cilia growed during development of hippocampal neurons cultured in vitro. Accordingly, primary cilia must play an important role in the development of hippocampal neurons. ARL13B and ACIII can also act as the marker of the primary cilia of astrocytes.

Key wordsprimary cilia ; hippocampal neurons; immunofluorescence; ADP-ribosylation factor-like protein 13B； type III adenylyl cyclase

收稿日期：2015-08-17；修回日期：2015-09-06

基金項(xiàng)目：北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干項(xiàng)目(201522)

作者簡介：周曉春，主治醫(yī)師，從事神經(jīng)內(nèi)科研究，E-mail：zhoujingmingzjm@163.com； 通信作者：安云鶴，博士，助理研究員，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，E-mail：anyunhe_bio@163.com。

中圖分類號Q246

文獻(xiàn)標(biāo)識碼B

文章編號2095-1736(2016)03-0107-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.107