正常培養(yǎng)條件下綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂從中期I至中期III的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程

李欣欣 白春玲 魏著英 李光鵬

（內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021）

正常培養(yǎng)條件下綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂從中期I至中期III的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程

李欣欣 白春玲 魏著英 李光鵬

（內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021）

以綿羊卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法研究其染色體和紡錘體微管及微絲在體外成熟、孤雌激活過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明：（1）紡錘體的形態(tài)由中期的桶形，變成早后期的圓柱形及后期和末期細(xì)長(zhǎng)而扁平的三角錐形，與椎體底面連接的染色質(zhì)將來(lái)進(jìn)入極體并最終被排出。（2）染色體形態(tài)從中期單個(gè)的清晰可見(jiàn)的狀態(tài)，變?yōu)楹笃诤湍┢谀s的染色質(zhì)狀態(tài)，隨后在下一個(gè)中期再次呈現(xiàn)出清晰可見(jiàn)的形態(tài)。（3）第一次減數(shù)分裂中期（MI）紡錘體比第二次減數(shù)分裂中期（MII）和第三次減數(shù)分裂中期（MIII）大，但MII期紡錘體形態(tài)比MI期更接近桶形。（4）幾乎所有組成紡錘體的微管和微絲都被分配到極體中。

減數(shù)分裂；微管；微絲；紡錘體；卵母細(xì)胞；綿羊

哺乳動(dòng)物配子形成的減數(shù)分裂過(guò)程，染色體只復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，使配子染色體數(shù)目減半，從而保證了受精后物種染色體數(shù)目的恒定。前減數(shù)分裂間期（Pre-meiotic interphase）是減數(shù)分裂前的間期，主要為減數(shù)分裂進(jìn)行物質(zhì)準(zhǔn)備，包括DNA的復(fù)制、相關(guān)蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞分裂相關(guān)因子的裝配。在前減數(shù)分裂間期之后有兩次連續(xù)的減數(shù)分裂過(guò)程。第一次減數(shù)分裂后，染色體數(shù)目減半，第二次減數(shù)分裂則類(lèi)似于同物種的有絲分裂［1］。兩次連續(xù)的減數(shù)分裂，核是均等分裂的。對(duì)于雄性配子而言，胞質(zhì)是均等分裂的，但是在雌性配子中，胞質(zhì)呈不對(duì)稱分裂方式。一個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂形成一個(gè)稍大的卵母細(xì)胞和2-3個(gè)非常小的極體。細(xì)胞的不對(duì)稱分裂一般發(fā)生在可以產(chǎn)生不同命運(yùn)子細(xì)胞的體細(xì)胞中，相應(yīng)地，其產(chǎn)生的子細(xì)胞大小也存在一定差異［2］。目前研究表明，Par蛋白和G蛋白信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的不對(duì)稱分裂、紡錘體的不對(duì)稱性和微管的動(dòng)態(tài)變化［2-4］。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中，幾乎所有的胞質(zhì)都被分配到次級(jí)卵母細(xì)胞中，只有少量胞質(zhì)進(jìn)入極體。通常情況下，排出第一極體（Pb1）是完成第一次減數(shù)分裂（MI）的標(biāo)志，隨后卵母細(xì)胞將停滯在第二次減數(shù)分裂中期（MII）。MII期卵母細(xì)胞的激活與受精相關(guān)。如果沒(méi)有受精，老化的卵母細(xì)胞會(huì)在胞內(nèi)模擬受精的過(guò)程，增加胞內(nèi)鈣離子濃度，從MII期恢復(fù)。在一些哺乳動(dòng)物中，如小鼠、倉(cāng)鼠、大鼠，這種“部分激活”的卵母細(xì)胞無(wú)法進(jìn)一步發(fā)育，只能停滯于一個(gè)新的中期樣階段（MIII）［5］。綿羊卵母細(xì)胞在孤雌激活后，停滯于MII期的卵母細(xì)胞進(jìn)入第二次減數(shù)分裂并排出第二極體（Pb2），隨后這些卵母細(xì)胞的染色體也要經(jīng)歷一個(gè)與前兩個(gè)中期相似的排列方式，因此將這一階段也稱為MIII。細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化在染色體的凝集、同源染色體和姐妹染色體單體的分離、核物質(zhì)向皮質(zhì)區(qū)的運(yùn)輸、Pb1和Pb2的排出、細(xì)胞器的運(yùn)輸和重新定位都具有重要的作用。關(guān)于低等脊椎動(dòng)物微管和微絲動(dòng)態(tài)變化的研究已經(jīng)非常廣泛，如非洲爪蟾［6-9］和果蠅［7，10］。研究結(jié)果表明，紡錘體是一種呈動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，它的形成和形態(tài)變化主要依賴于微管和微絲的活動(dòng)及染色體和微管相關(guān)的動(dòng)力蛋白的作用［8，11，12］。有關(guān)于哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂的研究多集中于嚙齒類(lèi)，特別是小鼠［13-17］，在豬［18-21］、馬［22，23］和牛［24，25］等家畜動(dòng)物上的研究非常有限。這些研究揭示嚙齒類(lèi)動(dòng)物在卵母細(xì)胞成熟和受精時(shí)細(xì)胞骨架的功能是非典型的［21，26］。牛卵母細(xì)胞微管組織和構(gòu)成的機(jī)制與小鼠不同，但與蛙等低等脊椎動(dòng)物更為相似［27，28］。

