• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和miR-210的表達(dá)及其調(diào)控

    2016-06-29 09:41:28藍(lán)永洪牛海艷江朝娜符碧薇齊亞靈
    中國老年學(xué)雜志 2016年11期
    關(guān)鍵詞:試劑盒調(diào)控引物

    藍(lán)永洪 牛海艷 王 晗 楊 智 江朝娜 符碧薇 齊亞靈

    (海南醫(yī)學(xué)院,海南 ??凇?71199)

    乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和miR-210的表達(dá)及其調(diào)控

    藍(lán)永洪牛海艷王晗楊智江朝娜符碧薇齊亞靈

    (海南醫(yī)學(xué)院,海南???71199)

    〔摘要〕目的探討乳腺癌MCF-7細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與microRNA-210(miR-210)的表達(dá)情況及二者之間的調(diào)控關(guān)系。方法應(yīng)用Western印跡和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)分別檢測MCF-7細(xì)胞中HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。分別構(gòu)建針對HIF-1α和miR-210的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體,利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中,觀察HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。結(jié)果MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α和miR-210表達(dá),轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后HIF-1α和 miR-210的表達(dá)明顯下降;轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后HIF-1α表達(dá)沒有變化,但miR-210的表達(dá)明顯下降。結(jié)論乳腺癌MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α和miR-210表達(dá),HIF-1α可正向調(diào)控miR-210的表達(dá)。

    〔關(guān)鍵詞〕缺氧誘導(dǎo)因子-1α;microRNA-210;乳腺癌;調(diào)控關(guān)系

    腫瘤生長迅速,其增生速度超過周圍血管的生長速度,導(dǎo)致局部缺氧,缺氧是多數(shù)實體腫瘤的特征〔1〕。缺氧與腫瘤的侵襲、血管生成和凋亡有關(guān),并且增加了轉(zhuǎn)移的風(fēng)險,影響預(yù)后〔2〕。作為低氧誘導(dǎo)產(chǎn)物,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與miR-210在乳腺癌組織中均明顯上調(diào)〔3,4〕,且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)〔5,6〕,但是HIF-1α與miR-210在乳腺癌生物學(xué)行為中如何相互調(diào)控仍需深入探討。本研究觀察miR-210與HIF-1α的表達(dá)情況,分析二者在乳腺癌細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系。

    1材料與方法

    1.1主要試劑和儀器人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,DMEM培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司,胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司,胰酶和OPTI-MEM購自美國Gibco公司,LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司,HIF-1α和miR-210的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體購自武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司,引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠快速配制試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒、小鼠抗人HIF-1α抗體、小鼠抗人Actin抗體、辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自碧云天生物技術(shù)公司,總RNA提取試劑盒(DP430)、cDNA 第一鏈合成試劑盒(KR103)、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑(FP205)購自北京天根生化科技有限公司,CO2培養(yǎng)箱(4750E)購自美國NuAire公司,超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,微型垂直電泳槽(VE180)、半干轉(zhuǎn)移電泳槽(VE 386)購自上海天能科技有限公司,核酸蛋白測定儀購自德國Eppendorf公司,熒光定量 PCR 儀(Mx3005P)購自美國Agilent公司。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后,用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),胰酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前1 d,以1×105/孔的密度接種6孔板,待細(xì)胞密度約為90%后,按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,實驗分為對照組和轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染A液:將10 μl Lipo2000加至240 μl的Opti-MEM中輕輕混勻,室溫靜置5 min;轉(zhuǎn)染B液:將4 μl質(zhì)粒體或陰性對照加至246 μl Opti-MEM中輕輕混勻,將A 液與B液混勻,靜置20 min;對6孔板的細(xì)胞進(jìn)行換液,每孔加2 ml的Opti-MEM,然后將500 μl混合液加入6孔板中,輕輕混勻,6 h后進(jìn)行換液,用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),48 h后觀察HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況。

