活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中CD11c+髓樣樹突狀細(xì)胞頻數(shù)和細(xì)胞表型的變化

王香莉鄭天送賈妮娜肖晉美高虹張繼萍張桓虎

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活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中CD11c+髓樣樹突狀細(xì)胞頻數(shù)和細(xì)胞表型的變化

王香莉1鄭天送1賈妮娜2肖晉美2高虹2張繼萍3張桓虎2

【摘要】目的 探討活動期潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者外周血中CD11c+髓樣樹突狀細(xì)胞（mDC）頻數(shù)和細(xì)胞表型的變化，以及與患者臨床嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法 流式細(xì)胞儀檢測外周血中CD11c+mDC占外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的比率；磁珠分選方法分離純化CD11c+mDC，流式細(xì)胞儀檢測CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)率。結(jié)果 與健康對照組比較，活動期UC患者外周血中CD11c+mDC 占PBMC的比率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（0．31%±0．40%）vs．（0．78%±0．40%），P＜0．05]；患者組不同臨床嚴(yán)重程度CD11c+mDC頻數(shù)存在差異；新鮮分離的CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)較低，但患者組CD80和CD86的表達(dá)均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（6．83%±3．22%） vs．（2．50%±1．23%），（43．95%±16．42% ）vs． （17．22%±7．53%），P＜0．05]。結(jié)論 活動期UC患者外周血中CD11c+mDC頻數(shù)降低，但CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)率并未嚴(yán)重受損；活動期UC患者外周血中CD11c+mDC頻數(shù)降低可能與患者臨床嚴(yán)重程度相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】潰瘍性結(jié)腸炎；活動期；CD11c+髓樣樹突狀細(xì)胞；頻數(shù)；細(xì)胞表型

作者單位：1 030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)；2 030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝病科；3 030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院科技處

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種多因素的腸道疾病，表現(xiàn)為慢性非特異性。免疫應(yīng)答異常和免疫調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致UC發(fā)病的重要原因。UC免疫反應(yīng)中主要的免疫細(xì)胞有T細(xì)胞和將其活化的抗原遞呈細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）作為人體內(nèi)功能最強(qiáng)并且是唯一能夠活化初始型T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，在其中發(fā)揮著重要的聯(lián)絡(luò)作用。外周血中至少存在兩類不同亞型DC，對其進(jìn)行分選研究將有助于進(jìn)一步闡明各自在機(jī)體免疫中的不同作用。對CD11c+髓樣樹突狀細(xì)胞（myeloid dendritic cells，mDC）頻數(shù)、細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)和功能特點(diǎn)進(jìn)行研究可以幫助我們認(rèn)識其在UC發(fā)病中的作用機(jī)制，也可能為今后尋找治療UC新方法提供依據(jù)。本研究主要對活動期UC患者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率及細(xì)胞表型進(jìn)行檢測，并分析其與患者臨床嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 資料

收集2014年7月～2015年10月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科住院及門診活動期UC患者40例，設(shè)為UC患者組，所有患者診斷符合2012年我國中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病診斷與治療的共識意見標(biāo)準(zhǔn)，并且有完整的結(jié)腸鏡及病理學(xué)診斷資料。排除合并其他重要器官嚴(yán)重疾病患者、腫瘤患者、妊娠期及哺乳期患者。所有患者未用過或復(fù)發(fā)前6個月未用過可能影響機(jī)體免疫功能的相關(guān)藥物，包括水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。收集同期30例健康體檢者作為健康對照組，性別、年齡與UC患者組相匹配，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。所有患者及健康體檢者血液采集均經(jīng)本人知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司產(chǎn)品；異硫氰酸（FITC）標(biāo)記鼠抗人Lineage（包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）單克隆抗體及同型對照鼠IgG1購自晶美公司；藻紅蛋白（PE）標(biāo)記鼠抗人CD11c 單克隆抗體、別藻藍(lán)蛋白（APC）標(biāo)記鼠抗人HLA-DR單克隆抗體、FITC標(biāo)記鼠抗人CD80單克隆抗體、PE標(biāo)記鼠抗人CD86單克隆抗體及同型對照鼠IgG2a /IgGb均由eBioscience公司生產(chǎn)；BDCA-1樹突狀細(xì)胞分離試劑盒購自德國美天妮公司；美國BD公司產(chǎn)流式細(xì)胞儀，F(xiàn)ACS Calibur。

