金花茶花朵總皂苷體外抗氧化實驗研究

程金生　韋卓恒　陳信炎　鄭啟祥　梁香　歐陽小月

【摘要】目的：研究金花茶花朵總皂苷活性成分的抗氧化活性。方法：以金花茶花朵為原料，以乙醇為提取介質(zhì)，通過Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂分離純化金花茶花朵中總皂苷，以維生素C（VitC）為對照品對金花茶花朵總皂苷進(jìn)行抗氧化及還原能力實驗。結(jié)果：金花茶花朵總皂苷回收率為902%；羥基自由基清除能力、有機自由基清除能力、氧陰離子清除能力、亞硝酸根離子清除能力等實驗自由基清除率的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為075 mg/ml、005 mg/ml、026mg/ml； 還原能力試驗自由基清除率的半數(shù)抑制濃度（IC50）為083 mg/m。結(jié)論：金花茶花朵具有較好的抗氧化能力，是一種較好的天然自由基清除原料。

【關(guān)鍵詞】皂苷；金花茶；花朵；抗氧化活性

【中圖分類號】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）10-0027-04

Abstract：Objective to study the antioxdidant activity of the total saponins in the flower of Camellia nitidissima Chi. Method By starting from dry flowers of Camellia nitidissima Chi， the ingredients of saponins were extracted by 95% of ethanol. Successively， the saponins extraction was purified by macroporous resin of Amberlite XAD-4. Meanwhile， five series antioxidant experiments VS VitC had been conducted on the saponins extraction of Camellia nitidissima Chi. Results the recovery rate of the extraction and purification experments was 902%. Antioxidant experiments and reduction ability experiment were conducted in this work： 1） The hydroxyl radical scavenging capacity； 2） organic radical scavenging capacity； 3） oxygenanion removal ability； 4） the nitrite ion removal ability； 5） reducing abilities experiment. Investigations showed that half of the inhibition of IC50 of the first four clearance rate tests are 075 mg/ml， 005mg/ml， 026mg/ml and 0.83 mg/ml， respectively.Conclusion Camellia nitidissima Chi flower is excellent natural antioxidants with superior antioxidant performance.

Keywords：Saponins； Camellia nitidissima Chi， Flower； Antioxidant activitity

金花茶（Camellia nitidissima Chi）在《中國植物志》[1]系統(tǒng)地定位為山茶科、山茶族、山茶屬。1933年中國山茶科植物研究專家、中山大學(xué)張宏達(dá)教授在景烈采到第一株金黃色山茶花標(biāo)本。1960年，廣西藥物研究所學(xué)者在廣西十萬大山采集標(biāo)本時發(fā)現(xiàn)大面積金黃色茶花，并正式命名為金花茶[2]。金花茶是我國一級重點珍稀保護(hù)植物，有著“植物界大熊貓”之美稱。其葉和花等部位除富含茶多酚、β-谷甾醇、總黃酮、多種氨基酸、齊墩果酸、可溶性糖、天然維生素E等天然活性成分外，皂苷也是其主要活性成分之一[3-4]。一些研究者開展了金花茶皂苷類活性成分的提取分離及相關(guān)活性研究。如蘇琳等利用超聲提取、大孔樹脂富集以及制備色譜等技術(shù)對金花茶葉水溶性部分進(jìn)行分離純化，得到3個單體化合物，運用核磁共振、質(zhì)譜、紅外等表征手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定分別為人參皂苷Rg1、人參皂苷F1和人參皂苷F5等[5]。黃艷等由金花茶分離得到了一種達(dá)瑪烷皂苷類新化合物，新化合物被命名為（3β，6α，12β）-3，6，12-三羥基達(dá)瑪烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-（2→1）-O-β-D-吡喃葡萄糖-（2→1）-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。作者采用CCk-8法對該化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性實驗，結(jié)果顯示該化合物可以有效抑制人肺癌BeL-7402細(xì)胞和人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長 [6]。

隨著長壽及養(yǎng)生產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，人們對天然、無毒的抗氧化劑需求日益增大。金花茶作為衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新資源食品之一，皂苷活性成分豐富，并開展了金花茶葉中皂苷抗氧化的相關(guān)研究[7]。研究以金花茶花朵為原料，通過乙醇提取及Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂純化，得到純化后的金花茶花朵總皂苷，并開展金花茶總皂苷抗基自由基（·OH）、抗二苯基苦基苯肼自由基（DPPH·）、抗超氧陰離子（O2-·）自由基、抗亞硝酸鹽（NO2-）等抗氧化實驗及還原能力實驗研究。

