HPLC-MS法分析玉米須中黃酮苷類化合物

李 強， 李 婷， 王丹丹， 任 虹

（北京工商大學食品學院/北京市食品風味化學重點實驗室/北京市食品添加劑工程技術研究中心/食品質量與安全北京實驗室，北京 100048）

HPLC-MS法分析玉米須中黃酮苷類化合物

李 強， 李 婷， 王丹丹， 任 虹*

（北京工商大學食品學院/北京市食品風味化學重點實驗室/北京市食品添加劑工程技術研究中心/食品質量與安全北京實驗室，北京 100048）

研究了玉米須中的黃酮苷類成分。通過硅膠柱層析和Sephadex LH-20層析對玉米須乙酸乙酯提取物初步純化，采用液相色譜-質譜聯(lián)用法對其中的黃酮苷類化合物進行分析。結果表明，玉米須乙酸乙酯提取物中含有3種黃酮苷類化合物，分別為5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-6-C-2"-O-二鼠李糖苷、5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-3-C-阿拉伯糖-6-C-鼠李糖苷和ax-5"-甲烷-3′-甲氧基玉米素。

玉米須；黃酮苷類；HPLC-MS法

玉米須是禾本科玉蜀黍屬植物玉米（Zea mays L.）在成熟收獲季節(jié)的雌花花柱和柱頭。現(xiàn)代藥理研究表明玉米須富含黃酮及其苷類、多糖、甾醇、生物堿、有機酸、揮發(fā)油、微量元素以及維生素等多種成分［1］，具有顯著的利尿、降血糖、抑菌、增強免疫、抗氧化、抗癌等功效［2-6］。臨床上，玉米須廣泛用于高血壓、膽道結石、糖尿病等多種疾病的臨床治療［1］。作為農作物玉米生產中的副產物，玉米須來源豐富，價格低廉，易于采集，是一種有待全面開發(fā)利用的藥用資源。黃酮苷類化合物是玉米須的主要活性成分之一，其分離純化及活性成為研究熱點。目前，大多熱衷于玉米須總黃酮苷的提取工藝［7-10］，但對玉米須中含有的黃酮苷類化合物成分的報道較少。本實驗通過硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析對玉米須乙酸乙酯提取物進行分離純化，采用液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用法分析其黃酮苷類化合物，為玉米須藥食同源資源的研究開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須購于山東沂南；甲醇、乙腈（均為色譜純），F(xiàn)isher公司；無水甲醇、二氯甲烷、無水乙醇、乙酸乙酯（均為分析純），北京化工廠；硅膠，青島海洋化工廠；LH-20型Sephadex，北京博雅宏興科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ME102E/02型電子天平，梅特勒-托利多（上海）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；RE-520型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠；1200型高效液相色譜儀、1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Deca co型質譜儀，美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米須乙酸乙酯提取物萃取

稱取3. 5 kg玉米須粉末，用體積分數70%乙醇以料液比1：15（g：mL）浸提3次，每次3 h，過濾，合并濾液，45℃下真空旋轉蒸發(fā)濃縮。分別用等體積的二氯甲烷、乙酸乙酯對濃縮液進行分級萃取，并將各提取層提取液旋轉蒸發(fā)濃縮得到不同提取層的浸膏，其中二氯甲烷層浸膏60. 20 g，乙酸乙酯層浸膏19. 95 g。

1.3.2 玉米須乙酸乙酯提取物純化

采用反復硅膠柱層析和凝膠柱層析方法對乙酸乙酯層浸膏進行純化，流程見圖1。具體操作如下: 1）稱取20 g硅膠拌樣，選擇減壓柱型號為6. 5 cm× 30 cm，采用干法裝柱，用真空泵抽實，依次用二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇（50：1，4：1），甲醇梯度洗脫，每種洗脫劑洗脫3次，根據薄層層析結果合并相同流分。2）對組分3再次進行硅膠柱層析，依次用二氯甲烷：甲醇（10：1，8：1，5：1，2：1），甲醇梯度洗脫，對二氯甲烷：甲醇為5：1洗脫組分進行Sephadex LH-20柱層析，收集組分3-1-1。

