EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖

李國棟，王洋洋，劉玉河，李湘奇泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，山東 泰安271000

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EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖

李國棟，王洋洋，劉玉河，李湘奇
泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，山東 泰安271000

［摘要］背景與目的：EPHA2能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)及胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力，但EPHA2調(diào)控胃癌細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)及胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的分子機(jī)制依然不明確。Akt/mTOR信號通路能夠通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)及胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力，且有研究表明EPHA2能夠激活A(yù)kt/mTOR信號通路?；诖?，該研究探討了Akt/mTOR信號通路在EPHA2促胃癌細(xì)胞增殖中的作用。方法：采用蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot）檢測過表達(dá)EPHA2和敲低EPHA2表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞中Akt、mTOR和4EBP1磷酸化的影響。使用Akt抑制劑MK2206和mTOR抑制劑RAD001分別處理轉(zhuǎn)染空載體病毒的SGC-7901-NC細(xì)胞和過表達(dá)EPHA2的SGC-7901-EPHA2細(xì)胞，分別通過CCK8、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)。結(jié)果：過表達(dá)EPHA2增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化，敲低EPHA2的表達(dá)抑制SGC-7901細(xì)胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化。MK2206和RAD001處理細(xì)胞時，EPHA2過表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞增殖、細(xì)胞S期和Cyclin D1表達(dá)的促進(jìn)作用被顯著抑制。結(jié)論：EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖能力，提示我們將來針對EPHA2高表達(dá)的胃癌患者或許可以采用Akt抑制劑和mTOR抑制劑予以個體化治療。

［關(guān)鍵詞］EPHA2；Akt/mTOR信號通路；胃癌；SGC-7901細(xì)胞

Correspondence to: LI Xiangqi E-mail: lxqaaa@aliyun.com

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位于第四位，致死率位于第三位［1］。我國胃癌發(fā)病率遠(yuǎn)高于歐、美國家，占到全球新增病例的40%以上［2］。EPHA2是受體酪氨酸激酶EPH家族成員，其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌和膽管癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，EPHA2 在77.3%胃癌患者的胃癌組織中高表達(dá)［4］，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲低EPHA2的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移［5］。最近的研究表明，EPHA2是通過增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移［6］，且發(fā)現(xiàn)EPHA2能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)及胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力，但EPHA2調(diào)控胃癌細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)及胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的分子機(jī)制依然不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR信號通路能夠通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)及胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力［7］，且有研究表明EPHA2能夠激活A(yù)kt/ mTOR信號通路［8］?；诖?，本研究探討了Akt/mTOR信號通路在EPHA2促胃癌細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

胃癌細(xì)胞株SGC-7901由本研究室保存。過表達(dá)EPHA2的慢病毒和攜帶EPHA2 shRNA的慢病毒為上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Akt抑制劑MK2206和mTOR抑制劑RAD001為美國Selleck公司產(chǎn)品。EPAH2、Akt、pAkt-473、pAkt-308、mTOR、p-mTOR-2448、4EBP1、p4EBP1-65和Cyclin D1抗體均為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。Tubulin抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 SGC-7901-EPHA2和SGC-7901-shEPHA2穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

SGC-7901細(xì)胞以5×105個/孔的密度接種到60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，24 h后，分別使用攜帶EPHA2基因的重組慢病毒顆粒（LV-EPHA2）和攜帶EPHA2 shRNA的重組慢病毒顆粒（LV-shEPHA2)及相應(yīng)的空載體對照病毒(SGC-7901-NC、SGC-7901-shNC)感染SGC-7901細(xì)胞，48 h后加嘌呤霉素篩選，持續(xù)篩選至不再有細(xì)胞死亡為止。

1.3 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測

蛋白質(zhì)提取后使用BSA法進(jìn)行定量，取等量的蛋白質(zhì)加入5×SDS后進(jìn)行沸水浴5~10 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)完后將膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入相應(yīng)的一抗4 ℃溫育過夜，1×TBST洗膜3次后加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗室溫溫育1 h，1×TBST洗膜3次后化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，對蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。