本研究系統(tǒng)分析綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中紡錘體形成和形態(tài)變化，并對(duì)染色體的排列和分離及其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行細(xì)致的觀察，同時(shí)研究MII期染色體和極體與微管和微絲之間的聯(lián)系。此外對(duì)紡錘體形成、染色體分離、極體排出和卵母細(xì)胞不對(duì)稱分裂的機(jī)制也進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

除特別提到化學(xué)試劑，其余均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟 綿羊卵巢取自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)，置于生理鹽水中帶回實(shí)驗(yàn)室。生理鹽水清洗3遍后，在含采卵液（M199 + 2.2 g/L NaHCO3+ 10 mmol/L Hepes + 5 IU/mL肝素+ 1%FBS）的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀片割取卵巢表面2-8 mm卵泡內(nèi)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。選取胞質(zhì)均勻、卵丘細(xì)胞完整的卵母細(xì)胞在四孔板中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，成熟培養(yǎng)液為M199 + 10% OES + 0.01 g/mL E2+ 0.01 IU/mL FSH + 1 IU/mL LH + 2 mmol/L丙酮酸鈉。按50枚/0.5 mL成熟培養(yǎng)液培養(yǎng)卵母細(xì)胞，培養(yǎng)條件為38.5℃、100%濕度和5% CO2的氣相。

1.2.2 微管和微絲的免疫熒光染色 經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞用PBS（-）+0.3% BSA洗3遍，PBS（-）+ 4%多聚甲醛+0.2% TritonX-100室溫固定通透1 h，然后使用PBS（-）+3% BSA室溫封閉1-2 h。微管免疫熒光染色：封閉后的卵母細(xì)胞在驢抗小鼠α-Tubulin單克隆抗體（用PBS（-）+0.3% BSA 1∶500稀釋）中4℃孵育過(guò)夜。PBS（-）+0.3% BSA中洗3遍，在FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（Upstate）中室溫孵育1 h，二抗稀釋比例為1∶500。PBS（-）+0.3% BSA洗3次，用10 μg/mL的PI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，封片后，激光共聚焦觀察。微絲染色：卵母細(xì)胞固定通透后，放入用PBS（-）+0.3% BSA以1∶300稀釋的FITC-鬼筆環(huán)肽中，37℃孵育1 h，PBS（-）+0.3% BSA洗3次，經(jīng)PI染核后封片觀察。研究中每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每次重復(fù)設(shè)備都設(shè)置相同的參數(shù)，圖片分析采用OLYMPAS圖像分析軟件進(jìn)行。

