CTNNB1基因在卵巢癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

劉海艷　王艷銘　王雨艷　劉麗麗　左中夫

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧　錦州　121000)

·腫瘤·

CTNNB1基因在卵巢癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

劉海艷王艷銘王雨艷劉麗麗左中夫

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的分析CTNNB1在卵巢癌組織中的表達(dá)，探討其與臨床特征的關(guān)系。方法免疫組織化學(xué)方法檢測CTNNB1在正常卵巢上皮組織及卵巢癌組織中的表達(dá)，分析其與臨床特征間的關(guān)系；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測CTNNB1 mRNA的表達(dá)；Western印跡法檢測CTNNB1蛋白的表達(dá)。結(jié)果正常的卵巢上皮組織未發(fā)現(xiàn)CTNNB1存在。在卵巢上皮性腫瘤組織中，93.3%的卵巢癌組織(42/45)出現(xiàn)了CTNNB1胞質(zhì)表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CTNNB1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為染色后胞質(zhì)內(nèi)可見棕褐色的粒狀物；CTNNB1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中的表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者增加明顯，而不同年齡、病理分期、組織學(xué)分化程度間的表達(dá)差異不顯著；CTNNB1 mRNA和蛋白在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株中表現(xiàn)為高表達(dá)，與正常的卵巢上皮組織差異顯著，其中在細(xì)胞株中CAOV3的表達(dá)最高。結(jié)論CTNNB1在卵巢癌組織及細(xì)胞株中均有高表達(dá)，且與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

〔關(guān)鍵詞〕CTNNB1；卵巢癌組織；細(xì)胞株

原發(fā)性卵巢癌是婦科較為常見惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制不清，仍無有效治療手段。近年來大量文獻(xiàn)報(bào)道，CTNNB1基因表達(dá)增加在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤形成過程中發(fā)揮了重要作用〔1～4〕。CTNNB1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤組織中均可見CTNNB1蛋白表達(dá)增加〔5,6〕。但該基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制仍不完全清楚。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與多種因素密切相關(guān)，如TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴細(xì)胞浸潤及細(xì)胞分化等〔7〕。本課題擬探討CTNNB1基因的表達(dá)與卵巢癌TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴細(xì)胞浸潤及細(xì)胞分化程度之間的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1標(biāo)本與材料組織標(biāo)本均來我院婦產(chǎn)科，包括10例正常的卵巢上皮組織及45例惡性卵巢上皮性腫瘤。其中惡性腫瘤中，黏液性囊腺癌21例，漿液性囊腺癌10例，透明細(xì)胞癌8例，內(nèi)膜樣腺癌6例。年齡61～77歲，平均(69.8±8.6)歲。均來源于初次行探查手術(shù)的患者術(shù)中切除，排除探查術(shù)前接受過放化療及其他影響實(shí)驗(yàn)研究的特殊處理者。正常的卵巢上皮組織均來源于子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜異位癥行子宮附件全切者。

1.2方法將每個(gè)腫瘤組織等分為二份，其中一份立即放于液氮中冰凍，另一份用4%甲醛溶液固定后石蠟包埋。人卵巢癌細(xì)胞株CAOV3，SKOV3，A2780由我院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3免疫組織化學(xué)方法檢測CTNNB1的表達(dá)①切片：取石蠟包埋2 d后的標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度保持在3 μm。②烤片：將空白切片放置于60℃烤箱中進(jìn)行烤片，持續(xù)3 h，直至組織切片呈現(xiàn)透明。③脫蠟、水化：取二甲苯1、二甲苯2、無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇依次對經(jīng)過烤片后的標(biāo)本進(jìn)行脫蠟、水化，分別為15 min，最后用蒸餾水沖洗3 min，共計(jì)5次。④孵育：利用新鮮配制3%過氧化氫溶液對其進(jìn)行室溫孵育半小時(shí)，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 min，共計(jì)5次。⑤抗原修復(fù)：處理后的標(biāo)本切片放于枸櫞酸緩沖溶中，水浴15 min(95℃)，室溫下自然冷卻，蒸餾水沖洗5次；⑥封閉：10%山羊血清于37℃恒溫箱中，封閉15 min，甩去血清，切忌清洗。⑦加液：滴加鼠抗人CTNNB1抗體(溶液配比1∶100)在40℃下過夜，PBS沖洗5 min，總計(jì)5次。然后加入二抗(已進(jìn)行生物素標(biāo)記)，37℃恒溫孵育半小時(shí)，PBS沖洗3 min，共計(jì)5次。后滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)，37℃恒溫孵育半小時(shí)，PBS沖洗3 min，共計(jì)5次。⑧顯色：滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液，顯色3 min，顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒后蒸餾水清洗，停止顯色反應(yīng)，后用HE重復(fù)染色15 s后沖洗。⑨封片：常規(guī)梯度脫水，待標(biāo)本干燥后采用中性樹膠進(jìn)行封片，高倍鏡下觀察。

