一株中性嗜鹽菌Halobacillus dabanensis N522的分離鑒定及其抗菌活性研究

倪志華張玉明周艷芬

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，保定 071002）

一株中性嗜鹽菌Halobacillus dabanensis N522的分離鑒定及其抗菌活性研究

倪志華1，2張玉明1周艷芬1，2

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，保定 071002）

從廣東省徐聞鹽場沉積物中分離嗜鹽菌，鑒定目標(biāo)菌株、考察培養(yǎng)條件，并對發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)研究。用稀釋涂布法分離嗜鹽菌，通過生理生化實驗和16S rRNA基因序列分析鑒定分離得到的菌株；采用管碟法考察嗜鹽菌發(fā)酵液的抗菌活性，并對其抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行理化分析。結(jié)果顯示，分離得到一株嗜鹽菌，經(jīng)生理生化實驗和16S rRNA序列分析鑒定后命名為達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌（Halobacillus dabanensis）N522，其最適生長pH值和NaCl濃度分別為7.0和100 g/L，屬于中度嗜鹽菌類群。菌株N522的發(fā)酵液對多種細(xì)菌和真菌具有抑制作用，其中，對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)。經(jīng)硫酸銨鹽析和蛋白酶實驗分析，初步確定菌株N522所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)為多肽，分子量在3-5 kD之間，并且該抗菌活性物質(zhì)對pH和溫度穩(wěn)定性良好。曬鹽場沉積物中分離得到的中度嗜鹽菌H. dabanensis N522可作為開發(fā)抗菌藥物的潛在新來源。

中度嗜鹽菌；鑒定；達(dá)坂喜鹽芽孢桿菌；抗菌活性

嗜鹽菌是生活在高鹽度環(huán)境中的一類微生物總稱。由于特殊的生存環(huán)境，嗜鹽菌形成了獨(dú)特的種群特點和代謝機(jī)制，可產(chǎn)生許多具有特殊功能的代謝產(chǎn)物。根據(jù)對鹽度需求的不同，嗜鹽菌可以分為3類［1］：輕度嗜鹽菌，可在1%-3%的鹽度下快速生長；中度嗜鹽菌，最適生長鹽度為3%-15%；極端嗜鹽菌（一般屬于古菌），可以在15%-30%鹽度下快速生長。與輕度嗜鹽菌相比，中度嗜鹽菌可在較高鹽環(huán)境中生長，能減少發(fā)酵過程中雜菌污染［2，3］。并且，與極端嗜鹽菌相比，中度嗜鹽菌的分布廣泛、營養(yǎng)要求較低、易于適應(yīng)環(huán)境，工業(yè)應(yīng)用價值高。

曬鹽場是一類特殊的生境，由于含鹽度較高，沉積物中蘊(yùn)藏著豐富的嗜鹽菌資源，從曬鹽場分離篩選嗜鹽菌已經(jīng)引起研究關(guān)注［4，5］。徐聞鹽場始建于1956年，位于廣東省湛江市徐聞縣的一個半島上，是廣東省四大省屬鹽場之一。徐聞鹽場沉積物經(jīng)過多年的蓄積，形成了特殊的高鹽生態(tài)環(huán)境，十分適合嗜鹽菌生存。本研究從徐聞鹽場采集環(huán)境樣品，旨在從中分離培養(yǎng)嗜鹽菌，著重尋找具備分泌抗菌活性產(chǎn)物的菌株。通過生理生化實驗和16S rRNA序列分析對篩選得到的嗜鹽菌進(jìn)行分類鑒定?？疾焓塞}菌株的生長特性和抗菌活性，并對其所產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)開展理化特性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，使用前121℃滅菌20 min；YEPD（Yeast Extract Peptone Dextrose）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 7.0，使用前115℃滅菌15 min。上述培養(yǎng)基若制備固體培養(yǎng)基，加入20 g/L瓊脂粉即可。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、篩選及鑒定 樣品采集于廣東省湛江市徐聞鹽場沉積物。取1.0 g樣品于100 mL含有100 g/L NaCl的液體LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)3 d以富集嗜鹽菌。富集培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后取0.2 mL涂布LB固體培養(yǎng)基平板（含有100 g/L NaCl），37℃培養(yǎng)，挑取生長速度快、菌落直徑大的單菌落，多次分離純化，以得到純培養(yǎng)物。將篩選得到的菌株參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［6］進(jìn)行生理生化鑒定，并對其16S rRNA序列擴(kuò)增測序，擴(kuò)增時使用細(xì)菌通用引物：正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、 反 向 引 物1492R（5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'），實驗方法參照文獻(xiàn)［1］，測序由北京華大基因公司完成，測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行比對分析。

