Oct4B1在結(jié)直腸癌干細胞中的表達及意義①

程家平　黎　江　蘇　弦　陳奕霖　曾慶良　文坤明

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義563003)

Oct4B1在結(jié)直腸癌干細胞中的表達及意義①

程家平黎江蘇弦陳奕霖曾慶良文坤明

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義563003)

[摘要]目的：探討胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4的亞型Oct4B1在結(jié)直腸癌干細胞中的表達及其可能的作用。方法：以結(jié)直腸癌細胞株SW480細胞采用懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)出的3D微球體及其親本細胞SW480為研究對象，采用細胞分化實驗、細胞軟瓊脂克隆實驗、流式細胞技術(shù)檢測干細胞標記物CD133、CD44的表達以驗證3D微球體是否富集腫瘤干細胞(CSCs)，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測兩種細胞Oct4B1 mRNA表達水平。結(jié)果：3D微球體具有分化為普通腫瘤細胞的能力，相對于親本細胞，3D微球體體外克隆形成能力明顯增強(P<0.01)，干細胞標記物CD133、CD44明顯高表達(P<0.01)，Oct4B1 mRNA表達水平明顯增高(P<0.01)。結(jié)論：干細胞調(diào)控因子Oct4的亞型Oct4B1在富集結(jié)直腸癌CSCs的3D微球體中表達明顯增高，其可能參與結(jié)直腸癌CSCs的調(diào)控。

[關(guān)鍵詞]結(jié)直腸癌；腫瘤干細胞；Oct4；Oct4B1

Oct4基因是維持胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ES)多能性及自我更新主要調(diào)節(jié)劑。近來，越來越多的報道顯示Oct4在多種惡性實體腫瘤中有異常表達，并且發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤干細胞(Cancer stem cells，CSCs)的調(diào)控[1,2]。人Oct4基因通過選擇性剪切產(chǎn)生3個主要的亞型，稱為Oct4A、Oct4B及Oct4B1[3]。Oct4A和Oct4B是在1992年證實的，大多數(shù)報道把重點放在Oct4A的研究上，其作為維持ES干細胞特性的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被證實。Oct4B1是最近才發(fā)現(xiàn)的Oct4的轉(zhuǎn)錄本，其在人ES及胚胎癌中表達，當這些細胞分化時Oct4B1表達下調(diào)，Papamichos等[4]認為Oct4B1可能是研究比較成熟的Oct4A更可靠的干細胞標記物，具有調(diào)節(jié)多能性的功能。在胃癌及結(jié)直腸癌中等多種腫瘤中已發(fā)現(xiàn)了Oct4B1有表達[5,6]。但目前尚未見Oct4B1在CSCs中的表達及作用的研究報道。本研究通過懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)富集結(jié)直腸癌CSCs的3D微球體，檢測Oct4B1的表達水平，推測其可能的作用。

1材料與方法

1.1材料SW480購自中國科學(xué)院上海細胞庫，胎牛血清(FBS)、L-15培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，B-27購于美國Gibco公司，EGF、FGF購自美國peprotech公司，Stempro Accutase cell購自美國Invitrogen公司，CD133-FITC、CD44-PE抗體購自德國Miltenyi Biotec公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連TaKaRa公司，通用型SYBR快速定量試劑盒購于美國KAPA公司。

1.2方法

1.2.13D微球體的培養(yǎng)將生長狀態(tài)良好、細胞融合度達80%的SW480細胞用PBS緩沖液清洗3遍后，加入適量干細胞培養(yǎng)液[含EGF(20 ng/ml)、FGF(10 ng/ml)、B-27(1∶50)的無血清L-15培養(yǎng)基]，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后更換上述培養(yǎng)液，去除凋亡脫落的細胞，之后待培養(yǎng)基顏色變淡后，適時加入適量的干細胞培養(yǎng)液，待折光性良好的3D微球體形成后，利用細胞球的重力作用，將細胞球與其他漂浮的死細胞進行分離純化；細胞球繼續(xù)在干細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)待3D微球體體積平均增大2倍左右時，進行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.2.23D微球體分化實驗在上述純化后的3D微球體中加入適量含10%FBS的L-15培養(yǎng)基，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察3D微球體是否逐漸貼壁生長及細胞形態(tài)變化；對貼壁生長的細胞，用0.25%胰酶消化后繼續(xù)以含10%FBS培養(yǎng)基在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，并照相記錄。