圖1 玉米須乙酸乙酯提取物純化流程Fig. 1 Flow chart of purified technology

1.3.3 高效液相色譜制備乙酸乙酯提取物成分

采用半制備高效液相色譜對組分3-1-1中的物質進行制備。色譜條件:反相色譜ZORBAX SB-C18半制備柱（250 mm×9. 4 mm，10 μm），流動相為甲醇-水體系，采用甲醇45%（0～45 min），甲醇45%～70%（45～60 min）梯度洗脫，流速為4. 0 mL/ min，進樣量100 μL，柱溫30℃，280 nm下檢測。

1.3.4 LC-MS分析玉米須乙酸乙酯提取物成分

色譜條件:反相色譜ZORBAX SB-C18分析柱（250 mm×4. 6 mm，5 μm），流動相A為0. 1%TFA-水；B為0. 1%TFA-乙腈，梯度10%～100%B（0～20 min），100%B（20～35 min），流速為200 μL/ min，進樣量10 μL，柱溫30℃，280 nm下檢測。

質譜條件:電噴霧離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度275℃，離子源溫度200℃，母離子m/ z 285，激活電壓1. 5 V，質量掃描范圍m/ z 300～1 000。

2 結果與分析

2.1 HPLC制備乙酸乙酯提取物中黃酮類成分

采用三氯化鋁顯色法測定乙酸乙酯提取物中黃酮質量分數為6. 47%，乙酸乙酯提取物（19. 95g）經過硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析純化后得到組分3-1-1，其液相色譜圖如圖2。從圖中可以看出在保留時間為17. 24，33. 08，35. 21 min時有3個明顯吸收峰，分別命名為組分A、組分B和組分C。

圖2 組分3-1-1液相色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of fragment 3-1-1

2.2 HPLC-MS法分析黃酮苷類化合物結構

采用HPLC-MS法對制備得到的化合物A、B、C進行結構推測，見圖3～圖8。

化合物A呈淡黃色，紫外光譜圖（見圖3（a））顯示其在240～280 nm和320～380 nm都有吸收帶，初步判斷為黃酮苷類化合物。其正離子一級質譜圖（見圖4（a））出現(xiàn)m/ z 593. 1［M + H］+離子峰，表明其相對分子質量為592，分子式為C28H32O14，在其二級質譜圖（見圖4（b））中m/ z 431為［M-Rha + 2H］+峰，提示分子中可能含有鼠李糖基，參照文獻［1］推斷化合物A為5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-6-C-2"-O-二鼠李糖苷，其結構如圖7（a），其MS裂解過程如圖8（a）。

化合物B呈淡黃色，紫外光譜圖（見圖3（b））與化合物A相似，在240～280 nm和320～380 nm都有吸收帶，初步判斷為黃酮苷類化合物，其正離子一級質譜圖（見圖5（a））出現(xiàn)m/ z 579.1［M +H］+離子峰，表明其相對分子質量為578，分子式為C27H30O14，在其二級質譜圖（見圖5（b））中m/ z 301為［M-280 +3H］+峰，推測可能是黃酮C環(huán)產生RDA裂解。參照文獻［11］推斷化合物B為5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-3-C-阿拉伯糖-6-C-鼠李糖苷，其結構如圖7（b），其MS裂解過程如圖8（b）。

圖3 化合物A、B、C紫外圖譜Fig. 3 UV spectrum of compound A，B and C

圖4 化合物A質譜圖Fig. 4 MS spectrum of compound A

化合物C呈淡黃色，紫外光譜圖（見圖3（c））也與化合物A相似，在240～280 nm和320～380 nm都有吸收帶，是黃酮苷類化合物，其正離子一級質譜圖（見圖6（a））出現(xiàn)m/ z 590. 9［M + H］+離子峰，表明其相對分子質量為590，分子式為C28H30O14，在其二級質譜圖（見圖6（b））中m/ z 445為［M-Rha + 2H］+峰。參照文獻［12］推斷化合物C為ax-5"-甲烷-3′-甲氧基玉米素，其結構如圖7（c），其MS裂解過程如圖8（c）。