1.2.2 菌株的生理特性考察 使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離得到的菌株，測定其在不同NaCl濃度和pH條件下生長的菌體生物量（OD600），培養(yǎng)條件為：150 r/min、37℃，培養(yǎng)時間為24 h。實驗使用的NaCl濃度梯度為：30、80、100、120、150和200 g/L；pH實驗梯度分別為：3.0、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0。

1.2.3 管碟法測定抗菌活性

1.2.3.1 指示菌 革蘭氏陽性細(xì)菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）；革蘭氏陽性細(xì)菌：德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）；酵母菌：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；絲狀真菌：黑曲霉（Aspergillus niger）、綠色木霉（Trichodermaviride）、黃曲霉（Aspergillus flavus）。

1.2.3.2 待測發(fā)酵樣品制備 將分離得到的嗜鹽菌接種到含100 g/L NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)24 h獲得待測發(fā)酵液。培養(yǎng)得到的發(fā)酵液于10 000 r/min條件下離心20 min去除菌體，保留上清液待測。

1.2.3.3 指示菌菌懸液及檢測平板制備 將指示菌分別接種至含有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)24 h得到菌懸液。其中，細(xì)菌指示菌培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃和150 r/min；釀酒酵母和絲狀真菌培養(yǎng)使用YEPD培養(yǎng)基，條件為28℃和200 r/min。

將制備好的指示菌菌懸液與LB培養(yǎng)基或YEPD培養(yǎng)基按照1∶100（V/V）混合，倒平板，待凝固后備用。每個平板中含有培養(yǎng)基約20 mL。

1.2.3.4 抗菌活性的檢測 參照李曉鳳等［7］描述的管碟法檢測抗菌活性。在1.2.3.3中制備好的檢測平板上放置滅菌后的牛津杯，向每個牛津杯中加入待測菌的發(fā)酵上清液100 μL，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑來表征抗菌活性高低。用未接種的LB培養(yǎng)基（含有100 g/L NaCl）作陰性對照，以消除培養(yǎng)基組分對抑菌結(jié)果的干擾。本研究獲得的抑菌圈直徑數(shù)值均為待測菌所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的真實抑菌效果體現(xiàn)，即為發(fā)酵上清液抗菌圈直徑減去陰性對照抑菌圈直徑。每個平板中放置6個牛津杯，其中3個為陰性對照，每種指示菌做3個平行實驗，實驗結(jié)果為3組實驗的平均值。

1.2.4 抗菌物質(zhì)的初步鑒定 按方法1.2.3.2制備嗜鹽菌發(fā)酵上清液。參照劇建格等［8］描述的方法，研究嗜鹽菌發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)類別。按方法1.2.3.4以金黃色葡萄球菌為指示菌檢測抗菌物質(zhì)的抗菌能力。

首先，通過比較嗜鹽菌培養(yǎng)前后發(fā)酵液pH值的變化判斷發(fā)酵過程中是否產(chǎn)生有機(jī)酸/堿性。然后，用650 g/L的硫酸銨對發(fā)酵上清液進(jìn)行鹽析處理，收集沉淀復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液（25 mmol/L pH7.0）中，進(jìn)行抑菌活性測定，同時用未經(jīng)鹽析處理的發(fā)酵上清液作對照。最后，考察待測菌發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的蛋白酶敏感性。將蛋白酶 K 和胃蛋白酶配成5.0 g/L的溶液，分別取 0.1 mL 于離心管中，再加入嗜鹽菌發(fā)酵上清液0.4 mL，使酶的終濃度為 1.0 g/L。蛋白酶 K反應(yīng)體系的pH值為7.0，胃蛋白酶的反應(yīng)體系 pH值為2.5。將0.1 mL超純水代替酶溶液作為蛋白酶實驗對照組，37℃溫育4 h后取樣檢測抑菌活性的變化。