表1 兩組一般資料比較[n，（±s）]

表1 兩組一般資料比較[n，（±s）]

注：兩組比較，P＞0.05

組別 　　例數(shù) 　　性別（男/女） 　　年齡（歲）UC患者組 　40 　19/21 　36.4±14.2健康對照組 　30 　15/15 　37.8±13.6

1.2 方法

1.2.1 PBMC分離 將肝素抗凝新鮮外周血2 ml緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液液面上（注意不要使血液混入分離液），置于水平式離心機(jī)內(nèi)以1 500 r/min離心30 min，吸取環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，獲取PBMC。

1.2.2 外周血中CD11c+mDC頻率檢測 上述方法分離獲得的PBMC用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，100 μl PBS懸浮細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記鼠抗人Lineage（包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）mAb，PE標(biāo)記鼠抗人CD11c mAb，APC標(biāo)記鼠抗人HLA-DR mAb各10 μl，同時設(shè)同型對照，室溫避光孵育30 min，置于水平式離心機(jī)內(nèi)以1 500 r/min離心5 min，4%多聚甲醛固定，上流式細(xì)胞儀檢測。先圈出Lineage陰性，再圈出CD11c 和HLA-DR雙陽性的細(xì)胞即為mDC。

1.2.3 外周血中CD11c+mDC的分離 PBMC行細(xì)胞計數(shù)，300 μl PBS懸浮細(xì)胞，加入100 μl FcR-阻斷劑混勻，再加入100 μl BDCA-1磁珠混勻，4℃冰箱孵育15 min后用5 ml PBS洗滌，在磁分選單位上用MS柱陽選出BDCA-1+mDC即為CD11c+mDC。

1.2.4 新鮮分離的CD11c+mDC細(xì)胞表型測定 收集上述新鮮分離的CD11c+mDC，?。?×104細(xì)胞，用FITC標(biāo)記鼠抗人CD80 mAb 和PE標(biāo)記鼠抗人CD86 mAb各10 μl標(biāo)記細(xì)胞，同時設(shè)同型對照，室溫避光孵育30 min，置于水平式離心機(jī)內(nèi)以1 500 r/min離心5 min，4%多聚甲醛固定，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 活動期UC患者疾病嚴(yán)重程度分級 采用改良Truelove和Witts疾病嚴(yán)重程度分型標(biāo)準(zhǔn)[1]，按疾病活動性的嚴(yán)重程度分為輕、中、重度，見表2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）表示。兩組均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，單因素方差分析用于多組均數(shù)的顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率

流式細(xì)胞儀檢測出lineage陰性，CD11c和HLA-DR雙陽性細(xì)胞占PBMC的比率。對40例活動期UC患者及30例健康對照者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率進(jìn)行t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），活動期UC患者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率低于健康對照組[（0.31%±0.40%）vs. （0.78%±0.40%）]，P＜0.05，如圖1。

圖1 外周血中CD11c+mDC頻率的變化

圖2 不同臨床嚴(yán)重程度CD11c+mDC頻數(shù)

2.2 不同臨床嚴(yán)重程度活動期UC患者外周血中CD11c+mDC頻數(shù)比較

活動期UC患者按疾病活動性的嚴(yán)重程度分為輕、中、重度3組，其中輕度患者12例，中度15例，重度13例。3組CD11c+mDC頻數(shù)分別（0.76%±0.50%），（0.13%±0.05%），（0.11%±0.05%）。中度組和重度組CD11c+mDC頻數(shù)均低于輕度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中度組和重度組CD11c+mDC頻數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，如圖2。

