氯胺酮對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ATP酶活性的影響

周　彤，曹馨方，陳　希，陳　蕊，劉　沫，張　宇，魏成威，吳　越，于東旭，劉子睿，姜仁禮，李欣然，王冠穎，肖建華，高　利（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

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氯胺酮對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ATP酶活性的影響

周彤，曹馨方，陳希，陳蕊，劉沫，張宇，魏成威，吳越，于東旭，劉子睿，姜仁禮，李欣然，王冠穎，肖建華，高利
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

摘要：本試驗(yàn)研究不同濃度氯胺酮對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ATP酶活性的影響，并探討氯胺酮的中樞麻醉機(jī)制。體外培養(yǎng)懷孕16～18 d的胎鼠神經(jīng)細(xì)胞，至第8天直接給予3種不同濃度的氯胺酮，使用超微量ATP酶測(cè)定試劑盒，檢測(cè)胎鼠海馬中ATP酶的活力。結(jié)果顯示，海馬中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性均受到不同程度的抑制，并且這種抑制作用的程度具有劑量依賴的趨勢(shì)。據(jù)此推測(cè)氯胺酮的麻醉機(jī)制可能與抑制海馬中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：氯胺酮；麻醉；Na+-K+-ATP酶；Ca2+-Mg2+-ATP酶

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的ATP酶（Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶）的活性與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)關(guān)系密切，它們對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能起著極其重要的作用[2，4，7，9-10]。海馬作為邊緣系統(tǒng)中一個(gè)重要組成部分，在維持神經(jīng)系統(tǒng)功能中起著重要的作用。氯胺酮是苯環(huán)己哌啶的衍生物，屬于靜脈全身麻醉藥，臨床上用作手術(shù)麻醉劑或麻醉誘導(dǎo)劑，具有一定的精神依賴性。本試驗(yàn)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)研究不同濃度氯胺酮對(duì)其ATP酶活性的影響，探討氯胺酮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的抑制作用。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠39只，體重200±20 g，雌雄兼?zhèn)?，?6～18 d Wistar大鼠3只。購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)。

1.2試驗(yàn)器材與試劑Waters600高效液相色譜系統(tǒng)、色譜柱Symmetry C18（4.6×150 mm，5 μm）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）、75 μm細(xì)胞濾網(wǎng)。氯胺酮（沈陽(yáng)市獸藥廠，20110908）、Mouse anti-MAP2antibody（Cat.no.13-1500）、細(xì)胞裂解液（北京賽馳生物科技有限公司）、蛋白定量測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定將Wistar孕鼠手術(shù)常規(guī)斷頸處死，從子宮中取出胎鼠，取出大腦浸入Hank's平衡鹽溶液（含10 mmol/L HEPES、1 mmol/L丙酮酸鈉）中。分離海馬，用Hank's平衡鹽溶液漂洗3次，將海馬組織剪碎至1 mm3大小左右。0.25%胰酶37℃消化5～10 min，室溫孵育5 min；分別用Hank's平衡鹽溶液、BEM培養(yǎng)基（含10% FBS、4 500 mg/L葡萄糖、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 IU/mL青霉素、0.1 μg/mL鏈霉素）漂洗2次后于BEM培養(yǎng)基中重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于聚左旋賴氨酸包被的6孔板中，5% CO2、37℃培養(yǎng)，24～48 h后加入阿糖胞苷。每周兩次用Neurobasal medium培養(yǎng)基（含B-27、4.0 μmol/L L-谷氨酰胺、10 IU/mL青霉素、0.1 μg/mL鏈霉素）進(jìn)行半換液，維持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)。