1儀器、材料與方法

11儀器FA-A/JA-N 電子天平（海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TU-1901雙光束可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；GL-25M離心機（上海趙迪生物科技有限公司）；電子天平（上海實干實業(yè)有限公司）；Wi94186恒溫水浴箱（北京東西儀科技有限公司）。

12材料金花茶花朵等原料由廣東盛世通生物有限公司提供。Amberlite XAD-4非離子型大孔樹脂（阿拉丁試劑（上海）有限公司），人參皂苷Rb1（上海生工）。所用試劑均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑有限公司。金花茶花朵總皂苷提取液為自制。

13提取或檢測方法

131金花茶花朵優(yōu)選及花朵中總皂苷分離純化采摘秋季新鮮的金花茶花朵，采用電子秤稱重；對采摘的新鮮金花茶花朵按照《中華人民共和國藥典》（2010年版）要求進(jìn)行優(yōu)選，除去質(zhì)量較差花朵，優(yōu)選出的金花茶花朵原料必須符合無霉變、無異味、無雜質(zhì)等藥典要求；將優(yōu)選出金花茶花朵洗凈后，真空干燥得金花茶花朵干品。

取上述干品300 g，用多功能粉碎機粉碎，過30目篩，隨后加入15 L 95%乙醇，置于超聲清洗儀（90 kHz）超聲提取30min，合并3次提取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，加水至200ml，加石油醚250ml萃取，重復(fù)兩次，留水層；再用等體積正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收正丁醇，得金花茶花朵總皂苷浸膏。該浸膏用甲醇定容在100ml容量瓶中，即得待測樣品溶液，備用。精密吸取待測溶液01ml于試管中，水浴揮干甲醇，依次加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液02ml和高氯酸08ml，于60℃水浴加熱15min，隨后冰浴冷卻5min，加冰醋酸5ml搖勻，以試劑為空白對照，產(chǎn)物在560nm處測定吸收值，計算樣品溶液中金花茶皂苷含量：金花茶皂苷含量=樣品溶液中皂苷含量（mg）/樣品質(zhì)量（g）。

參考并改進(jìn)文獻(xiàn)方法[8]，采用Amberlite XAD-4非離子型大孔樹脂（洗脫劑：10%、20%、30%異丙醇），原液上樣（質(zhì)量濃度2442mg/ml，pH 48），上樣流速為120 BV/h，洗脫過程首先用125 BV，蒸餾水除雜，再依次用175 BV和2 BV對金花茶花朵總皂苷提取液進(jìn)行分離除雜，得到較純金花茶花朵總皂苷，供后續(xù)抗氧化實驗使用。

132檢測方法

1321金花茶花朵中總皂苷含量測定采用香草醛-硫酸法測定，以人參皂苷Rb1為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中皂苷的含量。人參皂苷Rb1對照品經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后于TU-1901雙光束可見分光光度計上作最佳吸收波長掃描，并繪制掃描曲線，顯色后，反應(yīng)物在560nm處有最大吸收且2 h內(nèi)吸光度保持穩(wěn)定。

1322標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品溶液1ml（濃度分別為：01、008、005、002、001mg/ml）于試管中，水浴揮干甲醇，加5%香草醛-冰醋酸溶液02ml，高氯酸08ml，于60℃水浴加熱15min，隨后水中低溫冷卻5min，加冰醋酸5ml搖勻，以實際空白對照，反應(yīng)產(chǎn)物在560nm處測定吸收值，以人參皂苷Rb1為對照品繪制測定標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

14體外抗氧化實驗

141金花茶花朵總皂苷對羥基自由基（·OH）清除能力的測定

1411實驗原理羥基自由基（·OH）是體內(nèi)最活潑的活性氧，具有極強的氧化能力。該實驗方法采用芬頓體系，在各自的吸收范圍內(nèi)測定吸光度值的變化，可得到受試抗氧化劑清除·OH的情況。

