韋蘭膠合成菌的原生質(zhì)體制備與再生研究

周明明李曉雁任夢楠程珂萌黃海東

（1. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

韋蘭膠合成菌的原生質(zhì)體制備與再生研究

周明明1李曉雁2任夢楠1程珂萌1黃海東1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

旨在研究EDTA預(yù)處理、菌齡、酶解濃度、酶解溫度及酶解時(shí)間對Sphingomonas sp. ATCC 31555原生質(zhì)體制備與再生的影響。結(jié)果表明，菌齡10 h，12 mmol/L EDTA預(yù)處理，溶菌酶濃度45 μg/mL、酶解溫度28℃、酶解時(shí)間25 min。得到原生質(zhì)體的形成率達(dá)97.3%，再生率達(dá)33.9%。研究結(jié)果為菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合、基因組改組等選育優(yōu)良菌種提供參考。

鞘氨醇單胞菌；韋蘭膠；原生質(zhì)體；再生

微生物多糖安全無毒、理化性質(zhì)優(yōu)良，在食品、醫(yī)藥、材料等許多工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，比動(dòng)物多糖、植物多糖具有更為廣泛的應(yīng)用前景［1］。鞘氨醇膠是鞘氨醇單胞菌屬菌株合成的一類微生物多糖的統(tǒng)稱，其多糖主鏈結(jié)構(gòu)相似，側(cè)鏈基團(tuán)種類多樣［2］。韋蘭膠是由Sphingomonas sp. ATCC 31555發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖，是繼黃原膠和結(jié)冷膠之后最具市場前景的微生物膠之一。韋蘭膠的主鏈由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖的四糖重復(fù)單元組成，側(cè)鏈由單鏈的L-甘露糖或單鏈的L-鼠李糖構(gòu)成［3］。韋蘭膠溶液具有獨(dú)特的剪切稀釋性能，以及增稠性、懸浮性和乳化性［4］，在石油開采、水泥及混凝土制品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，并具備在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用的潛力［5］。

目前韋蘭膠的工業(yè)化生產(chǎn)仍存在一些問題，其碳源轉(zhuǎn)化率僅有40%-50%、產(chǎn)量只有15-20 g/L，與黃原膠等微生物膠的發(fā)酵生產(chǎn)相比，韋蘭膠的碳源轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量都較低，生產(chǎn)成本較高［6］，為解決此問題，研究者在培養(yǎng)基和發(fā)酵調(diào)控方面進(jìn)行了大量研究，使韋蘭膠的發(fā)酵產(chǎn)量得到不同程度的提高［7，8］。但韋蘭膠合成菌原生質(zhì)體制備與再生條件的研究還未見報(bào)道，本研究以韋蘭膠合成菌Sphingomonas sp. ATCC 31555為出發(fā)菌株，對影響菌株原生質(zhì)體制備與再生的因素進(jìn)行了研究，以期獲得生產(chǎn)成本低及產(chǎn)量提高的目的菌株，為利用原生質(zhì)體融合及基因組改組等選育更為優(yōu)良的菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 韋蘭膠產(chǎn)生菌（Sphingomonas sp.）ATCC 31555。