核相的區(qū)分。GV：染色質(zhì)呈絲狀散亂分布。MI：染色體排列在赤道板上。AI：同源染色體彼此開(kāi)始分離，紡錘體拉長(zhǎng)。TI：同源染色體已經(jīng)分離，染色質(zhì)凝縮在一起。MII：染色體再一次排列在赤道板上，并形成Pb1，微管不與第二次減數(shù)分裂中期染色體相連。AII：同源染色體開(kāi)始再次分離，紡錘體被拉長(zhǎng)。TII：兩部分染色體分離，并且具有明顯的Pb1。MIII：染色體再次排列在赤道板上形成紡錘體，并且具有Pb1和Pb2。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟不同時(shí)間Pb1的排出率 將體外成熟14、16、17、18、20、24和26 h的綿羊卵母細(xì)胞，在0.1%透明質(zhì)酸酶中渦旋震蕩去除卵丘細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)綿羊卵母細(xì)胞成熟不同時(shí)間Pb1的 排出率。

1.2.3.2 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟不同時(shí)間紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化 1.2.3.1的結(jié)果表明，在成熟14 h時(shí)就有卵母細(xì)胞排出Pb1。因此，為了精確的確定核的狀態(tài)和分析紡錘體和染色體在減數(shù)分裂中的動(dòng)態(tài)變化，將體外成熟后0、2、4、6、8、10、12、14、16、17、18、20、24和26 h的卵母細(xì)胞分別固定，經(jīng)微管和微絲及染色體的免疫熒光染色，觀察紡錘體和染色體的形態(tài)。其中未排出Pb1的卵母細(xì)胞也分別進(jìn)行固定。核相通過(guò)紡錘體和染色體的形態(tài)進(jìn)行評(píng)估。

1.2.3.3 綿羊卵母細(xì)胞孤雌激活后不同時(shí)間紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化 1.2.3.2的結(jié)果揭示了紡錘體和染色體在綿羊卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂中所具有的一些獨(dú)特的變化，本實(shí)驗(yàn)主要是研究紡錘體和染色體在綿羊卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。成熟25 h后，挑選具有Pb1的卵母細(xì)胞用5 μmol/L離子霉素處理5 min，洗3次，10 μg/mL CHX（CR1aa溶解）處理4 h，再洗3次后于CR1aa發(fā)育液中培養(yǎng)。經(jīng)微管和微絲及染色體的免疫熒光染色，觀察激活后0.5、1、3、4、6和8 h紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的減數(shù)分裂進(jìn)程

本研究共檢測(cè)了231枚綿羊卵母細(xì)胞，其中排出Pb1的卵母細(xì)胞有186枚（表1），成熟率為80.5%。成熟培養(yǎng)0-4 h，多數(shù)的卵母細(xì)胞都處于GV期（圖1-A）。體外培養(yǎng)4 h開(kāi)始生發(fā)泡破裂（GVBD），8 h時(shí)幾乎所有的卵母細(xì)胞都已發(fā)生GVBD。綿羊卵母細(xì)胞排出Pb1是不對(duì)稱分裂的，開(kāi)始觀察到Pb1是體外成熟14 h，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，Pb1的排出率逐漸升高，到26 h達(dá)到77.0%。其中體外成 熟14、16、17、18、20、24和26 h，Pb1的 排出率分別為8.9%、13.3%、20.2%、29.0%、45.2%、75.3%和77.0%。通過(guò)分析成熟不同時(shí)間排出第一極體的綿羊卵母細(xì)胞的核相發(fā)現(xiàn)，在成熟14 h，約90%的卵母細(xì)胞處于AI期（圖1-E）；到16 h時(shí)，約70%的卵母細(xì)胞處于AI期，其余的卵母細(xì)胞則到達(dá)TI期（圖1-G），但沒(méi)有卵母細(xì)胞進(jìn)入MII期（圖1-L）；體外培養(yǎng)17 h，只有3.8%的卵母細(xì)胞進(jìn)入MII期；24 h后，80%左右的卵母細(xì)胞到達(dá)MII期（圖1-L）。沒(méi)有排出Pb1的卵母細(xì)胞幾乎都停滯在MI期（圖1-H）。

