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    乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和miR-210的表達(dá)及其調(diào)控

    2016-06-29 09:41:28藍(lán)永洪牛海艷江朝娜符碧薇齊亞靈
    中國老年學(xué)雜志 2016年11期
    關(guān)鍵詞:試劑盒調(diào)控引物

    藍(lán)永洪 牛海艷 王 晗 楊 智 江朝娜 符碧薇 齊亞靈

    (海南醫(yī)學(xué)院,海南 ??凇?71199)

    乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和miR-210的表達(dá)及其調(diào)控

    藍(lán)永洪牛海艷王晗楊智江朝娜符碧薇齊亞靈

    (海南醫(yī)學(xué)院,海南???71199)

    〔摘要〕目的探討乳腺癌MCF-7細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與microRNA-210(miR-210)的表達(dá)情況及二者之間的調(diào)控關(guān)系。方法應(yīng)用Western印跡和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)分別檢測MCF-7細(xì)胞中HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。分別構(gòu)建針對HIF-1α和miR-210的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體,利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中,觀察HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。結(jié)果MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α和miR-210表達(dá),轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后HIF-1α和 miR-210的表達(dá)明顯下降;轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后HIF-1α表達(dá)沒有變化,但miR-210的表達(dá)明顯下降。結(jié)論乳腺癌MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α和miR-210表達(dá),HIF-1α可正向調(diào)控miR-210的表達(dá)。

    〔關(guān)鍵詞〕缺氧誘導(dǎo)因子-1α;microRNA-210;乳腺癌;調(diào)控關(guān)系

    腫瘤生長迅速,其增生速度超過周圍血管的生長速度,導(dǎo)致局部缺氧,缺氧是多數(shù)實體腫瘤的特征〔1〕。缺氧與腫瘤的侵襲、血管生成和凋亡有關(guān),并且增加了轉(zhuǎn)移的風(fēng)險,影響預(yù)后〔2〕。作為低氧誘導(dǎo)產(chǎn)物,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與miR-210在乳腺癌組織中均明顯上調(diào)〔3,4〕,且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)〔5,6〕,但是HIF-1α與miR-210在乳腺癌生物學(xué)行為中如何相互調(diào)控仍需深入探討。本研究觀察miR-210與HIF-1α的表達(dá)情況,分析二者在乳腺癌細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系。

    1材料與方法

    1.1主要試劑和儀器人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,DMEM培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司,胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司,胰酶和OPTI-MEM購自美國Gibco公司,LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司,HIF-1α和miR-210的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體購自武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司,引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠快速配制試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒、小鼠抗人HIF-1α抗體、小鼠抗人Actin抗體、辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自碧云天生物技術(shù)公司,總RNA提取試劑盒(DP430)、cDNA 第一鏈合成試劑盒(KR103)、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑(FP205)購自北京天根生化科技有限公司,CO2培養(yǎng)箱(4750E)購自美國NuAire公司,超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,微型垂直電泳槽(VE180)、半干轉(zhuǎn)移電泳槽(VE 386)購自上海天能科技有限公司,核酸蛋白測定儀購自德國Eppendorf公司,熒光定量 PCR 儀(Mx3005P)購自美國Agilent公司。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后,用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),胰酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前1 d,以1×105/孔的密度接種6孔板,待細(xì)胞密度約為90%后,按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,實驗分為對照組和轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染A液:將10 μl Lipo2000加至240 μl的Opti-MEM中輕輕混勻,室溫靜置5 min;轉(zhuǎn)染B液:將4 μl質(zhì)粒體或陰性對照加至246 μl Opti-MEM中輕輕混勻,將A 液與B液混勻,靜置20 min;對6孔板的細(xì)胞進(jìn)行換液,每孔加2 ml的Opti-MEM,然后將500 μl混合液加入6孔板中,輕輕混勻,6 h后進(jìn)行換液,用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),48 h后觀察HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。

    1.3Western印跡檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)取MCF-7細(xì)胞,去除培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次,加入終濃度為1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的SDS裂解液,吹打數(shù)下,使裂解液和MCF-7細(xì)胞充分接觸,然后用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞,吸至微量離心管,4℃14 000 r/min離心5 min,吸取上清液,采用二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg蛋白質(zhì)行8%SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含4% BSA的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)1封閉1 h,PBST洗膜,加入鼠抗人HIF-1α抗體(1∶500)和內(nèi)參Actin(1∶1 000),4℃過夜,PBST洗膜,加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1 000),并于室溫下孵育1 h,PBST洗膜,采用DAB顯色,觀察結(jié)果,并進(jìn)行灰度值分析,計算HIF-1α/Actin的灰度值作為蛋白相對表達(dá)量。