    1.3Western印跡檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)取MCF-7細(xì)胞,去除培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次,加入終濃度為1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的SDS裂解液,吹打數(shù)下,使裂解液和MCF-7細(xì)胞充分接觸,然后用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞,吸至微量離心管,4℃14 000 r/min離心5 min,吸取上清液,采用二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg蛋白質(zhì)行8%SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含4% BSA的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)1封閉1 h,PBST洗膜,加入鼠抗人HIF-1α抗體(1∶500)和內(nèi)參Actin(1∶1 000),4℃過夜,PBST洗膜,加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1 000),并于室溫下孵育1 h,PBST洗膜,采用DAB顯色,觀察結(jié)果,并進(jìn)行灰度值分析,計算HIF-1α/Actin的灰度值作為蛋白相對表達(dá)量。

    1.4實時熒光定量PCR檢測miR-210的表達(dá)引物由公司合成,其中反轉(zhuǎn)錄特異性引物序列為:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCC-3′;miR-210的上游引物序列為:5′-CGCCTGTGCGTGTGACAGCG-3′,下游:GTGCAGGGTCCGAGGT,產(chǎn)物大小71 bp;內(nèi)參U6上游引物序列為:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′,產(chǎn)物大小89 bp。取MCF-7細(xì)胞,提取細(xì)胞的總RNA,檢測總RNA濃度,然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,其反應(yīng)體系為20 μl,分別加入RNA模板1 μg,10×RT Mix 2 μl,Super Pure dNTP(2.5 nmol/L ench)2 μl,特異性引物2 μl,Quant Reverse Transcriptase 1 μl,然后加RNase-Free ddH2O至20 μl,徹底混勻后簡短離心,37℃孵育60 min,置于-20℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR,其反應(yīng)體系為20 μl,分別加入cDNA模板1 μl,2× SuperReal PreMix Plus 10 μl ,上游引物0.6 μl,下游引物0.6 μl,50×ROX Reference 0.4 μl,然后加RNase-Free ddH2O至20 μl,徹底混勻后簡短離心,反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 15 min,95℃ 10 s,62℃ 31 s,45個循環(huán),以2-△△Ct值表示miR-210的相對表達(dá)量。

    1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

    2結(jié)果

    2.1HIF-1α和miR-210的表達(dá)MCF-7細(xì)胞中存在HIF-1α蛋白的表達(dá),將實時熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,MCF-7細(xì)胞中存在miR-210的表達(dá),見圖1。

    2.2轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)HIF-1α的shRNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α(0.082±0.008)和miR-210的表達(dá)水平明(0.306±0.04)顯低于對照組(0.353±0.004、1.056±0.116)(P<0.05),見圖2。

    圖2 轉(zhuǎn)染HIF-1α的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況

    2.3轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)miR-210的shRNA轉(zhuǎn)染后,與對照組(0.332±0.011)相比,轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)(0.306±0.019)沒有明顯變化(P>0.05),而miR-210的表達(dá)水平明顯下降(0.235±0.021 vs 1.016±0.034)(P<0.05),見圖3。

    圖3 轉(zhuǎn)染miR-210的shRNA后 HIF-1α和miR-210的表達(dá)情況

    3討論

    乳腺癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,已躍居女性惡性腫瘤的首位或第二位〔7〕。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后、導(dǎo)致患者死亡的主要原因〔8~10〕。HIF-1是缺氧條件下存在于哺乳動物和人體的一種轉(zhuǎn)錄因子〔11〕。研究證實HIF-1主要以異源二聚體形式存在,由120 kD的α亞基(HIF-1α)和91/93/94 kD(3種分子量)的β亞基(HIF-1β)組成。HIF-1α和HIF-1β同屬于Bhlh-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族,HIF-1活性的調(diào)節(jié)主要通過α亞基完成,具有一個或多個有效的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域,直接或間接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物反應(yīng)影響基因轉(zhuǎn)錄〔12〕。微小RNA(miRNA)作為小RNA的一種,可與其靶mRNA的非翻譯區(qū)特異性結(jié)合引起靶mRNA的翻譯抑制或降解,在細(xì)胞的生長分化等過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用〔13〕。miR-210是低氧應(yīng)答中的主要miRNA,因為迄今為止,miR-210在低氧狀態(tài)下,在所有的細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)〔14〕。本研究結(jié)果說明miR-210隨著HIF-1α的變化而變化,而HIF-1α不受miR-210水平的影響,表明HIF-1α可以調(diào)節(jié)miR-210的表達(dá),其原因可能為,HIF-1α可在miR-210啟動子處直接與轉(zhuǎn)錄起始位點上游大約40 bp的缺氧反應(yīng)原件(HER)結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,從而正向調(diào)控miR-210的表達(dá),然后可能通過miR-210作用于靶基因在乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用,從而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后,因此對于HIF-1α和miR-210的進(jìn)一步研究有可能為乳腺癌的靶向治療方面提供新的思路和策略。

