血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立

楊超一　馮婷婷　張雪峰　盧金輝　王　斌

(原子高科股份有限公司，北京102413)

血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立

楊超一馮婷婷張雪峰盧金輝王斌

(原子高科股份有限公司，北京102413)

[摘要]目的：建立人血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，通過(guò)測(cè)定血漿中血管緊張素Ⅰ的含量計(jì)算腎素活性。方法：用生物素標(biāo)記Ang Ⅰ抗原，熒光素標(biāo)記AngⅠ抗體，將抗熒光素抗體包被于化學(xué)發(fā)光板，以鏈親和素酶為催化劑，采用競(jìng)爭(zhēng)法建立Ang Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。結(jié)果：本方法的測(cè)量范圍為100～7 800 pg/ml，靈敏度為24.3 mU/ml，批內(nèi)變異為5.6%～8.7%，批間變異為6.8%～10.4%，回收率為95.4%～105.3%，稀釋實(shí)驗(yàn)測(cè)定值與理論值呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.999。與放射免疫分析試劑盒的相關(guān)性方程分別為y=0.95x+235.70，相關(guān)系數(shù)r=0.973。包被板、生物素標(biāo)記AngⅠ抗原以及熒光素標(biāo)記AngⅠ抗體在37℃存放一周穩(wěn)定性良好。結(jié)論：方法學(xué)鑒定結(jié)果符合免疫分析的基本要求。

[關(guān)鍵詞]血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)；生物素；熒光素；鏈親和素酶；化學(xué)發(fā)光免疫分析

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)是人體血壓、水和電解質(zhì)平衡的重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對(duì)維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著十分重要的作用。腎素在生理和許多病理情況下，其數(shù)量和活性決定了整個(gè)體系的活性，因此測(cè)定腎素活性對(duì)判斷RAAS活性是非常重要的。實(shí)際臨床中腎素活性是通過(guò)人血漿中AngⅠ產(chǎn)生的速率測(cè)定的，即37℃條件下1 h腎素原被腎素催化轉(zhuǎn)化為Ang Ⅰ的量。目前檢測(cè)血漿中腎素活性、血管緊張素Ⅱ和醛固酮含量已經(jīng)成為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓、原發(fā)性醛固酮增多癥等疾病的診斷、治療及研究的重要指標(biāo)[1-5]。此外對(duì)一些相關(guān)慢性心力衰竭、腎病、肝硬化等疾病的診斷、治療以及發(fā)病機(jī)理的探討有著重要的臨床意義[6-8]。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是近十幾年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)[9]，在實(shí)際應(yīng)用中具有無(wú)放射性污染、較高靈敏度和特異性免疫反應(yīng)、易普及推廣等優(yōu)點(diǎn)。本工作采用競(jìng)爭(zhēng)法建立了血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(1420 Multilabled Counter)為芬蘭Wallac產(chǎn)品；伽瑪計(jì)數(shù)器(GAMMA-C12)為美國(guó)DP公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑熒光素、生物素、血管緊張素Ⅰ抗原為Sigma產(chǎn)品； 96孔化學(xué)發(fā)光板為Nunc產(chǎn)品；抗熒光素抗體為北京華信行科技有限公司產(chǎn)品；鏈親和素酶為Xema產(chǎn)品；血管緊張素Ⅰ抗體、發(fā)光底物、放射免疫分析試劑盒均由原子高科股份有限公司提供。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品的配制用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB溶液)將AngⅠ配制成0、100、250、625、1 560、3 900、7 800 pg/ml，然后以 1.0 ml/瓶分瓶?jī)鲅b，-20℃保存，使用前用1.0 ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行復(fù)溶。

1.2.2固相抗體的制備用0.05 mol/L pH9.5碳酸緩沖液(CB)稀釋包被抗熒光素抗體至5 μg/ml，并加入發(fā)光板中(200 μl/孔)，置4℃ 過(guò)夜。次日，倒去包被液，拍干。每孔加入250 μl封閉液，37℃溫育1 h。倒掉封閉液后自然晾干備用。

1.2.3生物素標(biāo)記AngⅠ抗原的制備[10]首先用DMSO溶解生物素濃度為1 mg/ml，然后取100 μg生物素加入到200 μg AngⅠ抗原(溶于200 μl 0.5 mol/L的Na2HPO4溶液)中，混合搖勻，用0.02 mol/L的磷酸緩沖溶液(PB)透析3 d，取出后加入等量甘油置于-20℃保存。

1.2.4熒光素標(biāo)記AngⅠ抗體的制備[11]首先用DMSO溶解熒光素為濃度10 mg/ml，然后取16 μg熒光素加入到200 μg AngⅠ抗體(溶于400 μl 0.1mol/L 的CB)中，搖勻混合后，室溫避光攪拌4 h，再用0.02 mol/L的PB透析3 d，取出后加入等量甘油置于-20℃保存。