2.3 新鮮分離外周血中CD11c+mDC細(xì)胞表型的變化

流式細(xì)胞儀檢測新鮮分離的CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86，活動期UC患者組CD80和CD86表達(dá)率分別為（6.83%±3.22%），（43.95%±16.42%），健康對照組CD80和CD86表達(dá)率為（2.50%±1.23%），（17.22%±7.53%）。活動期UC患者組CD80和CD86表達(dá)率均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），如圖3。

表2 改良Truelove和Witts疾病嚴(yán)重程度分型

3 討論

UC屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）范疇，近年來患病率明顯增加，日益成為嚴(yán)重影響人類健康的消化系統(tǒng)疾病之一。研究認(rèn)為，包括環(huán)境、遺傳、自由基損傷、免疫等多種因素共同導(dǎo)致UC的發(fā)病[2]，而免疫應(yīng)答異常和免疫調(diào)節(jié)失衡被認(rèn)為是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[3]。DC是人體內(nèi)功能強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，通過活化初始型T細(xì)胞并將抗原遞呈給T細(xì)胞，使UC免疫反應(yīng)中最重要的效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮免疫作用。外周血DC根據(jù)其表型和功能可分為髓樣樹突狀細(xì)胞（mycloid dendritic cell，mDC）和漿樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）[4]。既往研究多以單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cells，moDC）在細(xì)胞因子刺激下長時間體外培養(yǎng)，DC本身的免疫應(yīng)答會發(fā)生改變。因此，將外周血CD11c+mDC和CD123+pDC分選研究可能有助于進(jìn)一步闡明不同亞型DC在機(jī)體免疫中的不同作用以及與活動期UC患者臨床嚴(yán)重程度的關(guān)系。CD11c+mDC在體內(nèi)主要發(fā)揮抗原提呈功能，促進(jìn)Th1細(xì)胞極化和細(xì)胞免疫的發(fā)生[5]。pDC激活后主要產(chǎn)生機(jī)體內(nèi)源性Ⅰ型干擾素（Ⅰ-IFN），它既能直接抑制病毒復(fù)制，又能激活NK細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和mDC，從而誘導(dǎo)并增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)[6]。所以，我們對mDC和pDC進(jìn)行分離研究可以完善以往對DC缺陷引起機(jī)體免疫功能紊亂的新認(rèn)識。

圖3 新鮮分離CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)率

近來有研究表明，腸道DC在UC的病理過程中發(fā)揮重要作用[7]，Drakes等[8]在小鼠結(jié)腸炎的模型中將結(jié)腸DC與自體固有層的T細(xì)胞共同培養(yǎng)，刺激IFN-γ和IL-6的產(chǎn)生時，其數(shù)量顯著高于DC與同源或異源脾臟T細(xì)胞共同培養(yǎng)時產(chǎn)生的IFN-γ 和IL-6。DC與UC密切相關(guān)[9-10]。若單純比較DC亞群數(shù)量變化意義不大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合患者臨床嚴(yán)重程度指標(biāo)來探討臨床現(xiàn)象與免疫研究之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：活動期UC患者外周血中CD11c+mDC占PBMC的比率下降，可能與下列因素有關(guān)：（1）腸道病原微生物及其產(chǎn)物直接感染CD11c+mDC，誘導(dǎo)其凋亡，導(dǎo)致CD11c+mDC數(shù)量下降。（2）CD11c+mDC參與腸道免疫活動而轉(zhuǎn)移到炎癥部位。本研究根據(jù)疾病嚴(yán)重程度分級，將活動期不同疾病嚴(yán)重程度UC患者CD11c+mDC相對數(shù)量作比較，發(fā)現(xiàn)中度組和重度組CD11c+mDC占PBMC的比率均低于輕度組，提示外周血中CD11c+mDC激活后遷移到腸道炎癥部位，從而使外周血中CD11c+mDC數(shù)量減少，這與之前Baumgart等[11]研究結(jié)果一致。Baumgart等研究還發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸黏膜上pDC高表達(dá)，并且其分泌的TNF-α、IL-6、IL-8也較正常對照增高[12]。