    4參考文獻(xiàn)

    1Semenza GL.Intratumoral hypoxia,radiation resistance and HIF-1〔J〕.Cancer Cell,2004;5(5):405-6.

    2Vordermark D.Hypoxia-specific targets in cancer therapy:role of splice variants〔J〕.BMC Med,2010;(8):45.

    3趙婷婷,苗智峰,劉省宇,等.HIF-1α的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的研究〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014;22(4):850-4.

    4張楠,李少游,鞏雅寧,等.miRNA-210對人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志,2013;20(3):289-94.

    5Kronblad A,Jirstrom K,Ryden L,etal.Hypoxia inducible factor-1alpha is a prognostic marker in premenopausal patients with intermediate to highly differentiated breast cancer but not a predictive marker for tamoxifen response〔J〕.Int J Cancer,2006;118(10):2609-16.

    6Hong L,Yang J,Han Y,etal.High expression of miR-210 predicts poor survival in patients with breast cancer:a meta-analysis〔J〕.Gene,2012;507(2):135-8.

    7Jemal A,Siegel R,Ward E,etal.Cancer statistics,2009〔J〕.CA Cancer J Clin,2009;59(4):225-49.

    8Li Q,Wu M,Wang H,etal.Ezrin sinlencing by small hairpin rna reverses metastaic behaviors of human breast cancer cells〔J〕.Cancer Lett,2008;261(1):55-63.

    9Gonealves A,Esterni B,Bertucei F,etal.Postoperative serum proteomic profiles may predict metastatic relapse in high-risk primary breast cancer patients receiving adjuvant chemotherapy〔J〕.Oncogene,2006;25(7):981-9.

    10敬巧.HIF-1α與惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2010;26(24):3552-4.

    11Nagaraju GP,Bramhachari PV,Raghu G,etal.Hypoxia inducible factor-1α:Its role in colorectal carcinogenesis and metastasis〔J〕.Cancer Lett,2015;366(1):11-8.

    12Ioannou M,Paraskeva E,Baxevanidou K,etal.HIF-1α in colorectal carcinoma:review of the literature〔J〕.J BUON,2015;20(3):680-9.

    13Khoshnaw SM,Green AR,Powe DG,etal.MicroRNA involvement in the pathogenesis and management of breast cancer〔J〕.J Clin Pathol,2009;62(5):422-8.

    14Kulshreshtha R,F(xiàn)erracin M,Wojcik SE,etal.A microRNA signature of hypoxia〔J〕.Mol Cell Biol,2007;27(5):1859-67.

    〔2014-12-11修回〕

    (編輯苑云杰)

    基金項目:海南省自然科學(xué)基金(No.814301);海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金(No.HY2013-12)

    通訊作者:齊亞靈(1967-),女,教授,醫(yī)學(xué)博士,博士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤基因診斷及生物治療研究。