1.2.5 抗菌物質(zhì)分子量范圍的確定 使用MSC300型實驗室小型超濾杯（上海摩速科學(xué)器材有限公司），更換不同截留分子量超濾膜（3 kD、5 kD、10 kD、20 kD、100 kD）處理方法1.2.3.2制備獲得的嗜鹽菌發(fā)酵上清液，收集超濾膜透過液，以金黃色葡萄球菌為指示菌，按方法1.2.3.4檢測其抗菌活性，以未經(jīng)處理的嗜鹽菌發(fā)酵上清液作對照。

1.2.6 抗菌物質(zhì)酸堿和溫度穩(wěn)定性考察 按方法

1.2.3.2 制備嗜鹽菌發(fā)酵上清液。用0.1 mol/L的HCl及0.1 mol/L的NaOH溶液將發(fā)酵上清液調(diào)至pH值分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，室溫25℃靜置30 min，然后再調(diào)至中性（pH7.0）。最后，將實驗組和對照組（未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液）使用無菌水調(diào)整至相同體積，再依照方法1.2.3.4以金黃色葡萄球菌為指示菌檢測抗菌活性。

對待測菌發(fā)酵上清液進(jìn)行不同溫度（37℃、60℃、90℃）處理。在相應(yīng)溫度靜置保持一段時間（30 min、60 min、90 min）后，再依方法1.2.3.4以金黃色葡萄糖球菌為指示菌考察抑菌性能。

表1 菌株N522的生理生化特征

2 結(jié)果

2.1 菌種的分離鑒定

對從徐聞鹽場沉積物中采集的樣品進(jìn)行嗜鹽菌分離篩選。以含有100 g/L NaCl的LB培養(yǎng)基富集樣品，37℃培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液明顯渾濁，將其適當(dāng)稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，經(jīng)多次分離純化，獲得一菌株純培養(yǎng)物，命名為N522。

菌株N522在LB 固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣整齊、不透明、顯乳白色、表面突起、濕潤而有光澤。顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，該菌呈桿狀，有中生或端生芽胞，菌體長2.5-3.7 μm，寬0.6-0.8 μm。菌株N522革蘭氏染色呈陽性，其生理生化實驗結(jié)果如表1。菌株N522的16S rRNA進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank（登錄號為KT364252）。經(jīng)過序列比對分析，菌株N522與達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌（Halobacillus dabanensis）同源性達(dá)99%以上。根據(jù)生理生化實驗結(jié)果和16S rRNA測序分析結(jié)果，初步鑒定菌株N522為達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌，命名為Halobacillus dabanensis N522。使用Hitachi SU8010型掃描電子顯微鏡觀察H. dabanensis N522的結(jié)果如圖1所示。

圖1 H. dabanensis N522的掃描電鏡圖

2.2 菌株N522生理特征描述

在37℃，pH值7.0培養(yǎng)條件下，首先考察了NaCl濃度對菌株N522生長的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)NaCl濃度為30 g/L時，菌 株N522生長很微弱，培養(yǎng)24 h后菌體生物量（以O(shè)D600表征）僅有0.20。在NaCl濃度為80-150 g/L范圍內(nèi)，菌株N522呈現(xiàn)明顯生長狀態(tài)。當(dāng)NaCl濃度為100 g/L時，菌體生長得到生物量最高。當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)升高，菌株N522生長受到抑制。當(dāng)LB培養(yǎng)基中NaCl濃度達(dá)到200 g/L時，菌體生物量下降明顯。結(jié)果顯示，菌株N522在NaCl濃度為100 g/L時，生長最為旺盛，是典型的嗜鹽菌。根據(jù)微生物生長對NaCl濃度［1］范圍依賴程度，推斷菌株N522屬于中度嗜鹽菌類群。

圖2 NaCl濃度對N522生長的影響

在37℃，NaCl濃度為100 g/L時的培養(yǎng)條件下，考察培養(yǎng)基pH對菌株N522生長的影響，結(jié)果見圖3。培養(yǎng)基初始pH為3.0時，菌株N522生長很微弱；隨著培養(yǎng)基初始pH的上升（由3.0上升到7.0），菌種N522生長明顯，培養(yǎng)得到的菌體生物量逐漸增高；當(dāng)培養(yǎng)基pH超過7.0時，培養(yǎng)所得菌體生物量又呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這說明菌株N522的最適生長pH為7.0。