1.1.2 試劑 磷酸緩沖液：0.1 mol/L磷酸氫二鈉，0.1 mol/L磷酸二氫鈉 pH7.0；高滲緩沖液：0.1 mol/L磷酸氫二鈉，0.1 mol/L磷酸二氫鈉，0.8 mol/L甘露醇 pH7.0；原生質(zhì)體穩(wěn)定液（SMM）：0.5 mol/L蔗糖，20 mol/L MgCl2，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH6.5；溶菌酶：用SMM溶液配制，終濃度0.5 mg/mL，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。酚藏花紅染色劑（Sigma）。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖15.0，蛋白胨5.0，牛肉膏3.0，酵母膏3.0，瓊脂粉15.0，pH7.0。液體培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖15.0，蛋白胨2.5，磷酸氫二鉀2.5，磷酸氫二銨1.5，硫酸鎂0.1，酵母粉1.5，pH7.0。補(bǔ)充基本培養(yǎng)基（BNK）（%）：蔗糖18.1，蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，瓊脂粉2.0，pH7.0。再生補(bǔ)充培養(yǎng)基（BZNK）（%）：BNK配方中瓊脂改為0.8。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 取-70℃保藏的菌種Sphingomonas sp. ATCC 31555，在無菌操作條件下將其劃線到固體平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)72 h，挑取單菌落在試管斜面上蛇形劃線，30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.2 菌株發(fā)酵曲線的測定 在無菌操作條件下，用5 mL無菌水將試管斜面上的菌體沖洗下來，按10%的接種量將其接種到含有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，定時(shí)取樣，并測定發(fā)酵液的pH、菌數(shù)、黏度和韋蘭膠的產(chǎn)物量。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555液體培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，取適量菌液在8 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，用磷酸緩沖液洗滌菌體細(xì)胞。將菌體懸浮于適量的SMM緩沖液中，使溶液中細(xì)胞濃度約含108-109CFU/mL。取菌液0.1 mL，用無菌水倍比稀釋，涂布平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 d后得菌落數(shù)A（菌落總數(shù)）。在剩余的菌懸液中加入溶菌酶，混合均勻后于37℃保溫一定時(shí)間，4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，取菌液0.1 mL，用無菌水倍比稀釋，進(jìn)行剩余菌數(shù)B（未被酶裂解的剩余細(xì)胞）的測定。

1.2.4 原生質(zhì)體的再生 取0.1 mL酶解后的原生質(zhì)體懸液，用SMM緩沖液倍比稀釋，取1 mL加入底層BNK補(bǔ)充培養(yǎng)基的中央，再倒入上層BZNK培養(yǎng)基，混勻，30℃培養(yǎng)4-5 d后計(jì)數(shù)，將菌落數(shù)計(jì)為C（再生菌落數(shù)）。原生質(zhì)體形成率與再生率的計(jì)算公式：原生質(zhì)體形成率（%）=（A-B）/A×100%，原生質(zhì)體再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%。

1.2.5 菌體與原生質(zhì)體的熒光顯微鏡觀察 用SMM溶液作溶劑配制0.01%的酚藏花紅染色劑［9］。將菌懸液和制備好的原生質(zhì)體溶液分別與酚藏花紅染色劑按1∶1的比例進(jìn)行染色，然后取少量滴于載玻片上，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的發(fā)酵曲線

對菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555進(jìn)行72 h的搖瓶發(fā)酵，其間進(jìn)行pH、黏度、菌數(shù)和韋蘭膠產(chǎn)物量的測定。細(xì)胞生長曲線（圖1）顯示，菌株在培養(yǎng)5 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，58 h進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)菌數(shù)達(dá)9.5×109CFU/mL；韋蘭膠產(chǎn)物量曲線與細(xì)胞生長曲線近乎平行，在58 h時(shí)達(dá)到韋蘭膠產(chǎn)量最高；發(fā)酵液的pH在6-7之間小范圍波動(dòng)，因韋蘭膠屬于酸性多糖，且使用高碳氮比培養(yǎng)基，發(fā)酵期間pH總體呈降低趨勢，發(fā)酵67 h時(shí)pH最低為6.31；發(fā)酵液的黏度在對數(shù)生長期的后期迅速增加，在67 h達(dá)到最大值。由于菌株合成產(chǎn)物后，細(xì)胞外包裹高分子多糖不利于原生質(zhì)體的制備，選擇黏度較低的10 h菌齡發(fā)酵液進(jìn)行原生質(zhì)體制備的研究。

2.2 原生質(zhì)體的制備與再生

2.2.1 EDTA預(yù)處理對原生質(zhì)體制備與再生的影響 本研究對不同濃度梯度的EDTA對菌體進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果（圖2）顯示，原生質(zhì)體的形成率隨著EDTA濃度的增大而增大，再生率則在12 mmol/L之前呈上升趨勢，之后呈下降趨勢。隨著EDTA濃度的增大，菌體細(xì)胞壁的破壞程度越來越大，酶的作用增強(qiáng)，形成率和再生率上升，再生率在EDTA濃度為12 mmol/L之后下降。以原生質(zhì)體形成率與再生率乘積作為判別標(biāo)準(zhǔn)［10］，選擇EDTA濃度為12 mmol/L作為原生質(zhì)體制備與再生的最佳濃度。

