高通量LAMP檢測常見腸道病原體的可行性分析

疏義林，張雪峰，萬　琴，謝進維 綜　述，張守德審校

(安陸市疾病預(yù)防控制中心，湖北孝感 432600)

·綜述·

高通量LAMP檢測常見腸道病原體的可行性分析

疏義林，張雪峰，萬琴，謝進維 綜述，張守德△審校

(安陸市疾病預(yù)防控制中心，湖北孝感 432600)

關(guān)鍵詞:病原體；LAMP；高通量；分子診斷；傳染性疾病

人類糞-口途徑傳播的病原體主要是病原菌和一些病毒，如志賀菌、沙門菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、彎曲桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、金黃色葡萄球菌、甲肝病毒、戊肝病毒、輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒等，它們會引起腸道疾病等。人體攜帶這些病原體，是嚴重危害公眾健康的重大問題，也是造成食品和水體污染的間接因素。每年我國發(fā)生由病原菌引起的食物中毒事件占食物中毒事件總數(shù)的30%～90%，中毒人數(shù)占食物中毒總?cè)藬?shù)的60%～90%，人們的身體健康受到嚴重危害[1]。目前病毒性肝炎被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為全球第9大引起死亡的疾病，在我國，病毒性肝炎發(fā)病數(shù)位居法定管理傳染病的第一位[2]。甲型和戊型肝炎病毒，主要通過糞-口途徑傳播，病毒隨糞便排出體外，通過污染水源、食物、食具等傳播途徑造成散發(fā)性流行或大流行。針對糞-口途徑傳播的病原體的快速檢測是預(yù)防和控制突發(fā)性腸道疾病關(guān)鍵措施，而目前對病原體檢測主要依靠病原體分離法、免疫方法和核酸擴增及其衍生技術(shù)方法，雖然病原體分離是金標準，但操作繁瑣費時；免疫方法敏感性高、操作簡單和快速，但易受到其他物質(zhì)干擾和抗體特異性差異的影響，從而會導(dǎo)致誤診或漏診；PCR及其衍生技術(shù)方法檢測快速、敏感性高和特異性強，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于一些病原體的檢測，但由于需要特殊儀器設(shè)備且操作復(fù)雜，導(dǎo)致其不容易在基層單位實驗室推廣應(yīng)用于病原體檢測。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，不斷產(chǎn)生新的核酸擴增技術(shù)。近年來，一種新的恒溫核酸擴增技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)已被開發(fā)應(yīng)用，該技術(shù)操作簡單、特異性強、靈敏度高、耐受性強，已在病原體快速檢測中得到廣泛應(yīng)用[3-14]，有望解決突發(fā)性腸道疾病的相關(guān)病原體的快速檢測的基層應(yīng)用難題。結(jié)合本單位正在開展的LAMP技術(shù)檢測甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等病原體的相關(guān)研究，對LAMP技術(shù)進行介紹和其高通量檢測12種常見腸道病原體的可行性分析。

1LAMP技術(shù)簡介

1.1LAMP技術(shù)原理LAMP技術(shù)是2000年Notomi等[15]人發(fā)明的恒溫核酸擴增方法。原理是根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計的一對外引物和一對內(nèi)引物特異性識別目標序列上的6個相應(yīng)區(qū)域，在Bst聚合酶的作用下進行自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在60～65 ℃恒溫內(nèi)，60 min內(nèi)大量擴增目標DNA片段，可達到109copies以上，同時伴隨副產(chǎn)物白色焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生。目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為普通LAMP、RT-LAMP、實時濁度定量LAMP等。

1.2LAMP技術(shù)引物設(shè)計LAMP擴增引物包含F(xiàn)3、B3、FIP和BIP引物，能結(jié)合目的序列6個不同區(qū)域。上游外部引物F3與目的序列F3c 區(qū)域互補，下游外部引物B3與目的序列B3c區(qū)域互補。上游內(nèi)部引物FIP，由F2序列和F1c 序列，中間有TTTT連接組成，F(xiàn)2序列與目的序列3′端的F2c 區(qū)域互補，F(xiàn)1c 序列與目的序列5′端的Flc 區(qū)域序列相同。下游內(nèi)部引物BIP，由B2 序列和B1c 序列，中間有TTTT連接組成，B2 序列與目的序列3′端的B2c 區(qū)域互補，B1c 區(qū)域與目的序列5′端的Blc 區(qū)域序列相同。引物設(shè)計示意圖如圖1。Loop 引物(Loop F，Loop B)是有助于提高靈敏度，縮短反應(yīng)時間的引物[16]。LAMP技術(shù)的關(guān)鍵就是引物的設(shè)計。應(yīng)用在線LAMP 引物設(shè)計軟件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e)設(shè)計引物序列，結(jié)合DNAstar 的MegAlign 和Olig6.0對引物分析，避免引物二聚體等產(chǎn)生，再將設(shè)計好的引物，在Gene Bank中進行比對，進一步驗證引物的特異性。LAMP 引物設(shè)計一般選取一段長約130～300 bp的保守序列作為靶序列。一般引物間距要求：F2的5′端到B2的5′端的距離，最好控制在120～180 bp；F2的前端和F3引物之間以及B2 的前端與B3 引物之間的距離應(yīng)該在0～20 bp；F2與F1距離和B2 與B1距離保持在40～60 bp。引物的Tm值要求：Tm 主要由模板的GC含量決定，通常Tm 值為60～65 ℃，富含AT區(qū)域Tm 值為55～60 ℃，同時引物Tm值應(yīng)該滿足F2>60 ℃，B2<65 ℃，F(xiàn)3和B3