1.2.5化學(xué)發(fā)光免疫分析程序?qū)?00 μl標(biāo)準(zhǔn)品、血漿樣品(一份4℃存放，一份37℃保溫1 h)加入已包被好抗熒光素抗體的微孔板中；每孔中加入50 μl生物素標(biāo)記的AngⅠ抗原和50 μl熒光素標(biāo)記的AngⅠ抗體； 輕搖混勻，37℃下水浴2 h；傾去微孔中反應(yīng)液，用稀釋好的洗滌液洗滌5次(300 μl/孔)，拍干；每孔再加入200 μl鏈親和素酶，37℃下水浴30 min；傾去微孔中反應(yīng)液，洗滌。將發(fā)光底物A和B按1∶1(體積比)混勻(臨用前新配)。然后分別向每個(gè)微孔中加入200 μl發(fā)光底物溶液，在發(fā)光測(cè)量?jī)x上測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(cps)，測(cè)量時(shí)間0.1秒/孔。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以發(fā)光計(jì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以Logit-log直線回歸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后計(jì)算出：PRA(pg/ml/h)=37℃ 1 h條件AngⅠ濃度值-4℃條件AngⅠ濃度值。

2結(jié)果

2.1方法學(xué)優(yōu)化

2.1.1生物素標(biāo)記抗原工作濃度的選擇用稀釋液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB溶液)將生物素標(biāo)記抗原濃度分別稀釋為1∶10、1∶20、1∶50、1∶100倍，觀察不同生物素標(biāo)記抗原濃度對(duì)免疫分析結(jié)果的影響。結(jié)果如表1所示。根據(jù)其曲線B/B0%和線性相關(guān)系數(shù)，選定生物素標(biāo)記抗原工作濃度為1∶50。

2.1.2熒光素抗體濃度的選擇用稀釋液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB 溶液)將熒光素標(biāo)記抗體濃度分別稀釋為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，觀察不同生物素標(biāo)記抗原濃度對(duì)免疫分析結(jié)果的影響。結(jié)果如表2所示。根據(jù)其曲線B/B0%和線性相關(guān)系數(shù)，選定熒光素標(biāo)記抗體工作濃度為1∶200。

2.2方法學(xué)鑒定

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)方法學(xué)建立，得到的血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2.14x+6.75，r=0.999。

2.2.3精密度對(duì)3份含低、中、高不同濃度的血漿樣品分別在一次實(shí)驗(yàn)中平行多孔測(cè)定和在不同實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測(cè)定，得出PRA的平均值和SD以及變異系數(shù)，結(jié)果列于表3。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)為5.6%～8.7%，批間變異系數(shù)為6.8%～10.4%。可見(jiàn)本方法的精密度較好，符合免疫分析的要求。

表1生物素標(biāo)記抗原濃度選擇

Tab.1Selection of concentration in biotin labeled antigen

Dilution1∶101∶201∶501∶100B/B0%95%84%77%69%rvalue0.9950.9970.9990.996

表2熒光素標(biāo)記抗體濃度選擇

Tab.2Selection of concentration in fluoresce in labeled antibody

Dilution1∶501∶1001∶2001∶400B/B0%94%81%79%79%rvalue0.9960.9980.9990.995

圖1　血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of chemiluminescence immunoass-ay for AngⅠ

2.2.4健全性將一份高濃度血漿樣品進(jìn)行倍比稀釋后測(cè)定，稀釋度與測(cè)定值的線性相關(guān)曲線如圖2所示。經(jīng)計(jì)算測(cè)定值和稀釋度的相關(guān)性方程為：y=3 642x+10.90，相關(guān)系數(shù)r=0.999。

2.2.5回收率將不同濃度的血管緊張素Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品分別以等體積加入到同一份血漿樣品中測(cè)定，測(cè)定結(jié)果列于表4。將測(cè)定結(jié)果與理論值進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算得出本方法的回收率為95.4%～105.3%，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度較好。

2.3方法學(xué)比較用本方法分別與放射免疫分析

表3精密度測(cè)定結(jié)果(pg/ml/h，n=10，%)

Tab.3Precision measurement results (pg/ml/h，n=10，%)

SampleIntra-assayvariationxSDCVInter-assayvariationxSDCV1573.3532.115.6570.8759.3710.421767.26106.046.01719.45116.926.833851.68335.108.73776.92351.259.3

表4回收率測(cè)定

Tab.4Recovery test

Additionamount(pg/ml/h)PRAmeasuredvalue(pg/ml/h)PRAtheoreticalvalue(pg/ml/h)Recoveryrate%01125.32100645.13612.66105.3625890.55875.66101.739002397.082512.6695.4

圖2　稀釋實(shí)驗(yàn)Fig.2　Dilution test

方法同時(shí)測(cè)量63份血漿樣品，并對(duì)計(jì)算得出的PRA值進(jìn)行比較，其相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)圖3?？芍痉椒ㄅc放射免疫分析方法的相關(guān)性方程為y=0.95x+235.70，相關(guān)系數(shù)r=0.973。說(shuō)明本方法與放射免疫分析方法具有良好的相關(guān)性。

2.4穩(wěn)定性

2.4.1抗熒光素抗體包被板的穩(wěn)定性將抗熒光素抗體包被板分別置于37℃ 1、3、5、7 d，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫分析考查其穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。可知抗熒光素抗體包被板在37℃存放一周能保持良好的穩(wěn)定性。