1.2.33D微球體及親本細胞的軟瓊脂克隆形成實驗用三蒸水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低熔點瓊脂糖液，高壓滅菌后，保存在60℃的烤箱中使其不會凝固。取上述純化后的3D微球體及親本細胞SW480，用Accutase酶及0.25%胰酶消化為單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，并用含20%FBS的L-15培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×106細胞/L的細胞懸液，按1∶1比例使1.2%的瓊脂糖和含20%FBS的L-15培養(yǎng)基混合后，取3 ml混合液注入直徑6 cm玻璃平皿中，冷卻凝固，作底層瓊脂，置CO2溫箱中備用。按1∶1比例使0.7%的瓊脂糖和含20%FBS培養(yǎng)基在無菌試管中混勻，再向管中加入0.5 ml的細胞懸液充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，固形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d。在倒置顯微鏡下，觀察>50個細胞克隆數(shù)，以克隆形成率反映克隆形成能力，克隆形成率=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%[7]。

1.2.4流式細胞儀檢測3D微球體及親本細胞的CD133、CD44陽性細胞百分率取上述純化后的3D微球體及親本細胞，相應(yīng)的消化酶消化為單細胞懸液，每個檢測樣本細胞數(shù)量為1.0×106，用PBS洗滌后加入含0.5%BSA的PBS液重懸細胞，分別避光加入10 μl CD44-PE、CD133-FITC一抗及相應(yīng)的陰性對照抗體，4℃避光孵育10 min，用PBS洗滌后加入100 μl PBS重懸細胞，送流式細胞儀檢測熒光陽性細胞百分率(以上操作重復(fù)3次)。

1.2.5RT-qPCR技術(shù)檢測Oct4B1 mRNA的表達情況采用天根公司細胞RNA提取試劑盒提取兩種細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green染料法進行實時定量PCR反應(yīng)。采用25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，59℃ 30 s，40個循環(huán)；65℃ 5 s，95℃ 5 min。繪制熔解曲線。每次檢測均設(shè)立3個復(fù)孔，重復(fù)3次實驗。選擇β-actin為內(nèi)參，運用2-△△Ct方法確定目的基因表達的相對水平[1]。Oct4 B1、β-actin上下游引物由大連寶生物公司合成。其引物序列分別為：Oct4B1：F:5′-AATCCCGAATGGAAAGG-3′， R:5′-GGAACCCACCAA-ATAGAAC-3′； β-actin：F:5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′， R:5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTG-CTG-3′。

2結(jié)果

2.1SW480結(jié)直腸癌細胞在添加EGF、FFG、B-27生長因子的無血清培養(yǎng)基中能形成3D微球體，該3D微球體呈懸浮生長狀態(tài)，排列較致密，繼續(xù)培養(yǎng)后能體積明顯增大變密，見圖1。

2.2加入含10%FBS的L-15培養(yǎng)基后，3D微球體在1～2 d開始出現(xiàn)貼壁，不再懸浮生長，3～4 d時，細胞球邊緣出現(xiàn)與SW480腫瘤細胞相似的細胞偽足，通過0.25%胰酶消化細胞繼續(xù)含10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞能繼續(xù)生長，形態(tài)與親本SW480腫瘤細胞相似。見圖2。

圖1　SW480結(jié)直腸癌腫瘤細胞及懸浮培養(yǎng)的3D微球體形態(tài)(×200)Fig.1　Microscopic morphology of SW480 cells and 3D microsphere(×200)Note: A.SW480 cells;B.3D microsphere morphology when cultivated 12 to 15 days;C.3D microsphere morphology when cultivated 20 days,it becomes bigger and more dense.

圖2　3D微球體分化實驗(×200)Fig.2　Results of differentiation of 3D microsphere form(×200)Note: A.3D microsphere;B.3D microsphere began to stick wall growth after adding the 10% fetal bovine serum culture medium;C.When it was subcultured，cells can continue to grow,and it′s morphology similar to parent SW480 cells;D.SW480 cells.