3 結 論

玉米須乙酸乙酯提取物的主要活性成分為黃酮苷類物質，其結構類型、含量與其產地、品種及采收時期等多因素有關，萃取溶劑不同，得到的成分也不同。張慧恩等［13］從產自無錫玉米須中分離純化出3個黃酮苷類化合物，分別為刺芒柄花素，2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-（3-脫氧葡萄糖基）-3"-甲氧基木犀草素和2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-（6-脫氧-ax-5甲基-木-己-4-羰基）-3"-甲氧基木犀草素。徐燕等［14］從產自安徽的玉米須中分離得到6-乙?；?木犀草素。任順成等［15-16］在玉米須黃酮的含量測定、分離純化方面做了大量研究，并通過柱層析法得到6個黃酮類化合物，經鑒定其中4個分別為ax-5"-methane-3′-metho xymaysin、2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-巖藻糖基-3′-甲氧基木犀草素、7，4′-二羥基-3′-甲氧基黃酮-2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-巖藻糖苷、6，4′-二羥基-3′，5′-二甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖苷。

圖5 化合物B質譜圖Fig. 5 MS spectrum of compound B

圖6 化合物C質譜圖Fig. 6 MS spectrum of compound C

圖7 化合物A、B、C結構Fig. 7 Chemical structures of compound A，B，and C

圖8 化合物A、B、C裂解過程Fig. 8 Pyrolysis process of compound A，B，and C

本實驗通過硅膠柱層析和Sephadex LH-20柱層析對山東產玉米須乙酸乙酯提取物中黃酮苷類成分進行分離純化，并利用半制備高效液相色譜制備，采用HPLC-MS法分析得到3個黃酮苷類化合物，分別是5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-6-C-2"-O-二鼠李糖苷、5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-3-C-阿拉伯糖-6-C-鼠李糖苷和ax-5"-甲烷-3′-甲氧基玉米素。

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Analysis of Flavonoid Glycosides Derived from Corn Silk by HPLC-MS

LI Qiang， LI Ting， WANG Dandan， REN Hong*
（School of Food and Chemical Engineering/ Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry/ Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/ Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Composition of flavonoid glycosides in corn silk were analyzed in this study. Ethyl acetate extractive of corn silk was purified by the silica gel column and sephadex LH-20 column chromatography. Flavonoid glycosides in corn silk were analyzed by HPLC-MS. Results showed that ethyl acetate extractive of corn silk had three kinds of flavonoid glycosides，which were 5，7，4′-trihydroxy-3′-methoxyflavone-6-C-2"-O-dirhamnoside，5，7，4′-trihydroxy-3′-methoxyflavone-3-C-arabinose-6-C-rhamnoside，and ax-5"-methane-3′-methoxymaysin were analyzed by HPLC-MS.

corn silk；flavonoid glycosides；HPLC-MS method

檀彩蓮）

TS201.2.

A

10. 3969/ j. issn. 2095-6002. 2016. 02. 009

2095-6002（2016）02-0056-06

李強，李婷，王丹丹，等. HPLC-MS法分析玉米須中黃酮苷類化合物［J］.食品科學技術學報，2016，34（2）:56-61.

LI Qiang，LI Ting，WANG Dandan，et al. Analysis of flavonoid glycosides derived from corn silk by HPLC-MS［J］. Journal of Food Science and Technology，2016，34（2）:56-61.

2015-06-24

國家“863”計劃項目（2011AA060701）。

李 強，女，碩士研究生，研究方向為天然活性物質；

*任 虹，女，副教授，博士，主要從事天然活性物質方面的研究。通信作者。