重組溶葡萄球菌酶成品蛋白含量測(cè)定方法的建立

許燕張宜濤葉貴子陸海榮黃青山

（1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)研究所，上海 200433；2. 昆山博青生物科技有限公司，昆山 215316）

重組溶葡萄球菌酶成品蛋白含量測(cè)定方法的建立

許燕1，2張宜濤2葉貴子2陸海榮1黃青山1，2

（1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)研究所，上海 200433；2. 昆山博青生物科技有限公司，昆山 215316）

重組溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin，rLysn）對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌活性，是一種新型抗菌藥物，含有該酶的藥用制劑在臨床上能有效控制金葡菌感染。為在rLysn成品中增加蛋白含量測(cè)定以控制制劑的質(zhì)量，建立了成品中rLysn蛋白含量測(cè)定方法，并進(jìn)行驗(yàn)證。采用體積排阻高效液相色譜法（size exclusion high performance liquid chromatograph，SEHPLC）測(cè)定rLysn理化對(duì)照品及成品蛋白質(zhì)含量。色譜柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm）；流動(dòng)相：20 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）+0.3 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。結(jié)果顯示，rLysn在2-32 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r2=1）；低、中、高3種濃度的rLysn理化對(duì)照品空白加標(biāo)平均回收率為102.9%，成品加標(biāo)平均回收率為102.1%；3種不同上樣量在不同時(shí)間內(nèi)測(cè)定，蛋白含量RSD＜1%；每隔1 h測(cè)定同一支供試品溶液，蛋白含量RSD為0.98%；同一批供試品溶液取6份進(jìn)樣，蛋白含量RSD為1.71%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用SE-HPLC方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性、精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性好，可用于rLysn成品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

重組溶葡萄球菌酶；蛋白質(zhì)含量；體積排阻高效液相色譜法

金黃色葡萄球菌是臨床最常見(jiàn)的化膿性球菌，是醫(yī)院交叉感染的主要來(lái)源［1-3］。金葡菌感染能誘發(fā)多種疾病，且容易引發(fā)大規(guī)模爆發(fā)性感染，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的多藥耐藥性和交叉耐藥性給臨床治療帶來(lái)極大的困難［4-11］。目前，以萬(wàn)古霉素為代表的糖肽類(lèi)抗生素是治療MRSA感染的首選用藥。但是，近年來(lái)，由于萬(wàn)古霉素的應(yīng)用增加，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素中介和耐藥的金葡菌（VISA和VRSA）［12-14］。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)與傳統(tǒng)抗生素作用模式不同的新型抗菌藥物。

溶葡萄球菌酶（lysostaphin，Lysn）是一種含Zn2+的金屬蛋白酶，具有肽鏈內(nèi)切酶活性［15］，能特異性地水解金葡菌細(xì)胞壁肽聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)甘氨酸五肽橋，從而產(chǎn)生破壁溶菌作用，具有極強(qiáng)的抗金葡菌活性［16-18］。體外條件下rLysn清除金葡菌的作用非?？?，在≥MIC水平（約0.03-0.125 μg/mL），對(duì)受試菌通常30 min 內(nèi)可殺滅90%以上，2-4 h可殺滅99.9%以上［19］。對(duì)MRSA也有同樣顯著的體外抗菌效果，并且優(yōu)于糖肽類(lèi)抗生素萬(wàn)古霉素［20-22］。Lysn對(duì)金葡菌具有的快速溶菌作用，使得其成為國(guó)內(nèi)外研發(fā)抗耐藥金葡菌感染的熱點(diǎn)［23-25］。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)將重組溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin，rLysn）研制成藥用制劑，用于治療皮膚創(chuàng)面金葡菌感染。

對(duì)rLysn成品中的蛋白含量測(cè)定，可以控制和評(píng)價(jià)rLysn成品的質(zhì)量。由于rLysn在制劑制備過(guò)程中加入了人血白蛋白作為保護(hù)劑，常規(guī)的蛋白含量測(cè)定方法不適合成品中蛋白含量的測(cè)定。目前采用的C18柱反相高效液相色譜法測(cè)定rLysn成品蛋白質(zhì)含量［26］，但該法的分離效果不好，且洗脫程序復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)采用體積排阻高效液相色譜法（size exclusion-high performance liquid chromatography，SEHPLC），測(cè)定rLysn成品中的蛋白含量，旨在高效分離rLysn和人血白蛋白，并簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，為提高rLysn成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品 rLysn理化對(duì)照品（蛋白含量為619 μg/支，批號(hào)：20120202）、rLysn成品（400 U/支，批號(hào)：20120801）、不含rLysn的空白制劑（安慰劑，批號(hào)：20120802），上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司制備。

