施氏假單胞菌PS59產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件及脂肪酶洗滌性能優(yōu)化

劉金輝李曉路姜巖王海寬

（1. 重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備工程研究中心，重慶 400060；2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

施氏假單胞菌PS59產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件及脂肪酶洗滌性能優(yōu)化

劉金輝1，2李曉路2姜巖1王海寬2

（1. 重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備工程研究中心，重慶 400060；2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

旨在對(duì)施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）PS59產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因子優(yōu)化及響應(yīng)面分析，選擇出最佳的碳氮源，并分別對(duì)加酶量、洗滌時(shí)間、洗滌溫度、洗滌pH和表面活性劑添加量對(duì)脂肪酶洗滌效果的影響進(jìn)行評(píng)估，確定各個(gè)因素最佳值。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)施氏假單胞菌產(chǎn)脂肪酶的最佳碳氮源分別為蔗糖和大豆蛋白胨。優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方為（g/L）：大豆蛋白胨 22.39 g，蔗糖 10 g，K2HPO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，無(wú)水CaCl20.05 g，橄欖油 8.1 g，pH 8.1，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)36 h獲得平均脂肪酶產(chǎn)量為36.12±1.32 U/mL，相對(duì)于起始酶活15.65±4.81 U/mL，產(chǎn)量提高了1.3倍。確定最佳洗滌效果加酶量為100 U，最佳洗滌溫度為25℃，最佳洗滌時(shí)間為25 min，洗滌pH對(duì)該脂肪酶洗滌效果影響不大。在最佳洗滌條件下，加酶洗滌液的洗滌效率可以提高30%-40%。

施氏假單胞菌；脂肪酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；洗滌性能優(yōu)化

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3），是一類(lèi)廣泛存在于微生物及動(dòng)植細(xì)胞中的特殊酯鍵水解酶，可以催化水解甘油三酯生成甘油二酯、單甘酯、甘油及游離脂肪酸［1］。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)資料初步統(tǒng)計(jì)，細(xì)菌有28個(gè)屬，放線(xiàn)菌有4個(gè)屬，酵母菌有10個(gè)屬，其他真菌有23個(gè)屬，共計(jì)達(dá)65個(gè)屬的微生物能產(chǎn)生脂肪酶［2］。由于微生物脂肪酶具有較大的商業(yè)潛在的需求，微生物脂肪酶的相關(guān)研究也逐漸增加［3］。

目前堿性脂肪酶主要用于洗滌劑行業(yè)，洗滌劑中添加適量的堿性脂肪酶不僅可以明顯提高洗滌劑的洗滌性能，而且對(duì)衣物保養(yǎng)，抗再污染等方面有顯著效果，加脂肪酶洗滌劑可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)制劑應(yīng)用可以降低自然承受能力，減少環(huán)境污染，因此篩選出高產(chǎn)高洗滌能力的脂肪酶菌株，是現(xiàn)如今迫切的需求。從微生物資源中篩選一株高洗滌活性脂肪酶的產(chǎn)生菌株是研究高洗滌活性脂肪酶的前提條件，對(duì)其生長(zhǎng)特性和酶學(xué)特性進(jìn)行研究，拓寬高洗滌活性脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域，對(duì)其工業(yè)化開(kāi)發(fā)具有重要的意義。而細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶受多種條件影響，這些條件能夠促進(jìn)或抑制脂肪酶的產(chǎn)量。為了達(dá)到最大脂肪酶產(chǎn)量，除pH、溫度、接種時(shí)間、接種量、轉(zhuǎn)速等多種物理因素外［4，5］，各個(gè)生化因素也必須優(yōu)化。而洗滌劑中酶的洗滌性能也取決于各種因素，如洗滌劑pH值、離子強(qiáng)度、清洗溫度、洗滌劑組成、洗滌程序和洗滌水硬度等［6］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)施氏假單胞菌產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因子優(yōu)化，選擇出最佳的碳氮源。選用N=20的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，考察各個(gè)因素的主效應(yīng)和交互作用。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，由Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定的3個(gè)主要影響因素各取三水平，設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，最終確定最佳培養(yǎng)基配方，并對(duì)施氏假單胞菌PS59脂肪酶的洗滌性能進(jìn)行評(píng)估，確定加酶量、洗滌時(shí)間、洗滌溫度、洗滌pH和表面活性劑添加量等影響因素的最佳值，旨在為該菌株產(chǎn)脂肪酶的大規(guī)模培養(yǎng)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 實(shí)驗(yàn)室自篩菌種，經(jīng)鑒定為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri），編號(hào)PS59。

