N-乙酰半胱氨酸對大鼠腦出血后細胞凋亡及熱休克蛋白70表達的影響

袁志俊　李小剛　何曉英　李嬌紅

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川　瀘州　646000)

N-乙酰半胱氨酸對大鼠腦出血后細胞凋亡及熱休克蛋白70表達的影響

袁志俊李小剛何曉英李嬌紅

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州646000)

〔摘要〕目的通過觀察N-乙酰半胱氨酸(NAC)對大鼠腦出血(ICH)后細胞凋亡及熱休克蛋白(HSP)70的影響,探討NAC對大鼠ICH后神經(jīng)功能的恢復(fù)作用。 方法健康雄性SD大鼠90只隨機分為對照組、ICH組、NAC組。采用大鼠自體尾動脈血50 μl注入建立腦出血模型，NAC組于術(shù)后30 min經(jīng)腹腔注射NAC。ICH組、NAC組按斷頭取腦時間不同分為6個亞組，給予TUNEL染色、免疫組化染色檢測血腫周圍HSP70的表達。結(jié)果ICH組、NAC組HSP70、TUNEL陽性細胞數(shù)高于對照組(P<0.05)；NAC組自12 h起各時間點HSP70表達較ICH組增多(P<0.05)，TUNEL細胞較ICH組減少(P<0.05)；各組高峰時間均在72 h。結(jié)論ICH后血腫周圍細胞凋亡與HSP70表達有關(guān)，NAC可能通過升高HSP70的表達，減少出血性腦損傷血腫周圍腦組織的神經(jīng)元凋亡，以達到恢復(fù)神經(jīng)功能的作用。

〔關(guān)鍵詞〕腦出血；N-乙酰半胱氨酸；細胞凋亡；熱休克蛋白70

腦出血(ICH)起病急、病情兇險、致殘率和死亡率高，致死率大于50%，40%的存活者遺留嚴重殘疾，并具有早期神經(jīng)功能不穩(wěn)和惡化的傾向與風(fēng)險,嚴重威脅人類健康〔1〕。目前仍以脫水降顱壓、血腫清除、清除氧自由基、營養(yǎng)神經(jīng)、對癥、康復(fù)治療為主。研究表明引起出血性腦損傷原因有血腫的占位效應(yīng)、對周邊組織的直接破壞、腦水腫、自由基的產(chǎn)生、繼發(fā)性炎癥反應(yīng)、缺血、炎癥、細胞毒性、谷氨酸受體過度激活、脂質(zhì)過氧化作用、血腦屏障的破壞和細胞凋亡等因素〔2〕。熱休克蛋白(HSP)是機體在遭受各種應(yīng)激刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種應(yīng)激蛋白,對細胞具有保護作用,與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾患關(guān)系密切〔3〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起作用，減少大鼠的神經(jīng)細胞凋亡〔4〕,但其機制尚不明確。本實驗通過研究NAC對腦出血后細胞凋亡及HSP70表達的影響及兩者之間的相關(guān)分析,探討ICH后的細胞凋亡是否與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組健康雄性SD大鼠90只,體重250～280 g,鼠齡2～3個月(由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。實驗動物隨機分為對照組(n=30)、 ICH組(n=30)、NAC組(n=30)3組。ICH組、NAC組按斷頭時間不同各分為3 h、6 h、12 h、24 h、72 h、7 d共6個亞組,每亞組5只(n=5)。

1.2主要實驗試劑及藥物TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(購于上海麥約爾生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)地：瑞士)、兔抗鼠HSP70單克隆抗體、二抗(生物素化山羊抗大鼠IgG)、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，以上試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，NAC(購于陜西帕尼爾生物科技有限公司，產(chǎn)地：陜西西安)。

1.3主要實驗儀器鼠腦立體定向儀(瀘州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物實驗室提供)；50 μl微量注射儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；石蠟切片機，Olympus光學(xué)顯微鏡，光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)，均由瀘醫(yī)附院中心實驗室提供。