1.3LAMP反應(yīng)體系及擴增結(jié)果鑒別方法LAMP 反應(yīng)體系包含了模板DNA、dNTP、Bst DNA聚合酶甜菜堿、緩沖液、引物、Mg2+和ddH2O。通常用25 μL反應(yīng)體系：模板DNA 1～4 μL，F(xiàn)IP、BIP、F3、B3各0.2～2.0 μmol/L，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L) 3.5 μL，Betaine(5 mol/L) 5 μL，MgSO4(250 mmol/L) 0.3～0.8 μL，Bst DNA Polymerase (8 U/μL)1 μL，補ddH2O至25 μL，混合后在60～65 ℃保溫15～60 min，然后80 ℃以上加熱2 min 讓Bst DNA聚合酶熱失活，反應(yīng)終止，或者冰浴終止反應(yīng)。RT-LAMP反應(yīng)體系(25 μL):RNA模板3～5 μL、FIP、BIP、F3、B3各0.2～2.0 μmol/L，dNTP Mixture(10 mmol/L) 3.5 μL，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，MgSO4(250 mmol/L)0.3～0.8 μL，Betaine(5 mol/L)5.0 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL) 0.5 μL，Bst DNA Polymerase (8 U/μL)1 μL，補ddH2O至25 μL。產(chǎn)物鑒別方法有瓊脂糖電泳，觀察梯度條帶；在擴增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ，反應(yīng)結(jié)果變成綠色說明有擴增產(chǎn)物生成，沒有變色說明無擴增產(chǎn)物生成，注意，在起始反應(yīng)液中加SYBR Green Ⅰ，會影響到擴增效率；在反應(yīng)體系中加入HNB，反應(yīng)結(jié)果變藍色說明有擴增產(chǎn)物，紫色說明無擴增產(chǎn)物；在反應(yīng)體系中加入一種發(fā)熒光的螯合劑(鈣黃綠素)，根據(jù)有無綠色熒光，肉眼判斷擴增結(jié)果；通過對LAMP擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀是否形成來判斷有無擴增，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的焦磷酸鎂白色沉淀形成濁度已經(jīng)開發(fā)出一種實時濁度檢測儀，可以用于定量分析。加HNB、鈣黃綠素和觀察濁度方法判斷都可以避免開蓋子檢測。