1.1.2 培養(yǎng)基 初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20，蔗糖 10，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.5，無(wú)水CaCl2，0.05，大豆油 5，pH 8.5。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨 22.39，蔗糖 10，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.5，無(wú)水CaCl2，0.05，橄欖油 8.1，pH8.1。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖、糊精、K2HPO4、Tween-80購(gòu)于天津市北方化玻購(gòu)銷(xiāo)中心；玉米淀粉、可溶性淀粉、麥芽糖、大豆蛋白胨尿素購(gòu)于天津北方天醫(yī)化學(xué)制劑廠(chǎng)；蔗糖、大豆餅粉、干酪素、CaCl2購(gòu)于天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠(chǎng)；蛋白胨購(gòu)于天津科瑞思化學(xué)試劑公司；酵母浸出粉、MgSO4·7H2O購(gòu)于天津市化學(xué)試劑一廠(chǎng)；（NH4）2SO4購(gòu)于北京光復(fù)精細(xì)化工有限公司；橄欖油購(gòu)于西班牙Moreno公司；乙酸鈉，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑；大豆油購(gòu)于天津市中英保健食品有限公司。所用試劑均為分析純。

1.1.4 儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；HHB11-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）；GL20A型高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科技儀器廠(chǎng)）；HS-1300-V型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；AB204-S型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海公司）；CHB型普通光學(xué)顯微鏡、顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海公司）；UV-Vis分光光度計(jì)（天德科技有限公司）；SP-2012UV型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；HYG-II型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜（上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 施氏假單胞菌菌種制備 無(wú)菌條件下從斜面接一環(huán)施氏假單胞菌菌體至含30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃條件下，置于180 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)6 h，作為液體種子備用。

1.2.2 施氏假單胞菌產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.2.1 最佳碳氮源選擇 根據(jù)初始培養(yǎng)基選擇不同的碳氮源進(jìn)行單因子優(yōu)化，選擇出最佳的碳氮源，碳源如蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、糊精、玉米淀粉、乙酸鈉，氮源如大豆蛋白胨、黃豆餅粉、干酪素、酵母浸出粉、尿素、硫酸銨、蛋白胨，利用這些碳氮源代替初始培養(yǎng)基中的碳氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定酶活選擇最佳碳氮源。

1.2.2.2 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì) 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選取影響發(fā)酵培養(yǎng)的可能因素，包括大豆蛋白胨、蔗糖、MgSO4、K2HPO4、CaCl2、橄欖油等10個(gè)因素進(jìn)行全面考察，選用N=20的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，考察各個(gè)因素的主效應(yīng)和交互作用，確定重要影響因素。

1.2.2.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，由Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定的3個(gè)主要影響因素各取三水平，設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。

1.2.3 分光光度法測(cè)脂肪酶活力 A液：濃度為3 mg/mL棕櫚酸對(duì)硝基酚酯的異丙醇溶液。B液：1% TritonX-100的磷酸緩沖液（100 mmol/L，pH8.0）。

底物溶液（1.9 mL）由A液和B液按1∶9比例混合，并于30℃預(yù)處理5 min后加入0.1 mL稀釋到一定濃度的酶液反應(yīng)15 min，于-20℃終止7 min。之后取200 μL反應(yīng)液加至96孔板中，利用酶標(biāo)儀在400 nm下測(cè)定溶液吸光度（以加失活酶的溶液作為對(duì)照）。該法單位酶活定義為每分鐘釋放1 μmol/min對(duì)硝基酚所需酶量。