    〔中圖分類號〕R730

    〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

    〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2623-03;

    doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.025

    第一作者:藍(lán)永洪(1978-),男,碩士,副研究員,主要從事分子病理學(xué)研究。

    猜你喜歡
    試劑盒調(diào)控引物
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    如何調(diào)控困意
    經(jīng)濟(jì)穩(wěn)中有進(jìn) 調(diào)控托而不舉
    中國外匯(2019年15期)2019-10-14 01:00:34
    順勢而導(dǎo) 靈活調(diào)控
    火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗證
    SUMO修飾在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用
    非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美黑人巨大hd| 国产精品三级大全| 嫩草影院精品99| 国产精品无大码| 国产三级在线视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 色在线成人网| 午夜影院日韩av| 又紧又爽又黄一区二区| 露出奶头的视频| 黄色女人牲交| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 美女大奶头视频| 免费在线观看影片大全网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 99热6这里只有精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美国产日韩亚洲一区| 日本三级黄在线观看| 欧美3d第一页| 欧美3d第一页| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 我的老师免费观看完整版| 久久精品91蜜桃| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产乱人伦免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 搞女人的毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久香蕉精品热| 日本-黄色视频高清免费观看| 三级国产精品欧美在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产av在哪里看| eeuss影院久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 69av精品久久久久久| 久久6这里有精品| 欧美3d第一页| 精品福利观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一夜夜www| aaaaa片日本免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲熟妇熟女久久| 精品无人区乱码1区二区| 日日夜夜操网爽| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲最大成人手机在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 悠悠久久av| 国产91精品成人一区二区三区| 中国美女看黄片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看十八女毛片水多多多| 久久精品国产清高在天天线| 日本欧美国产在线视频| 中文字幕高清在线视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 18禁在线播放成人免费| 极品教师在线视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费在线观看影片大全网站| 色吧在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 久久人妻av系列| 999久久久精品免费观看国产| 国产私拍福利视频在线观看| 51国产日韩欧美| 欧美高清成人免费视频www| 日日啪夜夜撸| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲精品av在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99九九线精品视频在线观看视频| 色av中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 欧美一区二区国产精品久久精品| 干丝袜人妻中文字幕| 免费看光身美女| 日韩中字成人| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 极品教师在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久精品综合一区二区三区| 一级av片app| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产日本99.免费观看| 91狼人影院| av国产免费在线观看| 毛片一级片免费看久久久久 | 美女免费视频网站| videossex国产| 又爽又黄a免费视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久人人爽人人爽人人片va| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜激情福利司机影院| 国产精品99久久久久久久久| 我的女老师完整版在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 麻豆成人午夜福利视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 九九爱精品视频在线观看| 国产黄片美女视频| 床上黄色一级片| 久久精品国产亚洲网站| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品色激情综合| 国产淫片久久久久久久久| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 成人国产一区最新在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 又爽又黄a免费视频| 三级国产精品欧美在线观看| 日本 欧美在线| 欧美中文日本在线观看视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久精品国产亚洲网站| 在线天堂最新版资源| 麻豆国产97在线/欧美| 色视频www国产| 亚洲av五月六月丁香网| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 很黄的视频免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久国内精品自在自线图片| 欧美日本视频| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品国产高清国产av| 精品乱码久久久久久99久播| 日本黄色片子视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产精品三级大全| 国产精品久久电影中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 成人无遮挡网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜影院日韩av| 午夜福利在线观看吧| 免费观看精品视频网站| 少妇丰满av| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲av.av天堂| 乱系列少妇在线播放| 内射极品少妇av片p| 亚洲av.av天堂| 三级毛片av免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久久久午夜电影| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美一区二区精品小视频在线| 我要看日韩黄色一级片| 高清在线国产一区| 国产男靠女视频免费网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 麻豆一二三区av精品| 日韩欧美精品v在线| 精品久久久久久久末码| 