1412實驗方法在試管中加入45ml pH=74的磷酸緩沖溶液，15ml 15 mmol/l的鄰二氮菲溶液，充分混勻，加入1ml 15 mmol/l FeSO4溶液，立即混勻，加入1ml維生素C標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液（025mg/ml），金花茶待測液的濃度依次為05、075、1、15mg/ml。分別混勻，再加入1ml 002%H2O2，同時做樣品空白試驗。另做損傷管和未損傷管，其中損傷管中加入1ml 002%H2O2與1ml的蒸餾水，未損傷管不加H2O2，直接加入2ml蒸餾水（損傷管與未損傷管用磷酸緩沖液調(diào)零）。于37℃保溫60min，510nm處測A值，重復(fù)2次，羥基自由基的清除率按照下式計算：

清除率%=A加樣-A樣品空白-A損傷A未損傷-A損傷×100%

142金花茶花朵總皂苷對有機自由基DPPH·清除能力的測定

1421實驗原理DPPH·（1，1-二苯基苦基苯肼）是一種人工合成的自由基。該物質(zhì)在517nm有強烈的吸收峰，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受試物后，測定在同一時間內(nèi)不同濃度抗氧化劑對DPPH·吸光度的影響，反映其抗氧化能力的強弱。

1422實驗方法取不同濃度的各試樣液4ml于試管中（其中維生素C標(biāo)準(zhǔn)液和金花茶待測液的濃度依次為001、005、025、05、10mg/ml），再加入4ml DPPH·的乙醇溶液（濃度為200 μmol/l），混合均勻，避光保存05 h后用分光光度計在517nm處測定其吸光度A1：同時測4ml DPPH·溶液+4ml 乙醇混合后的吸光度A，對照和4ml提取液加4ml乙醇混合后的吸光度A樣品空白，重復(fù)2次，按下式計算各試樣對DPPH·的清除率：

清除率%=A對照-A1-A樣品空白A0×100%

143金花茶花朵總皂苷對超氧陰離子（O2-·）清除能力的測定

1431實驗原理實驗通過用過氧化物酶（如辣根過氧化物酶）催化東莨菪原被H2O2氧化生成非熒光產(chǎn)物。將受試物加入該反應(yīng)體系，檢測非熒光物質(zhì)的生成情況，以了解受試物同H2O2反應(yīng)的情況。

1432實驗方法取6支具塞試管，分別加入45ml pH=82 Tris-HCl緩沖溶液和1ml不同濃度的各試樣液（其中維生素C標(biāo)準(zhǔn)液和金花茶待測液的濃度依次為001、003、005、01、03mg/ml）。置于25℃水浴中保溫25min，隨后加入25℃下預(yù)熱的03ml鄰苯三酚（3 mmol/l）啟動反應(yīng)，在30s 內(nèi)加入5ml蒸餾水，最后在25℃水浴下繼續(xù)反應(yīng)4min，立即滴加05ml 濃度為8 mol/l 的HCl終止反應(yīng)。在325nm波長處測定吸光度。同時設(shè)置對照管，對照管以緩沖溶液調(diào)零。加藥管則分別以相同濃度樣品液調(diào)零實，重復(fù)2次，按下式計算超氧陰離子的清除率：

清除率%=A對照-A加藥-A空A對照×100%

144金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根離子（NO2-）清除能力的測定

1441實驗原理在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸萘7-胺偶合形成紫紅色染料，其最大吸收波長在538nm，能夠清除亞硝酸鹽（NO2-）的物質(zhì)可使紫紅色染料538nm的吸光度值減弱，因此可通過測定在538nm的吸光度值間接反應(yīng)受試物清除亞硝酸鹽（NO2-）的能力。

1442實驗方法NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制10、75、l、25、1μg/ml的NaNO2溶液，在538nm波長處測定吸光度，繪制曲線。用移液管精確吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液00、02、04、06、08、10、15、20、25ml于一組50ml容量瓶中，各加水至25ml，分別加入2ml 04%對氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜置3到5min后加入1ml 02%鹽酸萘乙二胺溶液，并用重蒸水定容到50ml，搖勻，靜置15min后，用分光光度計在540nm波長下測定吸光度，以蒸餾水為空白。以測得的各比色液的吸光度對應(yīng)的亞硝酸濃度作曲線。比色液中亞硝酸鈉濃度為0～03μg/ml時，兩者呈直線關(guān)系。