1.2.4 洗滌試驗(yàn)方法 準(zhǔn)備10 × 5白色棉布若干，經(jīng)過(guò)沸騰氯仿處理4 h確定所有脂質(zhì)去除。在棉布兩面各加入0.5 mL橄欖油丙酮溶液（100 mg/mL）放置15 min晾干。將棉布放入放入裝入100 mL洗滌液的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min保溫1 h。

去污力計(jì)算公式：去污率%=（Wb-Wa）/（Wb-Wc）×100% ，其中，Wa和Wb分別代表棉布滴油前后重量，Wc代表油布洗滌完后重量。

2 結(jié)果

2.1 不同碳氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在碳氮源單因子實(shí)驗(yàn)中，不同類(lèi)型的碳氮源對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響不同。從圖1中可知，有機(jī)碳源對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響要明顯高于無(wú)機(jī)碳源，而有機(jī)碳源蔗糖在培養(yǎng)基中的添加，脂肪酶達(dá)到最大產(chǎn)量為14.3 U/mL，其次添加麥芽糖時(shí)，脂肪酶產(chǎn)量達(dá)12.4 U/mL。圖2可見(jiàn)，有機(jī)氮源大豆蛋白胨能夠顯著的刺激脂肪酶達(dá)到最大酶活為18.7 U/mL。最后，最佳碳氮源選擇分別為蔗糖和大豆蛋白胨。

圖1 不同碳源（10 g/L）對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響

圖2 不同氮源（20 g/L）對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響

2.2 不同底物對(duì)產(chǎn)酶的影響

在起始培養(yǎng)基中以不同的油脂替代起始培養(yǎng)基中的大豆油并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。利用分光光度法測(cè)定酶活，結(jié)果（圖3）顯示，橄欖油作為誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基時(shí)的酶活達(dá)到最佳酶活為21 U/mL。

2.3 Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=20的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)各種培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件（表1）進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各個(gè)因素設(shè)置兩個(gè)水平：-1為低水平，+1為高水平。表1詳細(xì)描述了各影響因素以及其水平值，響應(yīng)值為各實(shí)驗(yàn)所得脂肪酶酶活。

采用回歸分析法去檢測(cè)各個(gè)因素對(duì)脂肪酶產(chǎn)量影響的顯著性（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，在20次實(shí)驗(yàn)中，脂肪酶產(chǎn)量有較大的變化（6.07-19.65 U/mL）。該變化說(shuō)明了培養(yǎng)基優(yōu)化獲得較高脂肪酶產(chǎn)量的重要性。由表1中的t值和P值分析可知大豆蛋白胨、橄欖油和起始pH值對(duì)脂肪酶產(chǎn)量具有最顯著性的影響。

圖3 不同底物（5 mL/L）對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響

表1 PB實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)變量及水平值

2.4 最陡上升法

為了能夠快速的達(dá)到各因素的最佳水平，表3描述了一種最陡上升法，使主要影響因素同時(shí)向響應(yīng)值增大的方向去接近最大脂肪酶產(chǎn)量區(qū)域。針對(duì)PB實(shí)驗(yàn)篩選出的3種影響最顯著因素進(jìn)行最陡上升實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（表3）顯示，1、2、3號(hào)實(shí)驗(yàn)時(shí)，脂肪酶產(chǎn)量逐漸增加并達(dá)到最大值，而4號(hào)實(shí)驗(yàn)脂肪酶產(chǎn)量降低。因此2號(hào)實(shí)驗(yàn)中3因素實(shí)驗(yàn)值接近最大脂肪酶產(chǎn)量區(qū)域。

表2 十因素PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 最陡上升實(shí)驗(yàn)及相應(yīng)的響應(yīng)值

2.5 響應(yīng)面分析法

根據(jù)上述PB實(shí)驗(yàn)和最陡上升實(shí)驗(yàn)確定了對(duì)脂肪酶產(chǎn)量影響顯著因素即大豆蛋白胨（A）、橄欖油（B）、起始pH（C）及其相應(yīng)的相對(duì)較優(yōu)水平值。然后利用Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析法去測(cè)定影響脂肪酶產(chǎn)量的這些因素的最優(yōu)值。利用Desigh-Expert7.0數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生共17組實(shí)驗(yàn)。所有變量中間水平值編碼為0，最高水平和最低水平值分別被編碼為+1和-1，全部實(shí)驗(yàn)計(jì)劃及其實(shí)際值見(jiàn)表2-表4。每組實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值為3組平行試驗(yàn)值的平均值。