圖3 pH值對N522生長的影響

表2 嗜鹽細(xì)菌N522的抗菌活性

2.3 菌株N522的抗菌活性

菌株N522發(fā)酵上清液對供試指示菌的抗菌實驗結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，菌株N522的發(fā)酵上清液抗菌譜廣，對所有供試指示菌都具有抑制作用。其中，對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制能力很強(qiáng)，抑菌圈的直徑均達(dá)到10 mm以上。尤其對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)，抑菌圈達(dá)到13.26±0.47 mm。菌株N522對革蘭氏陰性菌和釀酒酵母也具有一定的抑制能力，但抑菌效果相對較弱，抑菌圈直徑均低于4 mm。并且，菌株N522發(fā)酵上清液對供試的絲狀真菌均具有較為理想的抑制能力，抑菌圈的直徑均在6 mm以上，抑制能力大小順序為：黑曲霉＞黃曲霉＞綠色木霉。

2.4 抗菌物質(zhì)的初步鑒定

菌株N522使用初試pH值為7.0的LB培養(yǎng)基（含有10 g/L NaCl）進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)檢驗，培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵上清液 pH 值為 7.3左右，相比初始培養(yǎng)基pH值（7.0）沒有明顯改變。因此，可以判斷菌株N522的抗菌活性不是源于培養(yǎng)產(chǎn)生的有機(jī)酸/堿物質(zhì)。菌株N522發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨鹽析和蛋白酶處理，對金黃色葡萄球菌指示菌的抑制結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，菌株N522發(fā)酵液經(jīng)鹽析后得到的料液抗菌活性明顯增高，這表示抗菌物質(zhì)是可被硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)或者多肽類物質(zhì)。蛋白酶敏感性實驗結(jié)果顯示，菌株N522發(fā)酵上清液中抑菌活性物質(zhì)對蛋白酶K非常敏感，經(jīng)酶解處理后抑菌能力明顯下降。并且，胃蛋白酶處理也會降低發(fā)酵上清液的抗菌活性，只是破壞性要小于蛋白酶K。

表3 不同處理對抑菌活性的影響

2.5 抗菌物質(zhì)分子量研究

菌株N522發(fā)酵上清液經(jīng)不同截留分子量超濾膜處理后，檢測其對金黃色葡萄球菌的抑菌能力。實驗結(jié)果顯示，未經(jīng)超濾膜處理的發(fā)酵上清液抑菌圈直徑為12.97±0.57 mm。菌株N522發(fā)酵上清液經(jīng)截留分子量10 kD、20 kD、100 kD的超濾膜過濾后，透過液的抑菌活性與對照組相比沒有明顯變化。經(jīng)5 kD超濾膜處理后 的透過液抑菌圈直徑為10.89±0.61 mm，具有與對照組相似的抑菌能力。然而，發(fā)酵上清液經(jīng)3 kD超濾膜處理后，透過液抑菌能力下降，抑菌圈直徑僅為3.04±0.36 mm。結(jié)果表明，超濾膜截留分子量高于5 kD時，抑菌活性物質(zhì)不會被截留，而3 kD超濾膜可明顯截留抗菌活性物質(zhì)。說明菌株N522產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)分子量在3 kD到5 kD之間。結(jié)合硫酸銨鹽析結(jié)果，可以推斷菌株N522抗菌活性物質(zhì)屬于多肽類物質(zhì)。

2.6 抗菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性研究

2.6.1 pH穩(wěn)定性考察 圖4顯示了N522所產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對pH的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果以相對抗菌活性形式呈現(xiàn)，未經(jīng)處理的N522發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑定義為100%。結(jié)果顯示，在pH 5.0-8.0的范圍內(nèi)抗菌活性變化不大；pH低于5.0時，抗菌活性隨著酸度的增加而明顯下降；pH高于9.0時，抗菌活性也呈現(xiàn)隨堿性升高而下降的趨勢，但是下降趨勢較為平緩。

圖4 抗菌肽的pH穩(wěn)定性

2.6.2 抗菌活性物質(zhì)對溫度的穩(wěn)定性考察 N522發(fā)酵上清液經(jīng)不同溫度（37℃、60℃和90℃）處理后，以金黃色葡萄球菌為指示菌，考察發(fā)酵上清液抑菌能力變化，實驗結(jié)果如圖5所示。實驗結(jié)果以相對抗菌活性形式呈現(xiàn)，未經(jīng)處理的N522發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑定義為100%。