亚洲无线观看免费| 国产男人的电影天堂91| 中文字幕免费在线视频6| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲在线观看片| 亚洲乱码一区二区免费版| www.www免费av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本一二三区视频观看| 特级一级黄色大片| 国产一区二区激情短视频| 成人亚洲精品av一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲av第一区精品v没综合| 99热这里只有是精品50| 日韩精品有码人妻一区| 国产欧美日韩一区二区精品| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲内射少妇av| 亚洲欧美精品综合久久99| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 午夜免费男女啪啪视频观看 | 色精品久久人妻99蜜桃| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费看av在线观看网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线播放国产精品三级| 欧美日韩精品成人综合77777| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 一进一出好大好爽视频| 久久精品国产亚洲网站| 一区二区三区高清视频在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品人妻久久久久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 三级国产精品欧美在线观看| 成人午夜高清在线视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产不卡一卡二| 日韩亚洲欧美综合| 网址你懂的国产日韩在线| 91久久精品国产一区二区三区| 日本在线视频免费播放| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产真实乱freesex| 国产毛片a区久久久久| 国产精品三级大全| 亚洲在线自拍视频| 久久久久久伊人网av| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲电影在线观看av| 一个人免费在线观看电影| 99热这里只有是精品50| 国产精品久久久久久精品电影| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美高清成人免费视频www| 美女黄网站色视频| 亚洲第一电影网av| 国产一区二区三区av在线 | 国产精品久久视频播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 床上黄色一级片| 久久久久久久久久久丰满 | 久久九九热精品免费| 成人一区二区视频在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 性色avwww在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产色爽女视频免费观看| 黄片wwwwww| 国产成人av教育| 九九在线视频观看精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费av观看视频| 精品午夜福利在线看| 亚洲avbb在线观看| www日本黄色视频网| 99精品久久久久人妻精品| 日韩国内少妇激情av| 久久久久久久午夜电影| 国产色婷婷99| 国产精品一及| 直男gayav资源| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 黄色一级大片看看| 日日干狠狠操夜夜爽| 人人妻人人看人人澡| 88av欧美| 男女那种视频在线观看| 一进一出好大好爽视频| 日本三级黄在线观看| 深夜a级毛片| 美女 人体艺术 gogo| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费搜索国产男女视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 淫秽高清视频在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产一区二区激情短视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲国产欧洲综合997久久,| av在线老鸭窝| 91麻豆精品激情在线观看国产| 老司机福利观看| 亚洲真实伦在线观看| 最近在线观看免费完整版| 国产老妇女一区| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲最大成人中文| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产av麻豆久久久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 成人亚洲精品av一区二区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产日本99.免费观看| 日韩欧美 国产精品| 精品久久久久久久末码| h日本视频在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| a级一级毛片免费在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品久久久久久成人av| 最新中文字幕久久久久| 欧美高清性xxxxhd video| 国产 一区精品| 99热6这里只有精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久国内精品自在自线图片| 999久久久精品免费观看国产| 久久久久国内视频| 国产高清不卡午夜福利| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品99久久久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美高清成人免费视频www| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲在线自拍视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日本 av在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 日日啪夜夜撸| 美女高潮的动态| av在线观看视频网站免费| 一级黄片播放器| 亚洲成人久久性| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 久久久色成人| ponron亚洲| 亚洲欧美日韩高清专用| 1000部很黄的大片| 99精品久久久久人妻精品| av在线蜜桃| 国产亚洲精品久久久com| 小说图片视频综合网站| 99riav亚洲国产免费| 在线a可以看的网站| 国产精品久久视频播放| 在线天堂最新版资源| 99riav亚洲国产免费| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 国产一区二区三区视频了| 免费观看的影片在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 他把我摸到了高潮在线观看| 观看免费一级毛片| 亚洲自偷自拍三级| 联通29元200g的流量卡| a级毛片免费高清观看在线播放| a级一级毛片免费在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费av观看视频| 舔av片在线| 国产精品不卡视频一区二区| 日本免费a在线| 亚洲,欧美,日韩| 一夜夜www| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品久久久久久av不卡| 国产视频一区二区在线看| 国模一区二区三区四区视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 赤兔流量卡办理| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美免费精品| 成人国产综合亚洲| 性色avwww在线观看| 亚洲电影在线观看av| 真人一进一出gif抽搐免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲专区中文字幕在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 免费看a级黄色片| 久久精品国产亚洲网站| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩精品有码人妻一区| 最近最新中文字幕大全电影3| 美女黄网站色视频| 成人欧美大片| 