表1 排出第一極體的綿羊卵母細(xì)胞成熟不同時(shí)間所處核相

2.2 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟不同時(shí)期染色體和微管的動(dòng)態(tài)變化

將體外成熟0、2、4、6、8、10、12、14、16、17、18、20、24和26 h的卵母細(xì)胞分別進(jìn)行免疫熒光染色觀察其微管的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，在0-4 h的GV期卵母細(xì)胞核內(nèi)，染色質(zhì)呈絲狀，并未觀察到微管的特異性著色（圖1-A）。當(dāng)卵母細(xì)胞到達(dá)PreMI期，染色質(zhì)部分凝縮，此時(shí)在染色質(zhì)周?chē)軌蚯逦吹教禺愋灾奈⒐埽▓D1-B）。 在MI期，染色體整齊的排列在赤道板上，與微管形成桶形的紡錘體結(jié)構(gòu)（圖1-C）。AI期早期時(shí)，同源染色體開(kāi)始從中期板向兩極移動(dòng)（圖1-D）。到達(dá)AI期后，同源染色體分離形成兩部分，而此時(shí)微管位于分開(kāi)的兩部分染色體中間（圖1-E）。A I-TI期時(shí)，紡錘體變成細(xì)長(zhǎng)的三角錐形，此時(shí)與錐體底面連接的那一部分染色體將會(huì)被排出（圖1-F、G）；在這一時(shí)期，有的卵母細(xì)胞還存在三極紡錘體結(jié)構(gòu)（圖1-I、J）。TI末期幾乎所有微管都連接在之后要形成Pb1的染色體上，隨染色體被一起排到卵母細(xì)胞外。典型的MII期染色體排列在赤道板上，形成MII期紡錘體，此時(shí)的染色體明顯小于MI期，Pb1被排出（圖1-H、K、L）。圖1-F-H可以清晰的顯示出微管跟隨將要形成Pb1的染色體進(jìn)行動(dòng)態(tài)遷移的過(guò)程，微管與染色體一起被分配到Pb1中，并最終被排出。

圖1 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟不同時(shí)期染色體和微管動(dòng)態(tài)變化（100×）

2.3 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟不同時(shí)期微絲的動(dòng)態(tài)變化

GV期到AI期，微絲主要分布于卵膜下的皮質(zhì)區(qū)（圖2-A、B、C），此時(shí)并未觀察到其與染色體之間的聯(lián)系。到達(dá)AI期后，除了在卵膜下有微絲分布外，在分開(kāi)的同源染色體周?chē)梢郧逦乜吹轿⒔z的聚集（圖2-D）。AI-TI期時(shí)，位于分開(kāi)的同源染色體周?chē)拇蟛糠治⒔z向之后要形成極體染色體的一方遷移（圖2-E）。到MII時(shí)，極體染色體連同大部分的微絲被排出卵母細(xì)胞外。Pb1形成后，可以觀察到形成第一次減數(shù)分裂紡錘體的大部分微管和微絲位于極體中。觀察還發(fā)現(xiàn)，有些TI-MII期的卵母細(xì)胞，同源染色體之間并無(wú)微管與微絲的著色，但在將來(lái)要被排出形成Pb1的染色體周?chē)鷧s有大量的微管和微絲存在。隨后微管和微絲重新聚集在同源染色體周?chē)?，并形成MII期紡錘體。

圖2 綿羊卵母細(xì)胞體外成熟不同時(shí)期染色體和微絲的動(dòng)態(tài)變化（100×）

2.4 綿羊卵母細(xì)胞孤雌激活后不同時(shí)間紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化