圖1　　LAMP 引物設(shè)計示意圖

2高通量LAMP技術(shù)檢測常見腸道病原體的可行性

沙門菌通過標記invA 基因[5]，已經(jīng)成功鑒別，而且榮研生物科技(中國)有限公司已經(jīng)推出專門檢測沙門菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法試劑盒。通過LAMP或RT-LAMP擴增志賀菌ipaH基因[17]，彎曲桿菌旋轉(zhuǎn)酶基因(gyrA)[7]，大腸桿菌O157:H7菌rfbE基因[3]，霍亂弧菌溶血素基因(hlyA)[4]，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ail基因[18]，金黃色葡萄球菌muc基因[19]，輪狀病毒VP7基因[20]，Ⅱ型諾如病毒RNA聚合酶基因[6]，星狀病毒HAstV-2基因[21]，已經(jīng)成功達到鑒別目的。目前關(guān)于甲肝病毒、戊肝病毒有關(guān)RT-LAMP技術(shù)檢測報道還沒有，但關(guān)于甲肝病毒、戊肝病毒分子檢測報道有很多，如RT-PCR[22-23]、熒光定量RT-PCR[24-25]。對甲肝病毒基因組和報道的PCR技術(shù)擴增片段分析得知VP1/VP3衣殼蛋白基因的連接區(qū)和編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)的3D非結(jié)構(gòu)蛋白基因，它們都具有高度特異性。對戊肝病毒基因組分析得知除ORF1的1 500～3 000堿基有變異外，其他部分特異性和保守性較強，尤其ORF2序列占全部GeneBank序列一半以上，ORF15′端的甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)和ORF13′端的RNA依賴的RNA聚合酶區(qū)(RdRP)也比較多。選取甲肝病毒和戊肝病毒特異性保守基因，經(jīng)Primer Explorer V4軟件設(shè)計出多套用于LAMP擴增的引物，經(jīng)Primer5.0和Olig6.0綜合分析選出幾對基本符合LAMP引物設(shè)計要求的引物，將設(shè)計好的引物，在Gene Bank中進行比對，保證其特異性。這些引物已經(jīng)進行初步群體擴增試驗篩選，已經(jīng)初步篩選出2組較為理想的引物組，后期將進一步對反應(yīng)體系優(yōu)化以及對引物調(diào)整和修飾，篩選出最理想引物組和反應(yīng)體系，最后用熒光定量RT-PCR、測序和酶聯(lián)方法對其敏感性和特異性進行評估。在同一個水浴鍋或者其他恒溫控制設(shè)備中實現(xiàn)12種病原體高通量LAMP擴增檢測，就必須考慮到不同病原體LAMP引物組的Tm值要相近，以便在相同溫度下得到高效率擴增。這12種病原體的引物的Tm通過Nearest Neighor法計算發(fā)現(xiàn)基本相近，根據(jù)文獻報道和初步試驗發(fā)現(xiàn)12種病原體的標記序列在61～65 ℃都可以有效擴增，建議選擇63 ℃進行高通量擴增。在防止污染方面：采用在起始反應(yīng)體系中加入HNB或鈣黃綠素，避免開蓋子檢測；為進一步防止氣溶膠，在反應(yīng)液表面滴加礦物油封住液面；為避免上一次擴增產(chǎn)物的污染，可以用dUTP替代dATP，加UGN酶處理反應(yīng)液后，再進行擴增反應(yīng)。

3小結(jié)與展望

LAMP技術(shù)特點:(1)高效性，在恒溫條件下，15～60 min即可完成擴增反應(yīng)。(2)靈敏性高，比常規(guī)PCR高出1～2個數(shù)量級，能滿足低拷貝數(shù)樣品的檢測，擴增產(chǎn)物靶序列可達到109以上拷貝。(3)特異性非常高，4條特異性引物與目的序列6個區(qū)域中任何區(qū)域不匹配都不能進行核酸擴增。(4)操作簡單，肉眼直接就可以觀察到擴增結(jié)果。(5) 耐受性較高，主要因為Bst DNA聚合酶的耐受性很好，再加上反應(yīng)緩沖液中的甜菜堿的作用，使LAMP耐受性高于常規(guī)PCR很多，因此樣本中一些異物對LAMP反應(yīng)影響較小，擴增時不需要對樣本進行純化[12]。(6)不需特殊儀器設(shè)備，一臺恒溫水浴鍋或者其他恒溫控制設(shè)備即可，適合大規(guī)模篩查、現(xiàn)場診斷和基層單位實驗室病原體或疾病檢測。但也存在缺點:(1)擴增產(chǎn)物容易產(chǎn)生氣溶膠污染，會造成假陽性。目前已經(jīng)采用加HNB、鈣黃綠素和觀察濁度等方法避免開蓋子檢測產(chǎn)生氣溶膠污染，在反應(yīng)液上加封閉液進一步防止氣溶膠擴散出來污染實驗室，采用dUTP替代dATP，加UGN酶處理反應(yīng)液后，再進行擴增反應(yīng)，防止上一次擴增產(chǎn)物的污染。(2)引物設(shè)計要求比較高，有些基因序列可能不適合使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法。

隨著LAMP技術(shù)、分子標記研究深入和不斷推廣，相關(guān)行業(yè)已經(jīng)制定LAMP技術(shù)的檢測行業(yè)標準。不同款式的LAMP擴增儀的推出使LAMP技術(shù)的推廣更加迅速。為了使LAMP技術(shù)能更好的運用于基層臨床診斷、現(xiàn)場檢測和即時檢測，必須在擴增穩(wěn)定性、縮短擴增時間、定量和找到更簡便防止擴增產(chǎn)物污染的檢測方法方面努力。憑借敏感性高、特異性強、耐受性強、操作簡單、檢測結(jié)果易判定、成本低廉、適合高通量擴增等優(yōu)點，LAMP將成為核酸擴增領(lǐng)域的重要技術(shù)方法，尤其在病原體快速高通量檢測方面有著推廣價值。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.034

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1385-03

(收稿日期：2015-12-16)