1.4 CCK8 實(shí)驗(yàn)

在96孔板中分別接種SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細(xì)胞，每孔2 000個細(xì)胞，24 h后分別用DMSO、MK2206（0.1 μmol/L）和RAD001（20 nmol/L）處理48 h。每孔加入15 μL CCK8溶液，37 ℃溫育1 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（D）值。每個時間點(diǎn)平行做3個孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)用表示。

1.5 細(xì)胞周期檢測

SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細(xì)胞分別用DMSO、MK2206（0.1 μmol/L）和RAD001（20 nmol/L）處理48 h后收集細(xì)胞，PBS清洗2次后加入預(yù)冷的75%乙醇-20 ℃固定過夜。固定后的細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌2次，加入100 μg/mL的RNA酶于37 ℃溫育30 min后加入50 μg/mL的PI室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EPHA2基因過表達(dá)及沉默表達(dá)胃癌細(xì)胞株的建立

為了研究EPHA2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們首先通過慢病毒感染及嘌呤霉素篩選的方法建立了EPHA2基因持續(xù)過表達(dá)和沉默表達(dá)的胃癌細(xì)胞株。我們用攜帶EPHA2基因的重組慢病毒顆粒（LV-EPHA2）轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞建立了過表達(dá)EPHA2的胃癌細(xì)胞株SGC-7901-EPHA2。Western blot檢測結(jié)果如圖1A。與未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染空載體病毒的SGC-7901-NC細(xì)胞中EPHA2的表達(dá)沒有顯著變化，而轉(zhuǎn)染LV-EPHA2病毒的SGC-7901-EPHA2細(xì)胞中EPHA2的表達(dá)顯著升高。我們使用攜帶EPHA2 shRNA的重組慢病毒顆粒（LV-shEPHA2）感染SGC-7901細(xì)胞建立了EPHA2基因沉默表達(dá)的胃癌細(xì)胞株SGC-7901-shEPHA2。Western blot檢測結(jié)果如圖1B。與未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染空載體病毒的SGC-7901-shNC細(xì)胞中EPHA2的表達(dá)沒有變化，而轉(zhuǎn)染LV-shEPHA2病毒的SGC-7901-shEPHA2細(xì)胞中EPHA2的表達(dá)顯著降低。

圖1　EPHA2過表達(dá)及沉默表達(dá)胃癌細(xì)胞株的建立Fig.1 Generation of SGC-7901 cell lines stably overexpressing EPHA2 or silencing EPHA2

2.2 EPHA2增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞中Akt/mTOR信號通路

Western blot檢測結(jié)果如圖2。EPHA2過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)Akt分子的磷酸化，同時顯著促進(jìn)了mTOR分子及其下游分子4EBP1的磷酸化，說明過表達(dá)EPHA2能夠增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞中Akt/mTOR信號通路；而敲低EPHA2能夠顯著抑制Akt分子的磷酸化，同時顯著抑制了mTOR分子及其下游分子4EBP1的磷酸化，說明敲低EPHA2的表達(dá)能夠抑制SGC-7901細(xì)胞中Akt/ mTOR信號通路。

圖2　EPHA2增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞中Akt和mTOR的磷酸化Fig.2 EPHA2 promoted the phosphorylation of Akt and mTOR in SGC-7901 cells

2.3 EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖

CCK-8檢測結(jié)果如圖3。在DMSO對照組中，EPHA2過表達(dá)顯著促進(jìn)了SGC-7901的增殖(1.55±0.09 vs 1.00±0.04，P=0.001 6)；當(dāng)用Akt抑制劑MK2206和mTOR抑制劑RAD001分別處理細(xì)胞時，EPHA2對SGC-7901細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用被顯著抑制(MK2206：0.65±0.03 vs 0.66±0.03，P=0.638 4；RAD001：0.76±0.04 vs 0.77±0.05，P=0.782 8)。這說明EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)了SGC-7901細(xì)胞的增殖。