采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了3因素3水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（在中間點(diǎn)上包括5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)）用于擬合二次響應(yīng)面，表4詳細(xì)描述了設(shè)計(jì)模型和相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。通過(guò)Design-Expert數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析并建立二次響應(yīng)面回歸模型，二次回歸方程如下：

表4 Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

式中，Y：脂肪酶產(chǎn)量（U/mL），A：大豆蛋白胨（g/L），B：橄欖油（%），C：起始pH。

利用Design-Expert設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)而對(duì)二次響應(yīng)面回歸方程的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性進(jìn)行評(píng)估。由表5可知，模型F值為22.22，失擬度F值為0.23。高F值和不顯著的失擬度證明該預(yù)測(cè)模型擬合度較好。并且模型（0.0002）和失擬度（0.8718）的P值也證明了所獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)也有較好的一致性。該模型的擬合效果也通過(guò)決定系數(shù)（R2）來(lái)測(cè)定。該方程決定系數(shù)R2=0.9662，說(shuō)明約有4.38%不滿(mǎn)足該模型對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的預(yù)測(cè)。該值說(shuō)明了二次響應(yīng)面回歸模型具有較好的精度和預(yù)測(cè)能力。校正決定系數(shù)R2Adj=0.9227和預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2Pre=0.8755也滿(mǎn)足于確保該模型的顯著性的條件。因此利用該模型分析響應(yīng)趨勢(shì)被認(rèn)為是合理的。

表5 脂肪酶產(chǎn)量的擬合二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析

每個(gè)變量由回歸分析計(jì)算所得模型相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表6。該表詳細(xì)描述了所有單項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的回歸系數(shù)。顯著水平設(shè)置為5%。

表6 用于優(yōu)化脂肪酶產(chǎn)量的二次多項(xiàng)式模型的回歸分析結(jié)果

為了更加形象的描述回歸模型中響應(yīng)值和各個(gè)變量不同水平，圖4展示出了脂肪酶產(chǎn)量的響應(yīng)面三維立體圖及其響應(yīng)的等高線(xiàn)圖。每個(gè)圖呈現(xiàn)出兩個(gè)因素（其他因素保持在0水平）對(duì)響應(yīng)值的影響。正如響應(yīng)面三維立體圖所示，每對(duì)變量都具有較好的交互作用。

根據(jù)典型相關(guān)分析，由該模型預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在起始pH、大豆蛋白胨和橄欖油分別設(shè)定為8.1、22.39 g/L和0.81%時(shí)獲得最大脂肪酶產(chǎn)量。脂肪酶產(chǎn)量最大預(yù)測(cè)值為34.89 U/mL。

為了確定優(yōu)化結(jié)果，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵平行3次。獲得平均脂肪酶產(chǎn)量為36.12±1.32 U/mL，與該模型的計(jì)算值基本相符，因而該模型預(yù)測(cè)該菌株發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶是較精確和合理的。并且相對(duì)于起始培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件所獲得的酶活15.65±4.81 U/mL，產(chǎn)量提高了1.3倍。

2.6 脂肪酶洗滌性能優(yōu)化

2.6.1 加酶量對(duì)去污率的影響 通過(guò)改變脂肪酶酶量的添加，來(lái)測(cè)定去污率的變化。結(jié)果（圖5）表明，當(dāng)脂肪酶添加量大于100 U時(shí)，其去污率幾乎保持不變，而加酶量在25-100之間，去污率穩(wěn)定的增加。起始除油速率增加原因在于疏水甘油酯與脂肪酶的水溶液的不斷增加的界面面積。由于滴加在棉布上的定量橄欖油表面積可以認(rèn)為是不變的，因此當(dāng)脂肪酶增加到一定的濃度時(shí)其受限于油水界面而去油率保持不變。因此確定100 U為100 mL洗滌液的最佳添加量。