圖3　體外克隆形成實驗鏡下觀察結(jié)果(×200)Fig.3　Microscopic observations results of clone formation in vitro experiments microscopic observations(×200)Note: Compared with 3D microsphere;*.P<0.01.

圖4　流式細胞技術(shù)檢測3D微球體與親本SW480細胞的CD133+、CD44+百分率Fig.4　Percentage of CD133+ and CD44+ cells was detected by flow cytometry

圖5　RT-qPCR檢測3D微球體及SW480的Oct4B1 mRNA表達水平Fig.5　Expression levels of Oct4B1 mRNA were detected by RT-qPCR in 3D microsphere and SW480 cellsNote: Compared with SW480 cells,*.P<0.01.

2.3軟瓊脂克隆形成實驗3D微球體與其親本SW480細胞通過在添加20%FBS的軟瓊脂培養(yǎng)基中都有克隆形成，其克隆形成率分別為(87±6)%和(18±3)%，3D微球體的克隆形成率明顯高于SW480細胞(P<0.01)，結(jié)果提示細胞球的克隆形成能力明顯高于親本細胞。

2.4流式細胞直接發(fā)法檢測CD133、CD44陽性細胞百分率：親本細胞與3D微球體相比較，CD133+細胞的比例由(5.45%±1.21%)上升到(16.58%±2.32%)(P<0.01)，CD44+細胞的比例由(59.61%±2.87%)上升到(90.21%±3.11%)(P<0.01)，見圖4。

2.5RT-qPCR檢測Oct4B1 mRNA的表達情況親本細胞與3D微球體Oct4B1 mRNA的相對水平分別為(1.00±0.15)及(27.36±2.56)，3D微球體較親本SW480細胞增高約27倍(P<0.01)，見圖5。

3討論

結(jié)直腸癌是發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤[8]，手術(shù)及化療是其最主要的治療方法，盡管實施了標準的根治性切除手術(shù)及規(guī)范的化療，但其治療效果仍不滿意，5年生存率仍徘徊在50%，對化療藥物耐藥是其治療失敗的主要原因[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織內(nèi)存在一小群稱為CSCs的細胞，是眾多腫瘤發(fā)生的起源，也是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根本原因[10]。傳統(tǒng)的化療及放療只能根除腫瘤組織內(nèi)的普通腫瘤細胞，對CSCs則無效。因此，研究CSCs的調(diào)控機制，選擇針對CSCs的治療靶點，將為改善結(jié)直腸癌的治療效果帶來新的希望。

由于CSCs在腫瘤組織中的比例小，為了研究CSCs的功能及調(diào)控機制，常選擇特定的CSCs標記物采用流式或免疫磁珠的方式分選，以及采用化療藥物或懸浮培養(yǎng)的方式富集CSCs。本實驗中，我們采用懸浮培養(yǎng)法，對結(jié)直腸癌SW480細胞使用含干細胞生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出3D微球體，通過細胞分化實驗，軟瓊脂糖克隆實驗及CSCs標記物檢測發(fā)現(xiàn)，該3D微球體在含20%FBS的培養(yǎng)基中能夠分化為貼壁生長的，與親本細胞類似的腫瘤細胞的能力(見圖2)，與親本細胞比較，克隆形成能力明顯增強(P<0.01，見圖3)，CSCs標記物CD133、CD44陽性細胞百分比明顯增高(P<0.01，見圖4)，提示3D微球體富集結(jié)直腸癌CSCs，該3D微球體為我們研究結(jié)直腸癌CSCs的功能及調(diào)控機制建立了良好的研究對象。