圖3　MK2206和RAD001對SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of MK2206 and RAD001 on the proliferation of SGC-7901-NC and SGC-7901-EPHA2 cells

2.4 EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞周期進(jìn)程

細(xì)胞周期檢測結(jié)果如圖4。在DMSO對照組中，EPHA2過表達(dá)顯著促進(jìn)了SGC-7901細(xì)胞中S期的比例［(28.51±1.07)% vs (37.41±1.31)%， P=0.001 7］；而當(dāng)用MK2206和RAD001分別處理細(xì)胞時，EPHA2對SGC-7901 S期的促進(jìn)作用卻被顯著抑制［(MK2206：(18.64±1.28)% vs (19.53±1.74)%，P=0.593 1；RAD001：(22.18±1.46)% vs (23.38±1.51)%，P=0.464 6］。這說明EPHA2能夠通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞周期進(jìn)程。

2.5 EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果如圖5A。在DMSO對照組中，EPHA2過表達(dá)顯著促進(jìn)了SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)(1.00±0.07 vs 1.81±0.12，P=0.001 1)，而當(dāng)用MK2206處理細(xì)胞時，EPHA2對SGC-7901中Cyclin D1的表達(dá)的促進(jìn)作用被顯著抑制(0.51±0.08 vs 0.42±0.15，P=0.425 9)。在DMSO對照組中，EPHA2過表達(dá)顯著促進(jìn)了SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)(1.00±0.08 vs 1.73±0.11，P=0.001 7)；而當(dāng)用RAD001處理細(xì)胞時，EPHA2對SGC-7901 中Cyclin D1的表達(dá)的促進(jìn)作用卻被顯著抑制(0.55±0.08 vs 0.57±0.10，P=0.939 8，圖5B)。這說明EPHA2能夠通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)SGC-7901的細(xì)胞周期進(jìn)程。

圖5　MK2206和RAD001對SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of MK2206 and RAD001 on the expression of Cyclin D1 in SGC-7901-NC and SGC-7901-EPHA2 cells

3 討 論

EPHA2在胃癌細(xì)胞的增殖和遷移過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，EPHA2通過增強(qiáng)wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)EMT進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移［6］，但是EPHA2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中EGFR、PI3K和PTEN的突變均能使Akt 和mTOR的磷酸化程度增高［9］，且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Akt和mTOR的磷酸化程度與胃癌的惡性程度呈正相關(guān)，而與患者的生存期呈負(fù)相關(guān)［10］，表明Akt/mTOR信號通路在胃癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Akt/ mTOR信號通路能夠通過多種機(jī)制促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖：mTOR激酶通過磷酸化4EBP1增強(qiáng)胃癌細(xì)胞中的帽依賴性翻譯進(jìn)而促進(jìn)Cyclin D1蛋白的翻譯和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力［11］；Akt/mTOR信號通路能夠促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞中VEGF信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖［12-13］。

為了探索Akt/mTOR信號通路在EPHA2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖中的作用，我們建立了穩(wěn)定過表達(dá)EPHA2的胃癌細(xì)胞株SGC-7901-EPHA2和穩(wěn)定敲低EPHA2表達(dá)的胃癌細(xì)胞株SGC-7901-shEPHA2，然后進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EPHA2能夠顯著促進(jìn)Akt、mTOR 和4EBP1的磷酸化，敲低EPHA2能夠顯著抑制Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化，說明EPHA2增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞中Akt/mTOR信號通路。隨后，我們使用MK2206和RAD001處理細(xì)胞，阻斷Akt/mTOR信號通路。發(fā)現(xiàn)EPHA2對SGC-7901細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的促進(jìn)作用被顯著抑制，說明EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。CyclinD1在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用［14］，且其表達(dá)受Akt/mTOR信號通路調(diào)控，我們發(fā)現(xiàn)了抑制Akt/mTOR信號通路能夠拮抗EPHA2對SGC-7901中Cyclin D1表達(dá)的促進(jìn)作用，說明EPHA2能夠通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)SGC-7901的細(xì)胞周期進(jìn)程。

EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展已經(jīng)在多種腫瘤中報(bào)道。在膽管癌中，過表達(dá)EPHA2增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路，進(jìn)而促進(jìn)CHO-CK細(xì)胞的體外增殖能力和體內(nèi)成瘤能力［15］；在乳腺癌中，磷酸化的EPHA2能夠通過PI3K激活A(yù)kt參與曲妥珠單抗耐藥［16］；在宮頸癌中，EPHA2以RhoG依賴的方式激活A(yù)kt促進(jìn)HeLa細(xì)胞的存活［17］。此外，Akt也可以反向通過調(diào)控EPHA2的磷酸化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。研究表明，Akt通過增強(qiáng)EPHA2第897位絲氨酸的磷酸化促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力［18］。

總之，本研究結(jié)果顯示，EPHA2通過增強(qiáng)Akt/mTOR信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，提示我們將來針對EPHA2高表達(dá)的胃癌患者可以采用Akt抑制劑和mTOR抑制劑予以個體化治療。

［參 考 文 獻(xiàn)］

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EPHA2 promotes SGC-7901 cell proliferation through enhancing Akt/mTOR signaling pathway

LI Guodong， WANG Yangyang， LIU Yuhe， LI Xiangqi （Department of General Surgery， Affiliated Hospital of Taishan Medical University， Taian 271000， Shandong Province， China）

［Key words］EPHA2； Akt/mTOR signaling pathway； Gastric cancer； SGC-7901 cell

［Abstract］Background and purpose: EPHA2 has been reported to enhance the proliferation of gastric cancer cells through promoting CyclinD1 expression and cell cycle progression.However， the underlying mechanism that EPHA2 promotes CyclinD1 expression and cell cycle progression is still poorly understood.Akt/mTOR signaling pathway has been reported to enhance the proliferation of gastric cancer cells by promoting CyclinD1 expression and cell cycle progression， and some studies have shown that EPHA2 can activate Akt/mTOR signaling pathway.Based on this， this study investigated whether EPHA2 promoted gastric cancer SGC-7901 cell proliferation through enhancing Akt/mTOR signaling pathway.Methods: Western blot was used to determine the effect of EPHA2 overexpression or knockdown on the phosphorylation of Akt and mTOR in SGC-7901 cells.SGC-7901-NC infected with control lentivirus and SGC-7901-EPHA2 cells with EPHA2 overexpression were treated with DMSO， MK2206 （an Akt inhibitor） and RAD001 （a mTOR inhibitor） for different time periods， respectively.Cell proliferation was detected using the CCK8 assay.Cell cycle was detected using flow cytometry， and the expression of CyclinD1 was determined by Western blot.Results: Overexpression of EPHA2 enhanced Akt/mTOR signaling pathway in SGC-7901 cells， and silencing EPHA2 in SGC-7901 cells inhibited Akt/mTOR signaling pathway.MK2206 and RAD001 antagonized the promoting effect of EPHA2 on the proliferation， S-phase and CyclinD1 expression of SGC-7901 cells， respectively.Conclusion: EPHA2 promotes SGC-7901 cell proliferation through enhancing Akt/mTOR signaling pathway.Akt inhibitor or mTOR inhibi-tor could be an effective treatment strategy for gastric cancer patients overexpressing EPHA2.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.02.002

中圖分類號：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)02-0128-06

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（ZR2013HM038）。

通信作者：李湘奇 E-mail：lxqaaa@aliyun.com

收稿日期：（2015-09-08 修回日期：2015-12-10）