圖4 大豆蛋白胨含量、橄欖油含量和初始pH值及其交互作用對(duì)脂肪酶產(chǎn)量影響的響應(yīng)面曲線(xiàn)和等高線(xiàn)圖

2.6.2 洗滌溫度對(duì)去污率的影響 洗滌溫度對(duì)加酶洗滌劑去污率的影響很大。從洗滌溫度與去污力的關(guān)系圖中（圖6）得知，只含脂肪酶的BL洗滌液最佳洗滌溫度為20℃，其與該脂肪酶水解反應(yīng)最適溫度一致。而加酶和洗滌劑的BDL洗滌液的去污率在一定的溫度范圍內(nèi)隨溫度的增加而增加。并于25℃去污率達(dá)到最大值。因此確定最佳洗滌溫度為25℃。

2.6.3 洗滌時(shí)間對(duì)去污率的影響 利用4種洗滌液對(duì)污布分別處理15、20、25和30 min。根據(jù)去污率公式計(jì)算出污率，并根據(jù)去污率與時(shí)間關(guān)系繪制柱形圖。由圖7可知，除了僅含緩沖液的B洗滌液，其他3種洗滌液去污率都會(huì)隨時(shí)間的增長(zhǎng)而穩(wěn)定的增加，而洗滌時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)B洗滌液的去污率幾乎沒(méi)有影響。并且，同時(shí)加酶和洗滌劑的洗滌液的去污率在所有時(shí)間都高于其他3種洗滌液。洗滌時(shí)間超過(guò)25 min后，去污率沒(méi)有明顯的提高，確定最佳洗滌時(shí)間為25 min。

圖5 脂肪酶添加量對(duì)去污率的影響

圖6 溫度對(duì)4種不同的洗滌液的洗滌效果影響

圖7 不同的洗滌時(shí)間對(duì)洗滌液洗滌效果的影響

圖8 不同pH對(duì)洗滌效果的影響

2.6.4 洗滌pH對(duì)去污率的影響 根據(jù)不同洗滌液去污率隨pH的變化繪制柱形圖，結(jié)果（圖8）顯示，只含緩沖液的B洗滌液的去污率隨著pH的升高而穩(wěn)定增加。BL洗滌液去污率在pH7-9呈遞增趨勢(shì)而又在pH9-11呈遞減趨勢(shì)，并且在pH9時(shí)達(dá)到最大去污率。其去污效果與pH對(duì)脂肪酶活性影響一致。其在pH7-9之間去污率的增長(zhǎng)原因在于脂肪酶活性的增加，而隨著pH超過(guò)9脂肪酶活性降低從而導(dǎo)致去污率的降低。

2.6.5 SDS及TritonX-100濃 度 對(duì) 去 污 率 的 影響 SDS及非離子型表面活性劑對(duì)去污效率影響試驗(yàn)的結(jié)果表明，在SDS濃度為0.5%時(shí)達(dá)到最大去污率64.05%，洗滌濃度超過(guò)0.5%其去污效果逐漸降低。加酶后的洗滌液隨著TritonX-100濃度的增加在一定濃度范圍內(nèi)去污率逐漸增加，當(dāng)TritonX-100濃度達(dá)到0.5%以上后，其去污率基本不變。

3 討論

優(yōu)化產(chǎn)脂肪酶菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件，得到更適于菌體產(chǎn)酶的生長(zhǎng)條件，拓寬高洗滌活性脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域，對(duì)其工業(yè)化開(kāi)發(fā)具有重要的意義。施氏假單胞菌可利用多種碳源和氮源，其實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)產(chǎn)脂肪酶的最佳碳氮源分別為蔗糖和大豆蛋白胨。有機(jī)碳源蔗糖使脂肪酶達(dá)到最大產(chǎn)量為14.3 U/mL，有機(jī)氮源大豆蛋白胨能夠顯著的刺激脂肪酶達(dá)到最大酶活為18.7 U/mL。橄欖油為最佳誘導(dǎo)劑，使酶活達(dá)到21 U/mL。以橄欖油為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)脂肪酶菌株生產(chǎn)脂肪酶與許多相關(guān)報(bào)道一致［5，7］。通過(guò)Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)條件，使脂肪酶產(chǎn)量顯著提高。