神經(jīng)元的鑒定方法：MAP-2免疫熒光方法：4%多聚甲醛/蔗糖混合物室溫固定10 min；0.1% TritonX-100室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次；5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，甩去多余液體，滴加一抗，4℃過(guò)夜，0.01 mol/L PBS漂洗3次；生物素化二抗室溫孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次；抗褪色封片劑封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3.2細(xì)胞給藥濃度檢測(cè)大鼠39只，隨機(jī)分為低劑量組（D組），麻醉組（M組），高劑量組（G組）。D組腹腔注射氯胺酮10、20、30、40 mg/kg，M組腹腔注射氯胺酮50、60、70、80、90、100 mg/kg，G組腹腔注射氯胺酮150、200、300 mg/kg，每個(gè)濃度3個(gè)平行，心臟采血，高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)血藥濃度，確定氯胺酮細(xì)胞給藥濃度范圍。

1.3.3ATP酶活性測(cè)定根據(jù)氯胺酮在大鼠麻醉過(guò)程中的血藥濃度檢出值，確定氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞的濃度為0.7 μg/mL、1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL。在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第八天進(jìn)行細(xì)胞加藥，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，分別在加藥的0、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120 min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，取裂解后的細(xì)胞液，用ATP酶活力的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

2.1.1形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)板3 h鏡下觀察，培養(yǎng)板上細(xì)胞碎片較少，貼壁的神經(jīng)細(xì)胞大小均一，胞體為圓形，分散均勻，且折光度好，包體周?chē)泄鈺灠鼑▓D1-a）；在培養(yǎng)至第4天，從形態(tài)學(xué)上觀察未見(jiàn)其他雜質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元胞體變長(zhǎng)，形態(tài)隨突起的方向延伸，折光度好，細(xì)胞間隱約出現(xiàn)突起交織狀（圖1-b）；在培養(yǎng)至第8天，胞體成熟，折光度強(qiáng)，突起充分延展且清晰，并且相互交織成網(wǎng)絡(luò)且密集，特征形態(tài)明顯（圖1-c）。

圖1　大腦海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)3 h（a），4 d（b），8 d（c）鏡下觀察（倒置顯微鏡20×10）

2.1.2神經(jīng)細(xì)胞鑒定結(jié)果EVOS倒置熒光顯微鏡下觀察：神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)第8天，MAP-2免疫熒光鑒定下，神經(jīng)元呈熒光綠色，遍布于神經(jīng)元胞體、軸突、樹(shù)突明顯清晰，延展充分，神經(jīng)元之間交織呈網(wǎng)絡(luò)狀，呈典型的神經(jīng)原細(xì)胞形態(tài)（圖2）。

2.2血漿氯胺酮濃度39只大鼠給藥，翻正反射消失后，心臟采血，血藥濃度檢測(cè)結(jié)果如表1。

2.3不同濃度氯胺酮對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響如表2所示，在不同濃度氯胺酮的作用下，Na+-K+-ATP酶活性大體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。0.7 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，從10 min開(kāi)始Na+-K+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05），而1 μg/mL、3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，從5 min開(kāi)始Na+-K+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05）。0.7 μg/mL和1 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞120 min時(shí)，Na+-K+-ATP酶的活性恢復(fù)到對(duì)照組水平，3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞120min時(shí)，Na+-K+-ATP酶的活性仍沒(méi)有恢復(fù)。

2.4不同濃度氯胺酮對(duì)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響如表3所示，在不同濃度氯胺酮的作用下，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性大體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。0.7 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，從15 min開(kāi)始Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05），而1 μg/mL、3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后，從10 min開(kāi)始Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05）。1 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞90 min時(shí)，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性恢復(fù)到對(duì)照組水平，0.7 μg/mL、3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞120 min時(shí)，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性恢復(fù)到對(duì)照組水平。

圖2　大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)8 d免疫熒光染色鏡下對(duì)比觀察

表1　不同注射劑量下大鼠血藥濃度（μg/mL，n=3）

表2　不同濃度氯胺酮對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響（U/mLprot，n=3）

表3　不同濃度氯胺酮對(duì)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響（U/mLprot，n=3）