綿羊卵母細(xì)胞MII期到MIII期紡錘體的動(dòng)態(tài)變化與MI期至MII期高度相似。卵母細(xì)胞經(jīng)25 h體外成熟后進(jìn)入MII期（圖3-A），之后被孤雌激活。分析MII期卵母細(xì)胞孤雌激活后進(jìn)程（表2）可知，激活后0.5 h，68.0%的卵母細(xì)胞還是位于MII期，只有28.0%的卵母細(xì)胞到達(dá)AII期（圖3-B、C），AII期的卵母細(xì)胞染色體開(kāi)始從赤道板向兩極分離，分開(kāi)的兩部分染色體中間有大量的微管相連。激活后1 h，絕大部分卵母細(xì)胞（73.9%）位于AII期，只有4.3%卵母細(xì)胞到達(dá)TII期（圖3-D-G）。激活后2 h，55.6%的卵母細(xì)胞還是位于AII期，22.2%的卵母細(xì)胞到達(dá)TII期，開(kāi)始有少量的卵母細(xì)胞（5.6%）到達(dá)MIII期（圖3-H、I）。當(dāng)卵母細(xì)胞到達(dá)早TII期，紡錘體變成細(xì)長(zhǎng)的三角錐形（圖3-D、E），此時(shí)與紡錘體底面連接的那部分染色體之后會(huì)被排出卵母細(xì)胞，成為Pb2染色體。隨著卵母細(xì)胞到達(dá)晚TII期，形成中期染色體質(zhì)的一方并沒(méi)有微管相連，幾乎所有的微管都跟隨要形成Pb2的染色體排出卵母細(xì)胞（圖3-F、G），激活后3 h，56.0%的卵母細(xì)胞到達(dá)TII期，20.0%的卵母細(xì)胞到達(dá)MIII期，有4.0%的卵母細(xì)胞形成原核。激活后4 h，半數(shù)的卵母細(xì)胞（58.6%）到達(dá)MIII期，17.2%的卵母細(xì)胞形成原核。MIII期的染色體并不像MI和MII期的染色體都整齊的排列在赤道板上，而是有部分染色體仍在赤道板之外（圖3-H、I）。此時(shí)的紡錘體比MII期紡錘體小，而且Pb2也小于Pb1（圖3-H、I）。激活后8 h，絕大部分的卵母細(xì)胞（89.7%）都已形成原核。

表2 MII期卵母細(xì)胞孤雌激活后進(jìn)程

3 討論

已有研究表明，微管和微絲在紡錘體的形成、染色體的排列及分離、極體的排出和胞質(zhì)分裂過(guò)程中起著重要作用［15，17，22-24，29］，但其相關(guān)的機(jī)制還不是十分明確。有關(guān)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中紡錘體的形成、極體的排放等現(xiàn)象尚未見(jiàn)到系統(tǒng)的觀察報(bào)道，本研究以綿羊卵母細(xì)胞為模型，觀察和描述了減數(shù)分裂及孤雌激活過(guò)程中構(gòu)成紡錘體主要成分微管和微絲的動(dòng)態(tài)變化及其在綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂MI-MIII期可能的命運(yùn)。研究結(jié)果表明，紡錘體從MI和MII期的桶形變成早AI和AII期的圓柱形，然后變成TI和TII期細(xì)長(zhǎng)的三角錐形。與小鼠典型的桶形染色體相比［13-15，17，30］，綿羊MI的紡錘體直徑明顯要大，而且具有更大的平的兩極，此時(shí)組成紡錘體的微管只覆蓋于整齊排列的染色體表面，并不發(fā)出長(zhǎng)的微管束到兩級(jí)。在MI和MII紡錘體中，染色體整齊的排列在赤道板上。MIII紡錘體比MII期小，染色體并不嚴(yán)格地排列在赤道板上，有些染色體甚至在紡錘體之外，而且排列的方向似乎也是隨機(jī)的。研究顯示紡錘體的形狀和大小也受環(huán)境因素影響，體外成熟的小鼠卵母細(xì)胞通常具有更大的紡錘體和更平的兩極［17］。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成紡錘體的大部分微管和微絲都隨著將要形成Pb1和Pb2的染色體移動(dòng)，并隨著這些染色體被排出卵母細(xì)胞外。中期的染色體是單個(gè)分明的，容易觀察。在后期的較晚階段，直到卵母細(xì)胞到達(dá)下一個(gè)中期之前，染色體去凝縮，呈現(xiàn)團(tuán)狀的染色質(zhì)狀態(tài)。排出Pb1和Pb2以后，不清晰的中期染色體又開(kāi)始變得清晰可見(jiàn)，可以分辨出單個(gè)的染色體，此時(shí)極體的染色質(zhì)仍然凝縮成團(tuán)，并且其周?chē)奂罅课⒐?，此結(jié)果不同于小鼠和豬的研究結(jié)果［19-21］，但與牛的研究結(jié)果一致［25］。綿羊卵母細(xì)胞到達(dá)早AI期時(shí)，要進(jìn)入Pb1的染色質(zhì)隨著卵膜凸起被排出。體外成熟12 h便可觀察到卵膜上的這種凸起，并且組裝成類(lèi)似Pb1的結(jié)構(gòu)。在17 h前的AI和TI期，多數(shù)的卵母細(xì)胞都具有這種結(jié)構(gòu)。幾乎所有具有Pb1凸起的卵母細(xì)胞，在20 h時(shí)都能到達(dá)MII期。胞質(zhì)分裂完成后，Pb1從卵母細(xì)胞分離，成為一個(gè)獨(dú)立的小細(xì)胞，主要含有微管、微絲和少量胞質(zhì)。事實(shí)表明是否具有Pb1并不是卵母細(xì)胞到達(dá)MII期所必須的。