1.4實驗方法與步驟

1.4.1制備大鼠ICH模型改良周中和等〔5〕改良的2次注入法，大鼠稱重后給予1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，然后俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上。常規(guī)備皮消毒,沿頭皮正中切開一長約1 cm縱切口,切開骨膜,鈍性分離暴露前囟。調(diào)整立體定位儀,將微量注射儀尖端定位于前囟后0.5 mm,中線右側(cè)旁開3 mm處,用微型手鉆在此處鉆一直徑0.5 mm的小孔。迅速斷尾取血50 μl，通過顱骨鉆孔垂直緩慢進針6 mm(為尾狀核位置),先將10 μl血液注入，停針2 min，繼續(xù)2 min內(nèi)緩慢注入40 μl，留針4 min，退針2.0 mm,再停針4 min，最后緩慢完全退出,局部用骨蠟封閉后縫合切口。假手術(shù)組以生理鹽水50 μl代替自體血,術(shù)后30 min腹腔注射NAC等量生理鹽水；NAC組術(shù)后30min經(jīng)腹腔注射NAC150 mg/kg(NAC用生理鹽水溶解)×(1～7)d。以上所有操作均在無菌條件下進行，術(shù)畢待大鼠清醒，根據(jù)Longa等〔6〕5級評定方法進行神經(jīng)功能缺損評分后置籠喂養(yǎng)，自由活動進食進水，評分1～3分者說明大鼠腦出血模型建立成功，入選本實驗。術(shù)后于動物處死前各時間點采用神經(jīng)功能評分法(NSS)觀察大鼠行為學(xué)評分的變化。NSS評分包括運動、感覺、平衡測試、反射消失或不正常運動、行走，0分為正常,1～6分是輕度損害,7～12分是中度損害,13～18分是重度損害。

1.4.2取材與處理分別取3、6、24、48、72 h、7 d時間點大鼠，10%水合氯醛(3.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，心臟灌注生理鹽水以及4%多聚甲醛，灌注完畢迅速斷頭取腦，將腦組織放于4%甲醛溶液中固定保存，以作石蠟切片，用于疫組化染色和細胞凋亡檢測。

1.4.3TUNEL法測細胞凋亡切片常規(guī)脫蠟入水;復(fù)合消化液處理切片于37℃孵箱內(nèi)15 min;磷酸緩沖液(PBS)沖洗5 min×3;滴加TUNEL混合液,每張切片50 μl,37℃,孵育80 min,PBS沖洗,5 min×3;滴加底物DAB,每張切片50 μl,室溫下10 min;PBS沖洗,5 min×3;梯度酒精脫水至封片。

1.4.4免疫組化HSP70染色大鼠腦細胞HSP70染色，采用SABC法,步驟簡述如下：常規(guī)切片脫蠟至水,3%H2O2室溫封閉；將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液中,微波爐加熱至沸騰,循環(huán)2～3次，間,隔5～10 min;山羊血清封閉液;分別滴加一抗;加二抗室溫孵育20 min;滴加試劑鏈霉素親和素生物素復(fù)合物(SABC),室溫孵育2 h。以上各步驟均需PBS漂洗×3次;DAB染色,蘇木素輕度復(fù)染,進行脫水、透明、封片、觀察。TUNEL陽性細胞、HSP70抗體染色后在光鏡下觀察，并于顯微鏡(×40)下選擇陽性細胞表達明顯區(qū)域的5個相鄰視野區(qū)，分別計算每個視野(光學(xué)顯攝鏡40倍下為125 μm×125 μm)的陽性細胞數(shù)，以陽性細胞的均值作為TUNEL、HSP70的表達量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0軟件行t檢驗、單因素方差分析，兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗，相關(guān)性采用直線分析。

2結(jié)果

2.1各組NSS比較ICH組和NAC組與對照組比較，神經(jīng)功能缺損程度重(P<0.05)；NAC組與ICH組比較，神經(jīng)功能缺損程度較輕(P<0.05)；ICH組、NAC組72 h神經(jīng)功能缺損最重(P<0.05)，見表1。