圖5 抗菌肽的熱穩(wěn)定性

從圖5可以看出，N522產(chǎn)生的抗菌肽具有良好的熱穩(wěn)定性。在溫度37℃時，發(fā)酵上清液放置90 min內(nèi)，抗菌活性沒有明顯變化。在60℃處理30 min后，抗菌活性變化不明顯；繼續(xù)60℃處理到60 min時，抗菌能力有所下降，但相對抗菌活性仍保持在94%左右；處理90 min后，抗菌活性下降為對照組的87%左右。發(fā)酵上清液經(jīng)90℃處理30 min后抗菌活性也相對穩(wěn)定；處理60 min后，抗菌活性降低為對照組的73%左右；值得指出的時，當(dāng)在90℃高溫處理90 min后，發(fā)酵上清液仍能保持約55%的抗菌活性。

3 討論

嗜鹽菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，功能獨(dú)特，近幾年來一直是研究的熱點。本研究從廣東徐聞鹽場沉積物中篩選具有抗菌活性的嗜鹽菌，分離得到的嗜鹽菌N522在pH值6.0-9.0之間均可以顯著生長，NaCl生長范圍為80-150 g/L，最適生長鹽度為100 g/L，說明該菌屬于中度嗜鹽菌。根據(jù)其生理生化特征和16S rRNA序列分析，初步鑒定該菌株是達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌（Halobacillus dabanensis）。喜鹽芽胞桿菌屬（Halobacillus）是一個1996年才正式建立的菌屬，最早由Spring等［9］發(fā)現(xiàn)并定義，模式種為Halobacillus halophila。目前該屬細(xì)菌已經(jīng)包含至少11個種，如Halobacillus litoralis、Halobacillus tureperi、Halobacillus yeomjeoni、Halobacillus dabanensis。喜鹽芽胞桿菌可分泌多種耐鹽酶類（如淀粉酶、脂肪酶），在工業(yè)微生物領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大［10，11］。值得指出的是，有報道喜鹽芽胞桿菌還能夠合成抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)，這引起了藥物工作者的廣泛關(guān)注。例如，Yang等［12］報道從海洋沉積物中分離得到的Halobacillus litoralis YS3106可以產(chǎn)生拮抗真菌的環(huán)肽類物質(zhì)。陳雷等［1］研究報道了Halobacillus tureperi的抗菌抗腫瘤活性。

受限于菌種資源，國內(nèi)外針對達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌的報道還不多。達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌最早由Liu等［13］發(fā)現(xiàn)于我國新疆地區(qū)達(dá)坂鹽湖，因分離的地點“達(dá)坂”而得名。Kheiralla等［14］報道從埃及分離得到達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌，并對其產(chǎn)生物表面活性劑特性進(jìn)行了闡述。Feng等［15］研究了不同鹽濃度環(huán)境下達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌D-8T菌株的蛋白表達(dá)譜差異，從而闡述了其耐鹽分子機(jī)制，并且，趙百鎖等［16］對上述菌株中四氫嘧啶合成基因和谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行了克隆和功能分析，詳細(xì)研究了其耐鹽機(jī)制和應(yīng)用前景。

本研究中從我國廣東徐聞鹽場沉積物中分離得到了達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌，拓寬了該菌株的地理存在范圍。并且，首次發(fā)現(xiàn)喜鹽達(dá)坂桿菌具備很好的抗菌活性，尤其是對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制作用。近年來，由于金黃色葡萄球菌感染幾率的增加以及抗生素濫用所導(dǎo)致的耐藥性菌株的出現(xiàn)，使該菌引起感染的治療變得越來越困難［17］。因此，尋找和開發(fā)新型的抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì)，已成為醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題。本研究分離得到的菌株N522對金黃色葡萄球菌具備較高的抑制能力，預(yù)示該菌株的抗菌特性具有較好的應(yīng)用潛力。李新等［18］報道一株分離自山西運(yùn)城鹽湖的耐鹽芽胞桿菌也表現(xiàn)出了很好的拮抗金黃色葡萄球菌效果，說明嗜鹽菌在抗菌活性藥物篩選方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