圖1 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的發(fā)酵曲線

圖2 EDTA濃度對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

2.2.2 青霉素預(yù)處理對原生質(zhì)體制備與再生的影響 本實(shí)驗(yàn)在菌體培養(yǎng)10 h時(shí)，加入0-100 μg/mL濃度梯度的青霉素繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入EDTA預(yù)處理和溶菌酶進(jìn)行作用，觀察青霉素預(yù)處理對原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果如圖3所示。菌株原生質(zhì)體的形成率呈下降趨勢，青霉素對再生率的影響比較明顯，在青霉素濃度為10 μg/mL之后，原生質(zhì)體再生率急劇下降，原因是隨著青霉素濃度的增大，抑制了菌體的正常生長，細(xì)胞數(shù)量下降，再加上酶對原生質(zhì)體的傷害，使得原生質(zhì)體的形成率和和再生率都降低。綜合考慮原生質(zhì)體的形成率與再生率，選擇不加青霉素作為菌株原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。

圖3 青霉素濃度對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

2.2.3 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體制備與再生的影響 對5-245 μg/mL之間濃度梯度的溶菌酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖4）顯示，隨著酶濃度的增加，原生質(zhì)體形成率逐漸增大，再生率在酶濃度為45 μg/mL時(shí)值最大，為31.1%，之后迅速下降。依據(jù)原生質(zhì)體形成率與再生率乘積最大原則［10］，選擇酶濃度為45 μg/mL作為原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。

圖4 酶濃度對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

2.2.4 酶解溫度對原生質(zhì)體制備與再生的影響 本研究在不同的酶解溫度下進(jìn)行了原生質(zhì)體制備與再生實(shí)驗(yàn)［11］，結(jié)果如圖5所示。隨著溫度的升高，原生質(zhì)體的形成率一直上升，原因是隨著溫度的升高，酶的活性增強(qiáng)。再生率則相反，呈下降趨勢，一方面是因?yàn)槊冈谧饔眠^程中，不僅酶解了細(xì)胞壁，還對早期形成的原生質(zhì)體膜造成了損傷，另一方面是因?yàn)榫w的最適培養(yǎng)溫度為30℃，溫度升高使原生質(zhì)體的活性降低，導(dǎo)致其破壞甚至死亡，因而再生率較低［12］。綜合考慮，選擇酶解溫度為28℃作為原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。

圖5 酶解溫度對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

2.2.5 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體制備與再生的影響 對不同的酶解時(shí)間進(jìn)行研究，結(jié)果（圖6）顯示，酶解時(shí)間在25 min之前，原生質(zhì)體的形成率上升較快，之后增長緩慢，再生率則一直處于下降趨勢。原因是隨著酶解時(shí)間的延長，在25 min時(shí)原生質(zhì)體基本釋放完全，再延長酶解時(shí)間，原生質(zhì)體形成率也不會(huì)大幅度增加。由于酶解時(shí)間過長，細(xì)胞脫壁太徹底，使細(xì)胞失去再生的引物，且雜酶的損害程度也增強(qiáng)［13］，因而再生率下降。綜合考慮，選擇酶解時(shí)間為25 min作為原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。

圖6 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

2.3 原生質(zhì)體制備條件的驗(yàn)證

在最佳條件下，菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長前期10 h，12 mmol/L EDTA預(yù)處理，溶菌酶濃度45 μg/mL，酶解溫度28℃，酶解時(shí)間25 min的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，原生質(zhì)體形成率達(dá)97.3%，再生率達(dá)33.9%。菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555及其原生質(zhì)體經(jīng)酚藏花紅染色后，在熒光顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。由圖7可以看出菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的細(xì)胞為桿狀，兩端略窄，大小為（0.5-0.7）μm×（1.0-1.7）μm。其原生質(zhì)體大多數(shù)菌體呈類球狀，直徑0.6-0.9 μm，實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)的制備。