對亞硝酸根離子（NO2-）清除能力的測定：取1ml不同濃度的各試樣液于10ml比色管中（其中維生素C標(biāo)準(zhǔn)液與金花茶待測液的濃度依次為01、05、1 、3、5mg/ml）。加入5μg/ml的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液05ml，在37℃恒溫水浴中反應(yīng)30min 。取出后立即加入1ml 04%的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5min后加入05ml 02%的鹽酸荼乙二胺溶液，加水至l0ml刻度，混勻，靜置15min，以不加NaN02和樣品溶液的試劑為空白，于538nm處測定吸光值。通過NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的NaNO2含量。重復(fù)兩次，按下式計算其平均值。

清除率%=n加入NaNO2-n殘留NaNO2n加入NaNO2×100%

145金花茶花朵總皂苷還原能力的測定

1451實驗原理還原能力的測定是以待測樣是否為一良好的電子供應(yīng)者為評價。若是其供應(yīng)的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可與自由基結(jié)合成惰性的物質(zhì)，中斷自氧化鏈鎖反應(yīng)，可認(rèn)為是良好的電子供應(yīng)者。

1452實驗方法在25ml pH=66的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的各試樣液25ml（其中維生素C標(biāo)準(zhǔn)液與金花茶待測液的濃度依次為001、003、005、01、03mg/ml）和1%的鐵氰化鉀溶液25ml，混合物在50℃下恒溫20min后，再加入25ml 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 r/min離心分離10min，取上層清液5ml，加蒸餾水5ml和01%FeCl3溶液1ml，在700nm處測定吸光度，吸光度越高，還原能力越強。

2結(jié)果與分析

21金花茶花朵中總皂苷分離純化及含量測定采用香草醛-硫酸法測定，以人參皂苷Rb1為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以實際空白對照，溶液經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后于雙光束可見分光光度計上作最佳吸收波長掃描，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中皂苷的含量，結(jié)果見表1。人參皂苷Rb1對照品濃度范圍為0001～001mg/ml。

上樣前金花茶花朵粗皂苷濃度為699mg/ml，經(jīng)過Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂吸附，梯度濃度的異丙醇洗脫后，得到洗出液。當(dāng)繼續(xù)濃縮到與上樣液等體積時，粗皂苷溶液濃度為631mg/ml，皂苷回收率為902%。上述實驗結(jié)果證明XAD-4非離子型大孔樹脂有較好的分離純化金花茶花朵中總皂苷的能力。這主要源于皂苷為中等極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，較易溶于極性較大的溶劑。實驗顯示，金花茶花朵總皂苷在95%乙醇中的溶解度比在水或無水甲醇中的溶解度更大（見表2）?；诖?，下述實驗均采用95%乙醇為提取介質(zhì)分離純化金花茶花朵中總皂苷供后續(xù)抗氧化實驗使用。

22總皂苷對羥基自由基（·OH）清除能力的測定由圖1可知，金花茶花朵中總皂苷和維生素C對對羥基自由的清除率與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，二者有劑量依賴性，且清除率隨濃度的增大而提升。金花茶花朵總皂苷濃度介于025mg/ml～152mg/ml之間時，其清除率均稍低于維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的清除率。當(dāng)金花茶花朵總皂苷濃度達(dá)到152mg/ml時，兩者清除率均達(dá)到了峰值，且二者的清除率基本相等。表明金花茶花朵總皂苷對對羥基自由基有較好的清除能力，且濃度在152mg/ml時清除率達(dá)到峰值，高達(dá)100%。此外，當(dāng)金花茶花朵總皂苷濃度范圍在05～10mg/ml時，其對羥基自由基的清除率率線性良好，IC50為075mg/ml。

23總皂苷對有機自由基DPPH·清除能力的測定以吸光度A值為縱坐標(biāo)，以自由基DPPH·濃度（μmol/ml）為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程： Y=00070X+00256，R2=09998（Y：吸光度；X：DPPH·濃度），其線性范圍為40～200 μmol/ml。見圖2。

由圖3可知，VitC標(biāo)準(zhǔn)品與金花茶花朵總皂苷對DPPH·的清除率均隨濃度的增加而增加，金花茶花朵總皂苷對DPPH·的清除率與濃度基本呈線性關(guān)系。在較低濃度下，金花茶花朵總皂苷對DPPH·已有較強的清除能力。在001～025mg/ml濃度范圍時，金花茶花朵總皂苷清除率亦有較好的線性關(guān)系，IC50為005mg/ml。當(dāng)金花茶花朵總皂苷在007mg/ml時，其對DPPH·自由基的清除率為852%，與VitC標(biāo)準(zhǔn)品對DPPH·自由基的清除率數(shù)據(jù)實現(xiàn)交叉。當(dāng)金花茶花朵總皂苷大于007mg/ml時，其對DPPH·自由基的清除率均高于VitC標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的清除率，充分展現(xiàn)了金花茶花朵總皂苷在清除有機自由基DPPH·方面的優(yōu)勢。