在各種來(lái)源的微生物脂肪酶中，以細(xì)菌脂肪酶催化反應(yīng)的類(lèi)型最多、活性最高、穩(wěn)定性最好，其中又以假單胞菌屬（Pseudomonas）脂肪酶的性能最為優(yōu)越［8］。大多數(shù)細(xì)菌脂肪酶最適作用溫度和pH范圍分別為35-45℃和8.0-9.0［9］，而低溫堿性脂肪酶在pH8.0-10.5，溫度 10-35℃的范圍內(nèi)有高催化活性［10］。例如，產(chǎn)自Yarrowia lipolytica NCIM 3639的脂肪酶最適溫度為25℃；Acinetobacter sp. strain no 6脂肪酶最適溫度為20℃；Areomonas sp. LPB 4脂肪酶最適溫度為10℃。本研究報(bào)道的Pseudomonas stutzeri PS59脂肪酶在低溫20℃或更低的溫度下能夠保持較高酶活，在25℃具最佳洗滌性能，并且pH對(duì)其洗滌效果影響不大，說(shuō)明該酶具有較寬的pH穩(wěn)定性。此外，該脂肪酶在一定時(shí)間內(nèi)可以穩(wěn)定存在于多種離子型和非離子型表面活性劑溶液中，具備了工業(yè)用酶的條件。

4 結(jié)論

施氏假單胞菌PS59搖瓶發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基組成（g/mL）及條件如下：大豆蛋白胨22.39，蔗糖10，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.05，橄欖油8.1，初始pH8.1，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間36 h，接種量為2%。優(yōu)化后脂肪酶產(chǎn)量為36.12 U/mL，相對(duì)于起始培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，產(chǎn)量提高了1.3倍。經(jīng)洗滌性能評(píng)估，確定最佳加酶量為100 U，最佳洗滌溫度為25℃，最佳洗滌時(shí)間為25 min，洗滌pH對(duì)該脂肪酶洗滌效果影響不大，SDS濃度為0.5%時(shí)達(dá)到最大去污率64.05%，TritonX-100濃度達(dá)到0.5%以上后，其去污率基本不變。在最佳洗滌條件下，加酶洗滌液的洗滌效率可以提高30%-40%。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Fermentation Conditions of Lipase-producing Pseudomonas stutzeri PS59 and Washing Performance of the Lipase

LIU Jin-hui1，2LI Xiao-lu2JIANG Yan1WANG Hai-kuan2
（1. Engineering Research Center for Waste Oil Recovery Technology and Equipment，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400060；2. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）

It is aimed to optimize the fermentation conditions and detergent performance of lipase-producing Pseudomonas stutzeri PS59. The single-factor experiments and response surface analysis were adopted to select the best carbon and nitrogen sources. The impacts of enzyme dosage，time，temperature，pH，and adding dose of surface active agent on lipase detergent performance was also primarily evaluated for determining the optimal value of each factor. The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources for producing lipase in laboratory culturing P. stutzeri for producing lipase were sucrose and soybean peptone. The optimal fermentation medium formula（g/L）were：soy peptone 22.39 g，sucrose10 g，K2HPO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.5g，anhydrous CaCl20.05 g，olive oil 8.1 g，pH 8.1，temperature 30℃，and fermentation time 36 h，the average enzyme yield reached 36.12±1.32 U/mL，comparing with the original yield 15.65±4.81 U/mL，it increased by 1.3 times. To achieve the best washing effect，the optimal enzyme dosage was 100 U，the optimal washing time and temperature were 25 min and 25℃，respectively. Washing pH had little effect on the detergent performance. Under the optimal washing conditions，the washing performance while adding enzyme improved by 30%-40%.

Pseudomonas stutzeri；lipase；optimization of fermentation conditions；optimization of washing performance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.027

2015-10-13

教育部平臺(tái)科技資助項(xiàng)目（fykf201514）

劉金輝，女，碩士，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：18702279956@163.com

姜巖，男，教授，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)，E-mail：yanjiang88@126.com；王海寬，男，教授，研究方向：應(yīng)用微生物，E-mail：hkwang@aliyun.com