2.4.2生物素標(biāo)記AngⅠ抗原的穩(wěn)定性將生物素標(biāo)記AngⅠ抗原工作液分別置于37℃ 1、3、5、7 d，然后進(jìn)行化發(fā)光免疫分析考查其穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。可知生物素標(biāo)記AngⅠ抗原在37℃存放一周穩(wěn)定性良好。

2.4.3熒光素標(biāo)記AngⅠ抗體的穩(wěn)定性將熒光素標(biāo)記抗體工作液置于37 ℃ 1、3、5、7 d，經(jīng)免疫分析考查其隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果見(jiàn)圖6 ?？芍獰晒馑貥?biāo)記抗體37℃存放一周穩(wěn)定性良好。

圖3　本方法與放射免疫分析方法的相關(guān)性Fig.3　Correlation between this method and radioimmunoassay

圖5　生物素標(biāo)記AngⅠ抗原的穩(wěn)定性Fig.5　Stability of biotin labeled Ang Ⅰ antigen

圖6　熒光素標(biāo)記AngⅠ抗體的穩(wěn)定性Fig.6　Stability of fluorescein labeled Ang Ⅰ antibody

3討論

腎素是一種水解蛋白酶，由腎臟入球小動(dòng)脈的近球細(xì)胞合成，貯存并釋放到血液中，它直接作用于肝臟所分泌的血管緊張素原，使血管緊張素原轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)移酶催化作用下轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅱ，并可引起醛固酮分泌，以此發(fā)揮對(duì)機(jī)體血壓的調(diào)節(jié)作用[12]。

目前測(cè)定腎素活性在臨床上應(yīng)用較為廣泛，臨床檢測(cè)值降低見(jiàn)于原發(fā)性高血壓低腎素型、原發(fā)性醛固酮增多癥、假性醛固酮增多癥、糖皮質(zhì)素抑制性醛固酮增多癥等；升高見(jiàn)于原發(fā)性高血壓高腎素型、巴特綜合征、血管性高血壓、肝硬化、腎上腺功能減退、心力衰竭等。腎素活性的測(cè)定對(duì)于臨床評(píng)估高血壓病人的身體狀況是非常有意義的，尤其可用于診斷腎性高血壓、原發(fā)性醛固酮增多癥，并且可以幫助治療和管理其他類型的高血壓患者。

本工作建立了血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，經(jīng)方法學(xué)鑒定符合免疫分析的基本要求。此外本方法還具有良好的靈敏度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。用本方法與放射免疫分析方法對(duì)樣品的測(cè)量值具有良好的線性相關(guān)。目前臨床高血壓等疾病診斷多采用國(guó)外進(jìn)口試劑，其中測(cè)定腎素活性試劑有德國(guó)DRG和德國(guó)IBL公司的ELISA試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍都為0.2～60 ng/ml，相對(duì)較窄，而且價(jià)格較貴。本工作建立的血管緊張素Ⅰ化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為100～7 800 pg/ml，而且方法建立中使用的抗血管緊張素Ⅰ抗體為本公司自制產(chǎn)品，可以節(jié)約成本，同時(shí)也為其診斷試劑盒的國(guó)產(chǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿2015-10-30修回2015-12-02]

(編輯倪鵬)

Establishment of chemiluminescence immunoassay for AngiotensinⅠ

YANG Chao-Yi,FENG Ting-Ting,ZHANG Xue-Feng,LU Jin-Hui,WANG Bin.

Atomic High Technology Limited Liability Company,Beijing 102413,China

[Abstract]Objective:The chemiluminescence immunoassay for AngiotensinⅠ (AngⅠ ) was developed by the competition method.The renin activity was calculated by the determination of Ang Ⅰ. Methods: AngⅠ antigen was labeled with biotin and fluorescein labeled AngⅠ antibody,and anti fluorescein antibody was used to coated with the microporous plate .Results: The standard range of the method was 100-7 800 pg/ml.The assay sensitivity was 24.3 pg/ml.The intra- and inter-assay coefficients of variance were 5.6%-8.7% and 6.8%-10.4% respectively.Analytical recovery was 95.4%-105.3%.The correlation coefficients between measured and expected values were 0.999 after serial diluted.Compared with radioimmunoassay kit,the correlative equation was y=0.95x+235.70,correlation coefficient was 0.973.Coated microporous plate and biotin labeled Ang Ⅰ antigen,and fluorescein labeled Ang Ⅰantibody at 37℃ for a week with good stability. Conclusion: The results of the method were in accord with the basic requirements of immunoassay.

[Key words]AngiotensinⅠ;Biotin;Fluorescein;Streptavidin-enzyme;Chemiluminescence immunoassay

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.015

作者簡(jiǎn)介：楊超一(1982年-)，女，碩士，助理研究員，主要從事免疫分析診斷試劑開(kāi)發(fā)工作，同時(shí)就職于中國(guó)原子能科學(xué)研究院，E-mail:chaoyi_2008@163.com。

中圖分類號(hào)R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0838-04