圖7 韋蘭膠合成菌的細(xì)胞（A）及其原生質(zhì)體（B）形態(tài)（1 000×）

3 討論

本研究用酶法去除菌株細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體的形成與再生過程中，要獲得較高的原生質(zhì)體形成率與再生率，應(yīng)綜合考慮各個(gè)影響因素［14］。微生物的生理狀態(tài)對原生質(zhì)體的形成非常重要，對數(shù)生長期的細(xì)胞生長比較旺盛，活力較強(qiáng)，酶解易于釋放原生質(zhì)體［15］，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，胞外多糖產(chǎn)物會(huì)阻擋酶對實(shí)驗(yàn)菌株的作用，因此選擇對數(shù)生長期初期作為原生質(zhì)體制備的最佳菌齡。原生質(zhì)體制備時(shí)，溶菌酶作用于細(xì)胞壁肽聚糖主鏈的β-1，4-糖苷鍵上，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)［16］，但革蘭氏陰性菌的原生質(zhì)體制備更為復(fù)雜，陰性菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)外還有脂多糖層，會(huì)阻擋溶菌酶的作用，EDTA可以螯合Ca2+和Mg2+，使脂多糖解體，進(jìn)而暴露內(nèi)層的肽聚糖分子被溶菌酶所水解［17］，結(jié)果顯示EDTA有利于對實(shí)驗(yàn)菌株的酶解。青霉素可以與轉(zhuǎn)肽酶的活性中心結(jié)合，抑制肽橋的形成，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的交聯(lián)，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，有利于溶菌酶的作用［18］，但本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示青霉素影響菌株生長，降低了原生質(zhì)體形成率，因此不選擇使用青霉素進(jìn)行預(yù)處理。不同的微生物菌種細(xì)胞壁組分有差異，因而對酶的敏感性不同，不同廠家溶菌酶的活性差異以及實(shí)驗(yàn)菌株的生長溫度范圍，都會(huì)影響酶促反應(yīng)的條件，如酶濃度、酶解溫度及時(shí)間等，進(jìn)而影響原生質(zhì)體的形成率與再生率，因此，有必要對酶促反應(yīng)條件進(jìn)行研究。原生質(zhì)體制備時(shí)，隨著溶菌酶濃度的增加，酶與菌體的作用更加充分，所以原生質(zhì)體形成率上升，但過高的酶濃度，使溶菌酶中混有的雜酶（核糖核酸酶、過氧化物酶等）作用呈現(xiàn)，造成原生質(zhì)體的活力降低［19］。酶解時(shí)間過短，原生質(zhì)體釋放不充分；酶解時(shí)間過長，會(huì)使形成的原生質(zhì)體皺縮，且損害細(xì)胞質(zhì)膜或造成原生質(zhì)體破裂，導(dǎo)致再生率下降［20］。

4 結(jié)論

本研究通過對影響韋蘭膠合成菌Sphingomonas sp. ATCC 31555原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件：菌齡10 h，12 mmol/L EDTA預(yù)處理，溶菌酶濃度45 μg/mL、酶解溫度28℃、酶解時(shí)間25 min，在此條件下菌株原生質(zhì)體的形成率和再生率分別達(dá)到97.3%和33.9%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Conditions for Protoplast Preparation and Regeneration by Sphingomonas sp. ATCC 31555

ZHOU Ming-ming1LI Xiao-yan2REN Meng-nan1CHENG Ke-meng1HUANG Hai-dong1
（1. College of Agronomy and Resources & Environment，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384；2. College of Food Science and Biotechnology，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384）

The effects of EDTA pretreatment，cell age and the concentration，temperature and work time of enzymolysis on protoplast formation and regeneration by Sphingomonas sp. ATCC 31555 were studied. The results showed that the formation rate and regeneration rate reached 97.3% and 33.9% respectively，when the cells cultivated 10 h，pretreated by 12 mmol/L EDTA，using 45 μg/mL of lysozyme，enzymolysis at 28℃ for 25 min. The result of this paper provides a reference for breeding fine microbial strains by protoplast fusion and genome shuffling.

Sphingomonas；welan gum；protoplast；regeneration

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.019

2015-11-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571790）

周明明，女，碩士研究生，研究方向：微生物多糖；E-mail：zmmydx@126.com

黃海東，教授，研究方向：資源細(xì)菌及工程；E-mail：hhaidong@126.com