本研究分離得到的嗜鹽菌N522菌株產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對溫度有較強(qiáng)的耐受性，發(fā)酵上清液經(jīng)90℃高溫處理90 min后仍能保持約55%的抗菌活性。這表明菌株N522的抗菌活性物質(zhì)在食品防腐領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。分析認(rèn)為，熱穩(wěn)定性好的原因在于菌株N522分離自廣東徐聞鹽場，該地處為亞熱帶氣候，環(huán)境溫度高，長期的進(jìn)化選擇使菌株的代謝產(chǎn)物具備耐受高溫能力。硫酸鹽鹽析實驗和蛋白酶酶解實驗表明，菌株N522產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)為多肽類物質(zhì)，抗菌物質(zhì)的分子量研究結(jié)果也驗證了這一結(jié)論。菌株N522產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在pH中性范圍內(nèi)活性最強(qiáng)，在酸性條件下抗菌活性下降明顯，而堿性活性對其影響不大。并且，本研究對菌株N522生長特性考察也顯示出了堿性環(huán)境耐受性。分析認(rèn)為，菌株分離地為鹽堿地，經(jīng)過長期適應(yīng)與馴化，在此生境中菌體生長能力和代謝產(chǎn)物都表現(xiàn)出對堿性相對穩(wěn)定的特性。

生長在高鹽環(huán)境（鹽湖、曬鹽廠、腌制食品）中的嗜鹽菌在長期的選擇進(jìn)化和環(huán)境選擇壓力下，形成了特殊的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制和基因類型，具有產(chǎn)生新穎生物學(xué)活性的代謝產(chǎn)物的潛力。因此，嗜鹽菌被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)新型天然化合物的重要潛在資源。本研究分離得到的達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌N522具有廣譜抗菌活性，是一種發(fā)現(xiàn)新穎生物活性物質(zhì)的潛在資源。以后，還需要對產(chǎn)生抗菌物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，對抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，深入研究其理化性質(zhì)。

4 結(jié)論

從廣東省湛江市徐聞鹽場沉積物中分離得到一株中度嗜鹽菌N522，經(jīng)生理生化和16S rRNA序列分析，鑒定并命名為達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌N522（Halobacillus dabanensis strain N522）。該菌株的最適生長NaCl濃度為100 g/L，最適生長pH為7.0。菌株N522產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對多種細(xì)菌和真菌具有抑制作用，對金黃色葡萄球菌抑制能力最強(qiáng)。經(jīng)硫酸銨鹽析和蛋白酶實驗分析，初步確定菌株N522產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)為多肽類，分子量在3-5 kD之間。并且，菌株N522產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對pH和溫度穩(wěn)定性良好。

［1］陳雷, 王光玉, 卜同, 等. 一株中度嗜鹽細(xì)菌whb45的鑒定及其抗菌與抗腫瘤活性篩選［J］. 微生物學(xué)通報, 2010, 37（1）：85-90.

［2］任培根, 周培瑾. 中度嗜鹽菌的研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)報, 2003, 43（3）：427-431.

［3］李維國, 馬放, 魏利, 等. 中度嗜鹽菌的分離鑒定及對高鹽制革廢水處理的強(qiáng)化［J］. 華南理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2008, 36（3）：89-94.

［4］李維國, 馬放, 蘇俊峰, 等. 一株中度嗜鹽菌的分離鑒定研究［J］. 深圳大學(xué)學(xué)報：理工版, 2008, 25（2）：84-88.

［5］楊丹丹, 黎乾, 黃晶晶, 等. 岱山鹽場可培養(yǎng)嗜鹽菌的多樣性及其產(chǎn)酶活性篩選［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2012, 23（11）：3103-3108.

［6］東秀珠. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2001：1330-3361.

［7］李曉鳳, 李淑英, 聶瑩, 等. 一株拮抗放線菌T151的鑒定及其抑菌活性物質(zhì)分析［J］. 生物技術(shù)通報, 2013（3）, 171-174

［8］劇建格, 于宏偉, 韓軍, 等. 廣譜高效抑菌物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選及鑒定［J］. 微生物學(xué)通報, 2009, 36（5）：689-693.

［9］Spring S, Ludwig W, Marouez M B, et al. Halobacillus gen. nov., with descrpiptions of Halobacillus litoralis sp. nov. and Halobacillus trueperi sp. nov., and transfer of Sporosarcina halophile to Halobacillus halopilus comb. nov［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1996, 46（2）：492-496.