24總皂苷對超氧陰離子（O2-·）清除能力的測定由圖4可知，金花茶花朵總皂苷、VitC對超氧陰離子（O2-·）有一定的清除能力，并且清除能力隨著濃度的增大而提升。當(dāng)濃度低于01mg/ml時，金花茶花朵總皂苷的清除能力比等同濃度下VitC清除能力強。當(dāng)金花茶花朵總皂苷濃度大于01mg/ml，其對超氧陰離子（O2-·）的清除率反而低于同濃度下VitC對超氧陰離子（O2-·）的清除率。當(dāng)二者濃度均為03mg/ml時，金花茶花朵總皂苷清除率為609%，低于VitC清除率（812%）。表明在低濃度下金花茶花朵總皂苷才具有優(yōu)于VitC標(biāo)準(zhǔn)品的超氧陰離子（O2-·）清除效率，金花茶花朵總皂苷IC50為026mg/ml。

25總皂苷對亞硝酸根離子（NO2-）清除能力的測定為衡量金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根離子（NO2-）清除能力，以吸光度A值為縱坐標(biāo)，亞硝酸鈉濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，得回歸方程式為：Y=05041X+00012，R2=09914（Y：吸光度；X：亞硝酸鈉濃度），其線性范圍為006 μg/ml～063 μg/ml。見圖5。

由圖6可知，VitC與金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根的清除率均隨濃度的增大而升高。當(dāng)金花茶花朵總皂苷濃度小于1mg/ml時，其清除效果略微強于VitC。當(dāng)金花茶花朵總皂苷濃度達(dá)到1mg/ml時，其清除率達(dá)到了536%以上，與VitC清除率相等。在10mg/ml～50mg/ml范圍內(nèi)，金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根清除率僅有微幅提示，提升幅度顯著弱于等濃度下VitC標(biāo)準(zhǔn)品。表明金花茶花朵總皂苷對亞硝酸鈉的清除能力僅在低濃度下具有相對VitC標(biāo)準(zhǔn)品略優(yōu)的清除率，其IC50為083mg/ml。

26金花茶總皂苷還原能力的測定[10-11]維生素C與金花茶花朵總皂苷具有良好的還原能力，是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可以與自由基成為較惰性的物質(zhì)，從而中斷自氧化連鎖反應(yīng)。由圖7可知，在700nm處測定吸光度，吸光度越高，則還原能力越強。但低濃度下，金花茶花朵總皂苷還原能力有限，如當(dāng)其濃度在001mg/ml時，其吸光度值接近0。而當(dāng)金花茶花朵總皂苷濃度為003mg/ml時，其吸光度值大幅升高到371%。當(dāng)金花茶花朵總皂苷濃度范圍在003mg/ml-005mg/ml范圍時，其還原能力（A值）僅有小幅提升。在所有濃度范圍內(nèi)，金花茶花朵總皂苷還原能力均顯著低于維生素C。表明在還原能力方面，金花茶花朵總皂苷并不具優(yōu)勢。

3結(jié)論

研究采用乙醇為提取介質(zhì)對金花茶花朵中總皂苷進(jìn)行提取，通過Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂分離純化金花茶皂苷，回收率為902%。以維生素C為對照品對金花茶花朵中總皂苷進(jìn)行了羥基自由基清除能力、有機自由基清除能力、氧陰離子清除能力、亞硝酸根離子清除能力等四種抗氧化實驗及還原能力實驗，不同自由基的四種抗氧化實驗均有一定的抗氧化能力，四種抗氧化實驗自由基清除率半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為075、005、026、083mg/ml。在還原能力方面，金花茶花朵中總皂苷弱于同濃度下維生素C。表明金花茶是一種較好的天然自由基清除原料，有望作為食品工業(yè)、日用化學(xué)品工業(yè)的天然抗氧化劑，具有深一步的研究與開發(fā)意義。

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（收稿日期：20160323）