1.4實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測CTNNB1 mRNA基因的表達(dá)采用SYBR Green方法檢測，反應(yīng)體系：SYBR Green solution 12 μl；正向引物1 μl；負(fù)向引物1 μl；cDNA 2.0 μl；ddH2O 9 μl。共計(jì)25 μl。采用Trizol(購自美國GIBCO公司)提取總RNA，RT-PCR按照逆轉(zhuǎn)錄及PCR說明進(jìn)行。引物序列為：CTNNB1：正義-TCCCACTCCTACGGAGAGAA，反義-GAAGGTCGGAAGGAAGG；內(nèi)參基因β-actin：正義-GACCTGGAGACGAGTGTC，反義-TTCGCTCCACCTGTAAGTA。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min→94℃ 15 s→60℃ 45s→75℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)完成后，重復(fù)一個(gè)循環(huán)的溶解曲線反應(yīng)，以評價(jià)擴(kuò)增的特異性。待測基因CTNNB1的表達(dá)水平用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5Western印跡法檢測CTNNB1蛋白的表達(dá)采用含10%胎牛血清(FBS)的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)進(jìn)行培養(yǎng)。待卵巢癌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)提取總蛋白?？偟鞍椎臐舛炔捎枚姿?BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒來進(jìn)行測定?？乖贵w反應(yīng)后進(jìn)行顯色：取硝酸纖維素(NC)膜置于免疫印跡化學(xué)(ECL)發(fā)光劑中，反應(yīng)3 min；暗室內(nèi)曝光，常規(guī)方法定影，并利用 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描顯色，采用光密度來對蛋白進(jìn)行表達(dá)，蛋白的相對表達(dá)=目的蛋白/β-actin。

1.6結(jié)果判定由兩位醫(yī)師分別給予雙盲閱片，參照腫瘤的陽性細(xì)胞面積、染色強(qiáng)度來對結(jié)果進(jìn)行計(jì)分。其中腫瘤的陽性細(xì)胞面積：陽性細(xì)胞面積為0不計(jì)分，1%～10% 1分，11%～49% 2分，50%～79% 3分，≥80% 4分；染色強(qiáng)度不表達(dá)為0分，弱表達(dá)(+)為1分，中度表達(dá)()為2分，強(qiáng)表達(dá)()為3分。兩者計(jì)分的乘積為最終的染色分級判斷標(biāo)準(zhǔn)。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)方法下CTNNB1在卵巢癌中的表達(dá)正常的卵巢上皮組織未發(fā)現(xiàn)CTNNB1存在。在卵巢上皮性腫瘤組織中，93.3%的卵巢癌組織(42/45)出現(xiàn)了CTNNB1胞質(zhì)的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CTNNB1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為染色后胞質(zhì)內(nèi)可見棕褐色的粒狀物。見圖1。

圖1　CTNNB1 在正常卵巢上皮組織及卵巢癌組織中的表達(dá)(400×)

2.2CTNNB1表達(dá)與臨床病理的關(guān)系按年齡、病理分期、組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況評分顯示，CTNNB1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中的表達(dá)比無轉(zhuǎn)移患者增加明顯(P<0.05)，而在患者不同年齡、病理分期、組織學(xué)分化程度間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示 CTNNB1的表達(dá)與卵巢癌的轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。見表1。

表1　CTNNB1表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3CTNNB1 mRNA和蛋白在卵巢癌組織表達(dá)CTNNB1 mRNA在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、SKOV3、A2780中均為高表達(dá)，分別為6.1±0.0、5.0±0.1、4.2±0.1、3.5±0.0，明顯高于正常卵巢上皮組織(1.4±0.0)(P<0.001)。CTNNB1 蛋白在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、SKOV3、A2780中均為高表達(dá)，分別為5.4±0.0、3.5±0.1、2.8±0.0、2.6±0.1，明顯高于正常卵巢上皮組織(1.1±0.1)(P<0.001)。見圖2、圖3。

圖2　CTNNB1 mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)

圖3　CTNNB1蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)

3討論

異常的Wnt信號傳導(dǎo) 被認(rèn)為是卵巢癌變過程 的關(guān)鍵〔8～10〕。在激活Wnt通路的過程中，CTNNB1蛋白的穩(wěn)定至關(guān)重要，這為卵巢癌的新治療提供了有力的靶位。CTNNB1基因也叫β-catenin基因，在癌細(xì)胞WNT信號傳導(dǎo)通路被激活 ，發(fā)揮抑制GSK-3β活性的作用，從而達(dá)到穩(wěn)定CTNNB1蛋白的目的〔11～16〕。Wnt/β-catenin活化通路在人類多種腫瘤中均得到證實(shí)，而且研究還顯示，Wnt/β-catenin靶基因的活化可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移、增殖等〔17～20〕。CTNNB1蛋白由于大量集聚在細(xì)胞質(zhì)，能夠和T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)結(jié)合，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活其下游基因，加速細(xì)胞的增殖〔21～23〕。對卵巢癌細(xì)胞株的研究顯示，CTNNB1在部分細(xì)胞株中作為其必需的原癌基因，一旦CTNNB1的活性受限，細(xì)胞周期會(huì)很快停滯在G1期，細(xì)胞開始凋亡〔24～27〕。綜上，CTNNB1高表達(dá)于卵巢癌中，并且CAOV3是CTNNB1高表達(dá)的主要卵巢癌細(xì)胞株，推測在后續(xù)的研究中可以選擇CAOV3作為效應(yīng)細(xì)胞來進(jìn)一步驗(yàn)證CTNNB1的功能及其在Wnt通路中的變化。

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〔2014-12-17修回〕

(編輯苑云杰)

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.L2014332)

〔中圖分類號〕R737.31

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2675-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.049

第一作者：劉海艷(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事老年病及臨床婦產(chǎn)科研究。