    1.4實時熒光定量PCR檢測miR-210的表達(dá)引物由公司合成,其中反轉(zhuǎn)錄特異性引物序列為:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCC-3′;miR-210的上游引物序列為:5′-CGCCTGTGCGTGTGACAGCG-3′,下游:GTGCAGGGTCCGAGGT,產(chǎn)物大小71 bp;內(nèi)參U6上游引物序列為:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′,產(chǎn)物大小89 bp。取MCF-7細(xì)胞,提取細(xì)胞的總RNA,檢測總RNA濃度,然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,其反應(yīng)體系為20 μl,分別加入RNA模板1 μg,10×RT Mix 2 μl,Super Pure dNTP(2.5 nmol/L ench)2 μl,特異性引物2 μl,Quant Reverse Transcriptase 1 μl,然后加RNase-Free ddH2O至20 μl,徹底混勻后簡短離心,37℃孵育60 min,置于-20℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR,其反應(yīng)體系為20 μl,分別加入cDNA模板1 μl,2× SuperReal PreMix Plus 10 μl ,上游引物0.6 μl,下游引物0.6 μl,50×ROX Reference 0.4 μl,然后加RNase-Free ddH2O至20 μl,徹底混勻后簡短離心,反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 15 min,95℃ 10 s,62℃ 31 s,45個循環(huán),以2-△△Ct值表示miR-210的相對表達(dá)量。

    1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

    2結(jié)果

    2.1HIF-1α和miR-210的表達(dá)MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α蛋白的表達(dá),將實時熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,MCF-7細(xì)胞中存在miR-210的表達(dá),見圖1。

    2.2轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)HIF-1α的shRNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α(0.082±0.008)和miR-210的表達(dá)水平明(0.306±0.04)顯低于對照組(0.353±0.004、1.056±0.116)(P<0.05),見圖2。

    圖2 轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況

    2.3轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)miR-210的shRNA轉(zhuǎn)染后,與對照組(0.332±0.011)相比,轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)(0.306±0.019)沒有明顯變化(P>0.05),而miR-210的表達(dá)水平明顯下降(0.235±0.021 vs 1.016±0.034)(P<0.05),見圖3。

    圖3 轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況

    3討論

    乳腺癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,已躍居女性惡性腫瘤的首位或第二位〔7〕。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后、導(dǎo)致患者死亡的主要原因〔8~10〕。HIF-1是缺氧條件下存在于哺乳動物和人體的一種轉(zhuǎn)錄因子〔11〕。研究證實HIF-1主要以異源二聚體形式存在,由120 kD的α亞基(HIF-1α)和91/93/94 kD(3種分子量)的β亞基(HIF-1β)組成。HIF-1α和HIF-1β同屬于Bhlh-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族,HIF-1活性的調(diào)節(jié)主要通過α亞基完成,具有一個或多個有效的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域,直接或間接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物反應(yīng)影響基因轉(zhuǎn)錄〔12〕。微小RNA(miRNA)作為小RNA的一種,可與其靶mRNA的非翻譯區(qū)特異性結(jié)合引起靶mRNA的翻譯抑制或降解,在細(xì)胞的生長分化等過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用〔13〕。miR-210是低氧應(yīng)答中的主要miRNA,因為迄今為止,miR-210在低氧狀態(tài)下,在所有的細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)〔14〕。本研究結(jié)果說明miR-210隨著HIF-1α的變化而變化,而HIF-1α不受miR-210水平的影響,表明HIF-1α可以調(diào)節(jié)miR-210的表達(dá),其原因可能為,HIF-1α可在miR-210啟動子處直接與轉(zhuǎn)錄起始位點上游大約40 bp的缺氧反應(yīng)原件(HER)結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,從而正向調(diào)控miR-210的表達(dá),然后可能通過miR-210作用于靶基因在乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用,從而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后,因此對于HIF-1α和miR-210的進(jìn)一步研究有可能為乳腺癌的靶向治療方面提供新的思路和策略。

    4參考文獻(xiàn)

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    〔2014-12-11修回〕

    (編輯苑云杰)

    基金項目:海南省自然科學(xué)基金(No.814301);海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金(No.HY2013-12)

    通訊作者:齊亞靈(1967-),女,教授,醫(yī)學(xué)博士,博士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤基因診斷及生物治療研究。

    〔中圖分類號〕R730

    〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

    〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2623-03;

    doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.025

    第一作者:藍(lán)永洪(1978-),男,碩士,副研究員,主要從事分子病理學(xué)研究。

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