2.2各組大鼠在不同時間點凋亡細胞的表達TUNEL陽性細胞主要見于血腫周圍區(qū)域及同側(cè)皮質(zhì)，其表現(xiàn)為細胞皺縮,核染色陽性,核固縮,核內(nèi)染色質(zhì)濃縮聚集于核周,呈新月形、環(huán)形、長條形及塊狀小體。凋亡細胞主要是神經(jīng)元,部分為神經(jīng)膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞。對照組少見或未見TUNEL陽性細胞；ICH組3 h、6 h可見少量TUNEL染色陽性細胞，24、48 h逐漸增多，72 h達高峰(P<0.05)，7 d時仍有表達,與對照組的各個時間點比較,表達增多(P<0.05)；NAC組與ICH組的各時間點比較，表達減少(P<0.05)，但未能改變凋亡細胞表達的高峰時間，見表1。

2.3各組大鼠不同時間點HSP70的表達陽性細胞主要表達于血腫周圍：對照組可見極少量表達；ICH組3 h、6 h可見少量表達，24 h逐漸增多，48 h明顯增多，72 h達高峰(P<0.05)，7 d時仍有表達,與對照組的各個時間點比較，表達增多(P<0.05)；NAC組與ICH組的各時間點比較表達減少(P<0.05)，但未能改變陽性細胞表達的高峰時間，見表1。

2.4血腫周圍細胞凋亡與HSP70表達的相關(guān)性凋亡細胞與HSP70的表達呈正相關(guān)(r=0.958，P<0.05)。

表1　各組大鼠不同時間點NSS、凋亡細胞、HSP70比較

與對照組比較：1)P<0.05；與ICH組比較：2)P<0.05；與本組內(nèi)其他時間點比較：3)P<0.05

3討論

研究ICH的病理生理機制和治療方法已成為當(dāng)前熱點。NAC是一種抗氧化劑,其分子式為C5H9NO3S,為谷胱甘肽(GSH)的前體,其含有活躍的-SH,作為小分子物質(zhì),比較容易進入細胞，具有抗氧化清除氧自由基，抗細胞凋亡，抗血管生成，祛痰，調(diào)節(jié)細胞的代謝活性，預(yù)防DNA損傷，調(diào)整基因表達和信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，抑制惡性腫瘤發(fā)展，抑制新生物生成和轉(zhuǎn)移等作用〔7～13〕。神經(jīng)細胞凋亡是ICH后功能缺損的機制之一，而NAC作為一種抗氧化劑，有減少細胞凋亡的作用。本實驗顯示NAC組凋亡細胞表達較ICH組少，證實NAC具有抗凋亡作用。

HSP是機體細胞在創(chuàng)傷、感染、中毒、缺氧等應(yīng)激條件誘導(dǎo)下,激活HSP基因,高效表達的一組進化上高度保守的蛋白質(zhì),對機體免受應(yīng)激因素的損害具有重要作用〔14〕。按照其分子量大小可分為4個家族,HSP90(83～90 kD)家族、HSP70(66～78 kD)家族、HSP60家族及小HSP家族〔15〕。HSP70是其中最保守、最主要、含量最豐富的一類,在應(yīng)激后生成最為顯著。研究表明HSP70可減少腦出血大鼠血腫周圍的凋亡細胞，減輕炎癥反應(yīng)及腦水腫的程度〔16,17〕。本實驗結(jié)果說明NAC可能通過促進HSP70的表達，減少血腫周圍腦組織的神經(jīng)細胞凋亡，以達到恢復(fù)神經(jīng)功能的作用。

總之，NAC可能通過促進HSP70的表達，進而抑制神經(jīng)細胞凋亡，對腦出血有抗氧化、抗凋亡和保護神經(jīng)功能的作用。但NAC具體是如何調(diào)節(jié)HSP70含量和抑制細胞凋亡的機制目前尚不清楚，需進一步研究以明確。

4參考文獻

1Riggs JE,Libell DP,Brooks CE,etal.Impact of institution of a stroke propramup on referral biasatarural academic medical center〔J〕.Rural Health,2005;21:269.