［10］李新, 孫曉, 李悅佳, 等. 中度嗜鹽菌LY9的分離鑒定及其淀粉酶特性研究［J］. 生物技術(shù), 2011, 21（3）：60-63.

［11］Li X, Yu HY, Lin YF. Purification and characterization of an extracellular esterase from a moderately halophilic bacterium, Halobacillussp. strain LY5［J］. African Journal of Biotechnology, 2012, 11（23）：6327-6334.

［12］Yang L, Tan R, Wang Q, et al. Antifungal cyclopeptides from Halobacillus litoralis YS3106 of marine origin［J］. Tetrahedron Letters, 2002, 43（37）：6545-6548.

［13］Liu W Y, Zeng J, Wang L, et al. Halobacillus dabanensis sp. nov. and Halobacillus aidingensis sp. nov., isolated from salt lakes in Xinjiang, China［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2005, 55（5）, 1991-1996.

［14］Kheiralla Z H, Ashour SM, Rushdy AA, et al. Characterization of biosurfactants produced by Halobacillus dabanensis and pontibacillus chungwhensi isolated from oil contaminated mangrove ecosystem in Egypt［J］. Applied Biochemistry and Microbiology, 2013, 49（3）：263-269.

［15］Feng DQ, Zhang B, Lu WD, et al. Protein expression analysis of Halobacillus dabanensis D-8Tsubjected to salt shock［J］. The Journal of Microbiology, 2006, 44（4）：369-374.

［16］趙百鎖. 達(dá)坂喜鹽芽孢桿菌D-8T四氫嘧啶合成基因的克隆、功能表達(dá)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克?。跠］. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

［17］Miller LG, Perdreau-Remington F, Rieg G, et al. Necrotizing fasciitis caused by community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Los Angeles［J］. New England Journal of Medicine, 2005, 352（14）：1445-1453.

［18］李新, 于慧瑛, 杜磊, 等. 一株鹽湖芽胞桿菌LG 的鑒定及其抗金黃色葡萄球菌活性研究［J］. 微生物學(xué)通報, 2015, 42（7）：1294-1300.

（責(zé)任編輯 李楠）

Identification of a Moderately Halophilic Bacterium Halobacillus dabanensis N522 and Study of Its Antimicrobial Activity

NI Zhi-hua1，2ZHANG Yu-ming1ZHOU Yan-fen1，2
（1. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002；2. Research Center of Bioengineering of Hebei Province，Baoding 071002）

The aims of this study are to isolate and identify halophilic bacteria from the sediments in Xuwen Solar Salt Field of Guangdong Province，to investigate the culture conditions of the target strain，and to study the physiochemical properties of active antimicrobial products in the fermentation. Serial dilution and plating method was employed to isolate halophilic bacteria from sediment samples. Then，the isolated strain was identified by physiological and biochemical experiment as well as 16 S rRNA gene sequence analysis. Further，the antimicrobial activity of the target strain fermentation broth was detected using several bacteria，yeasts and fungi by cylinder plate method，and the physicochemical property of antimicrobial materials was preliminarily studied. A halophilic bacterium was isolated and identified as Halobacill us dabanensis strain N522 based on 16S rRNA sequence comparison and physiological and biochemical tests. The strain N522 belonged to moderately halophilic bacterium due to its optimal growth concentration of NaCl was 100 g/L，and pH was 7.0. The fermentation broth of the strain inhibited the growth of several bacteria and fungi. Particularly，the strain showed the strongest antimicrobial activity to Staphylococcus aureus. The experiments of ammonium sulfate salting-out and protease degradation preliminarily revealed that the materials with antimicrobial activity in the broth of strain N522 was peptides，and its molecular weight was between 3 kD to 5 kD. Moreover，the antimicrobial peptides were resistant against pH and temperature. In conclusion，the moderately halophilic bacterium（H. dabanensis N522）isolated from the sediments of the Solar Salt Field may be developed as a potential new source for the novel antimicrobial medicines.

moderately halophilic bacterium；identification；Halobacillus dabanensis；antimicrobial activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.021

2015-08-20

保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃（15ZN001），河北省教育廳資助科研項目（QN2015174，z2012206），河北大學(xué)中西部提升綜合實力專項資金

倪志華，碩士，講師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：nizhihua@hbu.edu.cn

張玉明，博士，講師，研究方向：生物化工，應(yīng)用微生物學(xué)；E-mail：zhangyuming@hbu.edu.cn