1.1.2 主要試劑及儀器 Agilent 1260 HPLC色譜儀，美國(guó)Agilent公司；色譜柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm），日本Tosoh公司；NaCl，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4，分析純，國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 色譜條件 色譜柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm）；流動(dòng)相：20 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）含0.3 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 對(duì)照品溶液 將rLysn理化對(duì)照品用超純水溶解并稀釋制成1 mg/mL和1.6 mg/mL的溶液。

1.2.1.2 供試品溶液 取rLysn成品1支，用1 mL超純水溶解。

1.2.2 方法的驗(yàn)證

1.2.2.1 線性分析 取1 mg/mL理化對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、8、16和32 μL，按此進(jìn)樣量各重復(fù)進(jìn)樣2次，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，樣品峰面積（S）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r2）。

1.2.2.2 準(zhǔn)確性驗(yàn)證 取1.6 mg/mL理化對(duì)照品溶液將空白制劑和rLysn成品溶解并稀釋至理化對(duì)照品加標(biāo)終濃度分別為0、0.2、0.4和0.8 mg/mL，每一濃度上樣20 μL。計(jì)算加標(biāo)回收率。按照上述方法重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.2.3 精密度驗(yàn)證 用濃度為1 mg/mL的理化對(duì)照品溶液，采用體積法進(jìn)樣，分別進(jìn)樣4、8和16 μL，得到低、中、高3種進(jìn)樣量（4、8和16 μg）的峰面積。每一種進(jìn)樣量在不同工作日分別測(cè)定一次，計(jì)算每一種進(jìn)樣量的峰面積的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和RSD。

1.2.3 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，每次上樣20 μL，每小時(shí)進(jìn)樣1次，共6次，計(jì)算rLysn峰面積和RSD。

1.2.4 重復(fù)性 取同一批供試品溶液6份，分別進(jìn)樣1次，每次上樣20 μL，計(jì)算rLysn峰面積和RSD。

2 結(jié)果

2.1 SE-HPLC色譜分析

rLysn理化對(duì)照品及rLysn成品的SE-HPLC色譜圖（圖1）顯示，rLysn和人血白蛋白的分離度大于2.5，表明本色譜方法能夠滿足成品中各組分達(dá)到基線分離。

圖1 SE-HPLC色譜分析圖

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍 經(jīng)5次進(jìn)樣，計(jì)算峰面積，結(jié)果見(jiàn)下表1，得到的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為y=185.93x-2.0042，r2=1；y=189.46x-17.138，r2=1；y=188.49x-6.9125，r2=1。結(jié)果表明，rLysn在2-32 μg范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系（注：后續(xù)數(shù)據(jù)均由回歸方程Y=189.46x-17.138，r2=1得出）。

2.2.2 準(zhǔn)確性 空白制劑加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表2，3種濃度的加標(biāo)回收率在101.6%、103.8%和103.5%，平均回收率為102.9%，表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確性高。成品加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表3，3種濃度的加標(biāo)回收率分別為105.8%、98.7%和101.8%，平均回收率為102.1%，進(jìn)一步表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確性高。

表1 五種不同上樣量rLysn理化對(duì)照品的峰面積

2.2.3 精密度 3種不同上樣量的rLysn理化對(duì)照品，分別于不同試驗(yàn)日進(jìn)行精密度試驗(yàn)。數(shù)據(jù)取自3次標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4），RSD＜1%，表明該方法精密度高。

2.2.4 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，每小時(shí)進(jìn)樣1次，共6次，結(jié)果見(jiàn)表4，RSD為0.98%，表明樣品溶解后在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性 取同一批供試品溶液6份，分別進(jìn)樣1次，共6次，結(jié)果見(jiàn)表4，RSD為1.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 討論

rLysn對(duì)金葡菌具有良好的體外抗菌活性，且對(duì)甲氧西林敏感的金葡菌（MSSA）和MRSA有同樣顯著的抗菌效果。rLysn藥用制劑，能有效治療金葡菌感染，且不易產(chǎn)生耐藥性［27］。對(duì)rLysn制劑中主藥蛋白即rLysn含量進(jìn)行測(cè)定，能有效控制和評(píng)價(jià)制劑的質(zhì)量。