2Orakclog UB,Becker K,Sakowitz OW,etal.Serial diffusion and perfusion MRI analysis of the perihemorrhagic zone in a rat ICH model〔J〕.Acta Neurochir Suppl,2008;103:15-8.

3雷浪，雷友香，馮瓊.誘導(dǎo)型HSP70與腦損傷關(guān)系的研究進展〔J〕.實用臨床醫(yī)學(xué)，2010;11(4)：117-20.

4Lee YM,Park SH,Shin DI,etal.Oxidative modification of peroxiredoxin is associated with drug-induced apoptotic signaling in experimental models of Parkinson disease〔J〕.Biol Chem,2008;283(15):9986-98.

5周中和，曲方，何祥，等.一種改良大鼠自體血腦出血模型：二次注血/退針法〔J〕.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2004;12(4)：406-8.

6Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20:84-91.

7劉輝國，張志鋒，高永平,等.N-乙酰半胱氨酸對慢性間隙性缺氧大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及氧化應(yīng)激的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2008;24(1)：36-9.

8Rushworth GF,Megson IL.Existing and potential therapeutic uses for N-acetylcysteine:the need for conversion to intracellular glutathione for antioxidant benefits〔J〕.Pharmacol Ther,2014;141(2):150-9.

9Haber M,Abdel Baki SG,Grin'kina NM,etal.Minocycline plus N-acetylcysteine synergize to modulate inflammation and prevent cognitive and memory deficits in a rat model of mild traumatic brain injury〔J〕.Exp Neurol，2013；249:169-77.

10Lin H,Liu XB,Yu JJ,etal.Antioxidant N-acetylcysteine attenuates hepatocarcinogenesis by inhibiting ROS/ER stress in TLR2 deficient mouse〔J〕.PLoS One,2013;8(10):e74130.

11Takhtfooladi MA,Jahanshahi A,Sotoudeh A,etal.The antioxidant role of N-acetylcysteine on the testicular remote injury after skeletal muscle ischemia and reperfusion in rats〔J〕.Pol J Pathol,2013;64(3):204-9.

12Zhang QS,Marquez-Loza L,Sheehan AM,etal.Evaluation of resveratrol and N-acetylcysteine for cancer chemoprevention in a Fanconi anemia murine model〔J〕.Pediatr Blood Cancer,2014;61(4):740-2.

13Talasaz AH,Khalili H,Fahimi F,etal.Effects of N-acetylcysteine on the cardiac remodeling biomarkers and major adverse events following acute myocardial infarction:a randomized clinical trial〔J〕.Am J Cardiovasc Drugs,2014;14(1):51-61.

14Gong WJ,Golic KG.Loss of Hsp70 in Drosophila is pleiotropis,With effects on thermotolerance,neuro-degeneration〔J〕.Genetics,2006;172(1):275-86.

15任寶波,王玉艷,王純凈,等.HSP70家族的分類及基因結(jié)構(gòu)與功能〔J〕.動物醫(yī)學(xué)進展,2005;26(1):98-101.

16Manaenko A,Fathali N,Chen H,etal.Heat shock protein 70 upregulation by geldanamycin reduces brain injury in a mouse model of intracerebral hemorrhage〔J〕.Neurochem Int,2010;57(7):844-50.

17Sinn DI,Chu K,Lee ST,etal.Pharmacological induction of heat shock protein exerts neuroprotective effects in experimental intracerebral hemorrhage〔J〕.Brain Res,2007;1135(1):167-76.

〔2012-04-02修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(110368)

通訊作者：李小剛(1958-)，男，主任醫(yī)師，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病的研究。

〔中圖分類號〕R743

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2330-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.008

第一作者：袁志俊(1988-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管病的研究。