3　討論

Na+-K+-ATP酶在維持細(xì)胞膜通透性、膜內(nèi)外離子成分及維持細(xì)胞正常代謝等方面起重要作用。它能夠逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)Na+、K+，運(yùn)出3個(gè)Na+的同時(shí)運(yùn)入2個(gè)K+，從而維持細(xì)胞的正常生理功能，并對(duì)突觸之間的化學(xué)傳遞以及神經(jīng)傳導(dǎo)功能的興奮性具有重要作用。徐恩等[1]通過(guò)研究推測(cè)Na+-K+-ATP酶可能參與了海馬神經(jīng)元的保護(hù)。費(fèi)劍春等[2]報(bào)道，麻醉狀態(tài)下大腦皮質(zhì)內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性的降低與異氟醚、氯胺酮、氯丙嗪等藥物的中樞抑制作用存在密切聯(lián)系。細(xì)胞膜的Na+-K+-ATP酶的作用是降低細(xì)胞內(nèi)Na+的水平，進(jìn)而減少了細(xì)胞膜上Na+和Ca2+的交換，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低，從而維持鈣穩(wěn)態(tài)[3]。Na+-K+-ATP酶活性受到抑制，可導(dǎo)致動(dòng)作電位峰電流期間產(chǎn)生的膜內(nèi)高Na+和膜外高K+的狀態(tài)不能及時(shí)消除，致使動(dòng)作電位的后時(shí)相電位時(shí)程延長(zhǎng)，細(xì)胞的相對(duì)不應(yīng)期延長(zhǎng)，興奮性產(chǎn)生的閾值大幅度增高，引起受抑制區(qū)域所支配的各項(xiàng)生理功能暫時(shí)性地減退乃至喪失，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、肌松和無(wú)記憶等麻醉效應(yīng)[4-5]。

Ca2+-Mg2+-ATP酶是細(xì)胞膜上的Ca2+泵，可水解ATP，將胞內(nèi)2個(gè)Ca2+運(yùn)出的同時(shí)運(yùn)進(jìn)1個(gè)Mg2+，以維持細(xì)胞內(nèi)較低濃度的Ca2+`，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。該酶的活力降低，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度因泵受限而增高[6]，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，這是細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。近年來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)表明靜脈麻醉藥、吸入麻醉藥、鎮(zhèn)靜藥和鎮(zhèn)痛藥均可以抑制Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性[7-11]。Ca2+-Mg2+-ATP酶活性受到明顯抑制后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)多余的Ca2+不能及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)至膜外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離型Ca2+濃度升高，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而影響神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生與興奮性傳導(dǎo)，對(duì)中樞神經(jīng)產(chǎn)生一定的抑制效應(yīng)。另有研究證明，吸入麻醉藥可能是通過(guò)與酶蛋白結(jié)合[12]、直接抑制酶的活性部位[13]或作用于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用的表面[14]來(lái)影響酶的活性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，不同濃度氯胺酮作用于神經(jīng)細(xì)胞后均可對(duì)ATP酶跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的影響，與對(duì)照組相比差異顯著，在25 min或30 min ATP酶活性會(huì)降到最低，隨著時(shí)間的推移，酶活性會(huì)逐漸恢復(fù)，且氯胺酮的濃度越高對(duì)ATP酶的活性產(chǎn)生的影響越明顯，恢復(fù)的速度也越慢。

4　結(jié)論

麻醉濃度的氯胺酮直接作用于神經(jīng)細(xì)胞后對(duì)Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶產(chǎn)生明顯的影響，且隨氯胺酮濃度的升高，ATP酶活性降低明顯，表明氯胺酮發(fā)揮麻醉作用可能與影響ATP酶的活性有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐恩，彭文宏，詹麗璇.低氧預(yù)處理通過(guò)鈉鉀ATP酶對(duì)成年大鼠短暫全腦缺血保護(hù)[C].中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，成都：2010.

[2]費(fèi)劍春.Na+，K+-ATP酶及麻醉藥對(duì)其影響[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè)，2002，23（5）：291-293.

[3] Barber D，Hunt J，Ehrich M . Inhibition of calcium-stimulated ATPase in the brain P2 synaptosomal fraction by organophosphos?phorus esters：relevance to delayed neuropathy[J].J Toxicol Envi?ton Health A，2001，63（2）：101-113.