圖3 綿羊卵母細(xì)胞MII-MIII期紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化（100×）

微絲對(duì)于小鼠和豬的卵母細(xì)胞核遷移和極體的排放非常重要［21，30-32］。微絲的出現(xiàn)與分布也隨著減數(shù)分裂呈動(dòng)態(tài)變化，而且隨著極體的排出，絕大多數(shù)微絲也被排出。這一現(xiàn)象與我們之前在牛卵母細(xì)胞中的觀察結(jié)果一致［25］。處于GV、GVBD、PreMI和MI期的綿羊卵母細(xì)胞，微絲分布在卵膜下的皮質(zhì)區(qū)，直到早AI期才出現(xiàn)在染色質(zhì)區(qū)。微絲從AI到TI期變得非常明顯。隨著紡錘體微管的不斷變化，微絲向兩團(tuán)染色中將來(lái)形成Pb1的一方移動(dòng)。隨著Pb1的排出，幾乎所有的微絲都隨著極體染色質(zhì)排出。在第二次減數(shù)分裂中，Pb2的排出也存在相似的現(xiàn)象。但在豬卵母細(xì)胞成熟的過(guò)程中，微絲聚集在MI期紡錘體所在的區(qū)域，這可能是物種差異所致［21］。

根據(jù)在新桿狀線蟲(chóng)上的報(bào)道，微管和微絲在不對(duì)稱性分裂的建立和維持上具有重要作用［33，34］。因此，我們認(rèn)為紡錘體微管和微絲主要參與卵母細(xì)胞的不對(duì)稱分裂。在這種不對(duì)稱分裂中，紡錘體及其相關(guān)成分令染色體均衡分布，并將其他分子不對(duì)稱地分布到卵母細(xì)胞和極體中。次級(jí)卵母細(xì)胞的體積在第二次減數(shù)分裂完成后似乎沒(méi)有明顯的改變，其中含有早期胚胎發(fā)育所需的全部蛋白質(zhì)和分子，極體則主要含有微管和微絲及少量的胞質(zhì)。