我要看日韩黄色一级片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲av免费高清在线观看| 国内精品美女久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人国产一区最新在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 天堂√8在线中文| 国产精品野战在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美精品啪啪一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国内精品美女久久久久久| 国产成人aa在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 一级av片app| 热99在线观看视频| 九色国产91popny在线| 变态另类丝袜制服| 国产伦在线观看视频一区| 欧美zozozo另类| 免费av不卡在线播放| a在线观看视频网站| 两个人的视频大全免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 精品人妻视频免费看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 精品欧美国产一区二区三| 中文字幕av成人在线电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 美女免费视频网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av成人av| 国产亚洲精品av在线| 两个人视频免费观看高清| 在线观看免费视频日本深夜| 久99久视频精品免费| 国产精品福利在线免费观看| 日本在线视频免费播放| 亚洲熟妇熟女久久| 中文资源天堂在线| 成人特级av手机在线观看| 久久久久久久久久成人| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品一区二区三区人妻视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产一区二区在线观看日韩| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产av不卡久久| 免费av观看视频| 欧美激情在线99| 成人特级黄色片久久久久久久| 美女免费视频网站| 十八禁国产超污无遮挡网站| 丰满乱子伦码专区| 成人国产综合亚洲| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲美女黄片视频| 日本在线视频免费播放| 有码 亚洲区| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 不卡一级毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 天堂影院成人在线观看| 国产av不卡久久| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人无遮挡网站| 午夜福利高清视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久久久久久大av| 窝窝影院91人妻| 一个人免费在线观看电影| 精品不卡国产一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产伦人伦偷精品视频| 国产视频一区二区在线看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 美女免费视频网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 极品教师在线免费播放| 波野结衣二区三区在线| 成人性生交大片免费视频hd| 黄片wwwwww| 精品久久久噜噜| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产真实乱freesex| 日本色播在线视频| 亚洲人成网站高清观看| 中文字幕熟女人妻在线| av福利片在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲在线观看片| 亚洲av一区综合| 全区人妻精品视频| 日本黄色片子视频| 美女黄网站色视频| 中文资源天堂在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 99久久成人亚洲精品观看| 精品久久国产蜜桃| 免费无遮挡裸体视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 深夜a级毛片| 99热这里只有是精品50| 国产伦人伦偷精品视频| 精品一区二区三区人妻视频| 如何舔出高潮| 亚洲内射少妇av| 亚洲国产精品合色在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精华霜和精华液先用哪个| 成人美女网站在线观看视频| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品一区二区性色av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 美女黄网站色视频| 特级一级黄色大片| 日韩亚洲欧美综合| 五月伊人婷婷丁香| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本爱情动作片www.在线观看 | 长腿黑丝高跟| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 简卡轻食公司| 日韩一本色道免费dvd| bbb黄色大片| 精品人妻1区二区| 免费看av在线观看网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 91麻豆av在线| 婷婷六月久久综合丁香| 中文在线观看免费www的网站| 精品乱码久久久久久99久播| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久久久午夜电影| netflix在线观看网站| 国产黄色小视频在线观看| 欧美人与善性xxx| 一个人免费在线观看电影| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费搜索国产男女视频| 国产老妇女一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩 亚洲 欧美在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 91麻豆av在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产色爽女视频免费观看| 有码 亚洲区| 中文资源天堂在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 波野结衣二区三区在线| 久久九九热精品免费| 日韩一本色道免费dvd| 成人二区视频| 国产免费av片在线观看野外av| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成人福利小说| 欧美日韩国产亚洲二区| 69av精品久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久人人精品亚洲av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| www.色视频.com| 国产探花在线观看一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 99久久成人亚洲精品观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 不卡一级毛片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 999久久久精品免费观看国产| 校园春色视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| av.在线天堂| 色av中文字幕| 久久久精品欧美日韩精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品一区二区性色av| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久久午夜电影| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人亚洲精品av一区二区| or卡值多少钱| av在线蜜桃| 国产av一区在线观看免费| 国产黄色小视频在线观看| 国产乱人视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产精品福利在线免费观看| 欧美潮喷喷水| 一本久久中文字幕| 在线观看一区二区三区| 尾随美女入室| 能在线免费观看的黄片|