[4]陳君，王國(guó)林.離子通道理論與麻醉[J].天津醫(yī)藥，2003，31 （4）：261-264.

[5] Shantii N D，Desai P V.The Study of Na+-K+-ATPase Activity of Rat Brain during Crush Syndrome[J] . NeurochemicalResearch，2007，32（11）：1843-1848.

[6]趙亞麗，宋錦萍，楊玉華，等.不同強(qiáng)度微波輻射對(duì)小鼠腦組織鈣、鎂ATP酶活性的影響[J] .中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2000，11（2）：101-104.

[7]劉悅張，瑾?jiǎng)⒀?，任建軍，?七氟醚后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注時(shí)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響[J].中國(guó)麻醉學(xué)雜志，2010，30（10）：1179-1181．

[8]賈淑偉，李玉榮，楊玉玲，等.孤啡肽和嗎啡對(duì)大鼠皮層體感區(qū)Ca2+-ATP酶活性的影響[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（2）：154-156．

[9] M Volpi，R I . Sha'Afi，P . M . Epstein，et al . Local anesthetic s，mepacrine，and propranolol are antagonists of calmodulin[J] .Pro?ceedings of the National Academy of Sciences，1981，78（2）：795-799．

[10]范宏剛，盧德章，胡魁，等.噻環(huán)乙胺對(duì)大鼠不同腦區(qū)突觸體Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的動(dòng)態(tài)影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（10）：89-91．

[11 Elena Garcia-Martin，Carlos Gutierrez-Merino. Local anesthetic s Inhibit the Ca2 +-Mg2 +-ATPase Activity of Rat Brain Synapto?somes[J].Journal of Neurochemistry，1986，47（3）：668-671．

[12] Janicki P K，Horn J L，Singh G，et al . Increased anesthetic re?quirement for isoflurane halothane enflurane and desflurane in obese rats are associated with insulin-induced stimulation of plas?ma membrane Ca2+-ATPase[J].Life Sci，1996，59（17）：269-275.

[13] Lopez M M，Kosk K D.Spectroscopic analysis of halothane bind?ing to plasma membrane Ca2+-ATPase[J].Biophys J，1998，74（2 Pt 1）：974-980.

[14] Pflugmacher D，Sandermann H J.The lipid/protein interface as a target site for general anesthetics：a multiple-site kinetic analysis of synaptosomal Ca2 +-ATPase[J] . Biochem Biophys Acta，1998，1415（1）：174-180.

Effect of Ketamineon theactivity of Atpasein Rats hippocampal Neurons

ZHOU Tong，CAO Xin-fang，CHEN Xi，CHEN Rui，LIU Mo，ZHANG Yu，WEI Cheng-wei，WU Yue，YU Dong-xu，LIU Zi-rui，JIANG Ren-li，LI Xin-ran，WANG Guan-ying，XIAO Jian-hua，GAO Li （College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract：In this study，we investigated the mechanisms of ketamine anesthesia on the central nervous system by examing the effect of different concentrations of ketamine on the activity of Atpase in Rats hippocampal Neurons.Fetal rat neurons from 16～18 days of pregnancy fetal rats were incubated at day 15 in culture with three different concentrations of ketamine，and adenosinetri?phosphatase assay kit was used to detect the activity of ATPase in the Fetal rat hippocampal.Our results showed that ketamine con?centration-dependently suppressed the activity of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase.These data indicate that central anes?thetic effect of ketamine may be related to the reduction in the activity of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase.

Key words：Ketamine；Anesthesia；Na+-K+-ATPase；Ca2+-Mg2+-ATPase

中圖分類(lèi)號(hào)：S857.144

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0010-04

收稿日期：2015-04-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31372491）；黑龍江省自然科學(xué)基金（C201113）；黑龍江省教育廳基金（12531016）

作者簡(jiǎn)介：周彤（1990-），女，碩士生，從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：zhoutong1254@163.com

通訊作者:高利，E-mail：gaoli43450@163.com

Corresponding author：GAO Li