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞，除小鼠外皆無(wú)中心體。小鼠多數(shù)的微管組織中心（MTOC）或胞質(zhì)中心粒和具有微管成核活性的中心粒外周物質(zhì)都在胞質(zhì)中。小鼠減數(shù)分裂紡錘體極的形成與MTOC有關(guān)［15，16，35，36］。然而家畜動(dòng)物因?yàn)槿狈χ行牧＃湮⒐艿慕M裝并不是由MTOC組織的［25］，因此推測(cè)，其紡錘體的形成和染色體的分離可能與MTOC無(wú)關(guān)。綿羊的卵母細(xì)胞紡錘體與牛類(lèi)似，都是典型的無(wú)星紡錘體，染色體可能在紡錘體的組裝中起非常關(guān)鍵的作用。微管以隨機(jī)的方式圍繞染色體，其可能在染色體動(dòng)力因子或聯(lián)合微管相關(guān)動(dòng)力因子的作用下，被分類(lèi)捆扎成一種反平行且雙極的排列方式［8，37］。我們的研究結(jié)果表明，染色體的形態(tài)從中期可見(jiàn)的單個(gè)的形態(tài)變?yōu)楹笃诤湍┢陔s亂無(wú)序的狀態(tài)，之后在下一個(gè)中期時(shí)段又重新變得清晰可見(jiàn)。同時(shí)，紡錘體微管也從桶形變成圓柱形，再到錐形。位于分開(kāi)的同源染色體和姐妹染色單體之間的大部分微管和圍繞其周?chē)拇蟛糠治⒔z都跟隨極體染色體體進(jìn)行遷移，并最終分配到極體中。紡錘體形成和染色體分離似乎是依賴染色體完成的。

4 結(jié)論

本研究系統(tǒng)的分析了正常培養(yǎng)條件下綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂從中期I至中期III的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。結(jié)果顯示：（1）紡錘體的形態(tài)由中期的桶形，變成早后期的圓柱形及后期和末期細(xì)長(zhǎng)而扁平的三角錐形，連接在錐體底面的染色質(zhì)將來(lái)進(jìn)入極體并最終被排出。（2）染色體形態(tài)從中期單個(gè)可見(jiàn)的狀態(tài)，變?yōu)楹笃诤湍┢谀s的染色質(zhì)狀態(tài)，隨后在下一個(gè)中期再次呈現(xiàn)出單個(gè)而清晰可見(jiàn)的形態(tài)。（3）第一次減數(shù)分裂中期（MI）紡錘體比第二次減數(shù)分裂中期（MII）和第三次減數(shù)分裂中期（MIII）大，MII期紡錘體形態(tài)比MI期更接近桶形。（4）幾乎所有組成紡錘體的微管和微絲都被分配到極體中。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Dynamic Changes of Sheep Oocyte Meiosis from Metaphase I to Metaphase III Matured in vitro

LI Xin-xin BAI Chun-ling WEI Zhu-ying LI Guang-peng
（The Key Laboratory of National Education Ministry for Mammalian Reproductive Biology and Biotechnology，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

Meiosis is a division mode in diploid organism to produce haploid gametes，which is the special mechanism of ensuring the chromosome’s number of a species after fertilization to be constant. The key step in the meiotic division is to separate the homologous chromosome and sister chromatids correctly，the dynamic changes of the cytoskeleton，in particular microtubules（MTs）and microfilaments（MFs），play critical roles in this process. In this study，the dynamic changes of chromosomes and spindle MTs and MFs during the maturing and parthenogenetic activation of sheep oocyte cells were studied by immunohistochemistry method. The results showed that：1）The morphology of spindle changed from barrel-shaped at metaphase stage to cylinder-shaped at early anaphase，and then to long，thin coneshaped at late anaphase and telophase. Chromatin connected with the floor of the cone became the polar bodies and expelled. 2）Chromosome morphology changed from visible individual at metaphase to condensed chromatin during anaphase and telophase stages，and then backed to visible individual chromosomes at the next metaphase. 3）The size of MI spindle was larger than that of the MII spindle and MIII. MII spindle，however，was more barrel-shaped than the MI spindle. 4）Almost all of the MTs and MFs composing the spindles were partitioned into the polar bodies.

meiosis；microtubule；microfilament；spindle；oocyte；sheep

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.030

2015-07-22

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2012CB722306），內(nèi)蒙古科技項(xiàng)目（20130902，20110401）

李欣欣，女，博士，研究方向：哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)；E-mail：xinxin_816@126.com

白春玲，女，博士，研究方向：哺乳動(dòng)物生殖生物學(xué)；E-mail：chunling1980_0@163.com