由于rLysn凍干粉制劑中含有人血白蛋白，為了確定成品中rLysn的蛋白質(zhì)含量，需要選用一種合適的方法，能夠?qū)Lysn與人血白蛋白有效分離，同時(shí)又能定量測(cè)定rLysn的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)兩者分子量大小差異，采用體積排阻高效液相色譜法，將成品中的rLysn與其它作為保護(hù)劑的蛋白成分按照分子量大小進(jìn)行分離。由于選擇體積排阻高效液相法，洗脫程序變得簡(jiǎn)化，我們選擇含氯化鈉的磷酸緩沖液作為流動(dòng)相。該方法在一定條件下，可以將rLysn和人血白蛋白有效分離，在2-32 μg上樣量范圍內(nèi)，rLysn理化對(duì)照品上樣量和峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2=1。因此，可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)成品中rLysn的峰面積計(jì)算出成品中rLysn的蛋白質(zhì)含量。

表2 三種濃度的空白制劑加標(biāo)回收率結(jié)果

表3 三種濃度的成品加標(biāo)回收率結(jié)果

表4 SE-HPLC法的精密性、穩(wěn)定性及重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

與RP-HPLC法相比，SE-HPLC法能更好的分離rLysn和人血白蛋白，該法的線性范圍2-32 μg比RP-HPLC法的5-30 μg范圍更寬，準(zhǔn)確性比RPHPLC法更好，精密度（RSD＜1%）遠(yuǎn)高于RP-HPLC法（RSD在3%-6%），且穩(wěn)定性良好。在rLysn成品蛋白質(zhì)含量測(cè)定上，SE-HPLC比RP-HPLC更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，更適合用于rLysn成品蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種測(cè)定rLysn成品蛋白質(zhì)含量的SE-HPLC法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。在該方法確定的測(cè)定條件下，可以將rLysn和人血白蛋白有效分離，并且以rLysn理化對(duì)照品作對(duì)照，在一定上樣量范圍內(nèi)，可以對(duì)樣品中的rLysn進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該方法可用于rLysn成品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，從而更好的控制和評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Establishment of A Method for Determination of Protein Content in the Final Product Containing Recombinant Lysostaphin

XU Yan1，2ZHANG Yi-tao2YE Gui-zi2LU Hai-rong1HUANG Qing-shan1，2
（1. Institute of Genetics，School of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200433；2. Kushan BioGreen Technology Co.，Ltd.，Kunshan 215316）

Recombinant lysostaphin（rLysn），duo to its solid antibacterial activity to Staphylococcal aureus，is novel antibacterial medicine，and therapeutic agent containing this enzyme may efficiently control the infection of S. aureus. In order to control the quality of pharmaceutical preparations with rLysn，a method of measuring the protein content in the final product with rLysn was established and verified. Size exclusion high performance liquid chromatograph（SE-HPLC）was employed to measure the protein content in both physico-chemical control and the final product with rLysn under the conditions as below：a TSK gel 2000SWXL column（7.8 mm×30 cm，5 μm），the mobile phase composed of phosphate buffer（20 mmol/L，pH7.0）and NaCl（0.3 mol/L），the flow rate was 0.5 mL/min，the temperature was 25℃，and the detection wave length was 280 nm. As results，the rLysn（within 2-32 μg）was linearly correlated with the area of the elution peak（r2=1）. The weighted average recovery rate for physico-chemical controls in 3 rLysn concentrations of low，medium and high was 102.9%，while the weighted average recovery rate was 102.1%. Three supernatants were measured at different time，and RSD of protein content ＜ 1%；while measurement was done for each supernatant in 1 h interval，RSD of the protein content was 0.98%；and 6 samples from one targeted solution were measured，RSD of the protein content was 1.71%. Above results reveal that SE-HPLC is simple and convenient，accurate，precise，stable and repeatable approach，thus may be used for the determination of protein content in the final product of rLysn.

recombinant lysostaphin；protein content；size exclusion high performance liquid chromatography

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.008

2015-11-10

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2008ZX09101-032），上海市博士后科研資助計(jì)劃（14R21421300）

許燕，女，碩士，研究方向：抗感染藥物；E-mail：xuyan131@163.com

陸海榮，男，博士，研究方向：抗感染藥物；E-mail：haironglu09@fudan.edu.cn

黃青山，男，博士，副教授，研究方向：抗感染和抗腫瘤藥物；E-mail：qshuang@fudan.edu.cn