成熟DC表達(dá)共刺激分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2），它們與表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合，形成第二信號，刺激T細(xì)胞活化。當(dāng)強(qiáng)烈的共刺激信號形成后，CTL等免疫活性細(xì)胞被激活，進(jìn)而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。以往有研究測定UC患者結(jié)腸黏膜上CD80和CD86的表達(dá)，結(jié)果提示CD80僅在部分患者中能檢測到，CD86存在于所有患者，而健康對照組均未能檢出[13]。本研究對CD11c+mDC分離純化，通過直接檢測未經(jīng)刺激DC細(xì)胞表型來反映其在外周血中的活化狀態(tài)。研究結(jié)果顯示：UC患者組與健康對照組CD11c+mDC表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)率均低下，說明循環(huán)中DC絕大部分為未成熟DC?；顒悠赨C患者CD86表達(dá)率高于健康對照組，原因可能是UC患者外周血中mDC加工遞呈抗原，通過淋巴管遷移至脾臟和淋巴結(jié)，完成成熟過程，同時表面共刺激分子表達(dá)增加；在這個過程中可能還會檢測到外周血中mDC的CD86表達(dá)升高。同時也提示：UC患者外周血CD11c+mDC在受到病原微生物及其產(chǎn)物刺激后形成共刺激信號，其能力并未受明顯影響[14]。

如果體內(nèi)DC免疫功能異常將會影響到機(jī)體免疫的各個環(huán)節(jié)。本研究表明，活動期UC患者外周血中CD11c+mDC數(shù)量減少可能與腸道病原微生物及其產(chǎn)物作用以及腸道炎癥均有關(guān)系。CD11c+mDC數(shù)量減少導(dǎo)致機(jī)體特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生能力降低，但細(xì)胞表面共刺激分子生成能力卻并未嚴(yán)重受損。本研究對于探討活動期UC發(fā)病的免疫機(jī)制及今后尋找新的治療UC的藥物靶點(diǎn)具有重要意義。

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·臨床研究·

Changes in Frequency and Phenotype of Circulating CD11c+Myeloid Dendritic Cells in Patients With Active Ulcerative Colitis

WANG Xiangli1ZHENG Tiansong1JIA Ni’na2XIAO Jinmei2GAO Hong2ZHANG Jiping3ZHANG Huanhu2, 1 Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China, 2 Department of liver diseases, the second hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China, 3 Science and Technology Department of the second hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

[Abstract]Objective To investigate the frequency and phenotype of circulating CD11c+myeloid dendritic cells (mDC) in patients with active ulcerative colitis. Methods CD11c+mDC were isolated by immunomagnetic selection. Flow cytometry was used to analyze the frequency of circulating CD11c+mDC and costimulatory molecules CD80 and CD86 on freshly isolated mDCs. Results The frequency of peripheral CD11c+mDC in patients with active ulcerative colitis was significantly decreased as compared with that in the healthy controls [(0.31%±0.40%) vs. (0.78%±0.40%), P＜0.05]. Statistic differences of the CD11c+mDC frequency also existed among patients with different clinical severity. Both CD80 and CD86 expression on freshly isolated CD11c+mDC surface were lower, however, both CD80 and CD86 expression in the patients was relatively higher than that in the control [(6.83%±3.22%) vs. (2.50%±1.23%), (43.95%±16.42%) vs. (17.22%±7.53%), P＜0.05]. Conclusion Reduce the active UC patients and in the peripheral blood of CD11c+mDC frequency, but the surface of the CD11c+mDC costimulatory molecules CD80 and CD86 expression rate was not seriously damaged, active UC patients and in the peripheral blood of CD11c+mDC frequency decreased and were correlated with the clinical severity.

[Key words]Ulcerative colitis, Active, CD11c+myeloid dendritic cell, Frequency, Phenotype

【中圖分類號】R512

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）05-0033-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．05．022

基金項目：山西省衛(wèi)生廳科研課題（201201073）

通訊作者：張桓虎，E-mail：zhhh31@163．com