Oct4在多能的ES細胞中高表達，在ES細胞分化時Oct4下調(diào)，敲除Oct4基因后使ES細胞分化[11]。因此，調(diào)節(jié)ES細胞多能性及自我更新賦予Oct4作為多能性的標志。近來，越來越多的報道顯示Oct4在多種惡性實體腫瘤中有異常表達。在我們之前的研究中已發(fā)現(xiàn)，Oct4具有維持結(jié)直腸癌CSCs存活的作用[1]，提示Oct4參與結(jié)直腸癌CSCs的調(diào)控，而人Oct4基因存在Oct4A,Oct4B及Oct4B1三個主要亞型。Oct4A和Oct4B是在1992年證實的，之前的大多數(shù)報道把重點放在Oct4A的研究上，其作為維持干細胞特性的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被證實。Oct4B1是最近才發(fā)現(xiàn)的Oct4的轉(zhuǎn)錄本，其在人胚胎干細胞及胚胎癌中表達，當這些細胞分化時Oct4B1表達下調(diào)，Asadi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Oct4B1在胃癌組織中有表達，而在同一病人的癌旁組織無表達或低表達，且Oct4B1在胃癌細胞株AGS中高表達，他們采用RNAi技術(shù)敲除該細胞株中的Oct4B1后，caspase-3/caspase-7活性及細胞凋亡均明顯增高，說明Oct4B1在胃癌中具有癌基因功能，是一種抗凋亡因子。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)Oct4B1在結(jié)腸癌細胞株及結(jié)腸癌耐藥細胞株中均有表達，其作用與促進結(jié)腸癌細胞增殖、遷移、侵襲及降低細胞對奧沙利鉑的化療敏感性有關(guān)[6]。Papamichos等[4]認為Oct4B1可能是比研究比較成熟的Oct4A更可靠的干細胞標記物，具有調(diào)節(jié)多能性的功能。但Oct4B1是否在調(diào)控CSCs方面，亦發(fā)揮重要作用，目前未見相關(guān)文獻報道。

我們采用RT-qPCR檢測了ES干性調(diào)控因子Oct4的亞型Oct4B1的mRNA水平，結(jié)果提示，在富集CSCs的結(jié)直腸癌3D微球體中Oct4B1的mRNA水平較其親本SW480細胞增高約27倍(見圖5，P<0.01)，結(jié)合我們之前的研究發(fā)現(xiàn)[6]，SW480細胞過表達Oct4B1后CSCs標記物CD133及CD44表達量均明顯提高，提示Oct4B1可能參與了結(jié)直腸癌CSCs的調(diào)控，其具體的調(diào)控機制有待進一步研究證實。

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[收稿2015-10-23修回2016-03-10]

(編輯張曉舟)

Expression and significance of Oct4B1 in colorectal cancer stem cells

CHENG Jia-Ping,LI Jiang,SU Xian,CHEN Yi-Lin,ZENG Qing-Liang,WEN Kun-Ming.

Department of Gastrointestinal Surgery,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression and its possible role of Oct4B1 subtype of Embryonic stem cell transcription factor Oct4 in colorectal cancer stem cells.Methods: 3D microspheres were cultured by suspension culture to human colorectal cancer cell line SW480 cells.The 3D microspheres and SW480 cells were used as the research objects.Whether 3D microspheres were enriched cancer stem cells,we used the methods of cell differentiation experiments,soft agar cloning experiments,and the expression levels of cancer stem cells markers CD133,CD44 detected by flow cytometry.The expression levels of Oct4B1 mRNA were detected by RT-qPCR.Results: 3D microspheres could differentiate into normal cancer cells.Compared with the parental SW480 cells,in vitro colony formation was significantly enhanced(P<0.01),the percentage of positive cells of CD133 and CD44 were significantly increased(P<0.01),the expression levels of Oct4B1 mRNA were obviously higher(P<0.01)in 3D microspheres.Conclusion: Oct4B1 subtype of Embryonic stem cell transcription factor Oct4 in 3D microspheres enriched human colorectal cancer stem cells,which may be involved in the regulation of colorectal cancer stem cells.

[Key words]Colorectal cancer;Cancer stem cells;Oct4;Oct4B1

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.005

作者簡介：程家平(1965年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸外科基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail:jiapingzy08@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：文坤明(1978年-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要從事腫瘤干細胞與結(jié)直腸癌多藥耐藥的研究，E-mail:381224619@qq.com。

中圖分類號R735.3

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0794-04

①本文為國家自然科學(xué)基金(No.81260369)及貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金[黔科合(J)字(2012)2365]資助項目。